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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):219-225
近年来，重组 DNA技术的快速发展和蛋白质表
达系统的多样性为利用微生物大规模生产蛋白质药
物开辟了广阔的空间。但是，重组蛋白的高表达常
常导致其在胞内发生错误折叠和聚集，形成包涵体
收稿日期： 2015-08-02
基金项目：国家科技部新药创制重大专项项目（2013ZX09103003-003）
作者简介：黄演婷，女，硕士 , 研究方向：药用生物活性物质结构、功能与应用；E-mail ：olive1987@aliyun.com
通讯作者：朱家勇，男，教授，博士生导师，研究方向：药用生物活性物质结构、功能与应用；E-mail ：zhujy@gdpu.edu.cn
重组融合蛋白 Trx-IFN-CSP 复性工艺研究
黄演婷1，2，3  卢雪梅2，3  杨小蓉1  金小宝2，3  朱家勇2，3
（1. 广东药学院附属第一医院，广州  510006 ；2. 广东药学院基础学院药用生物活性物质研究所，广州  510006 ；3. 广东省生物活性药物研究
重点实验室，广州  510006）
摘 要 ： 旨在建立并优化融合蛋白 Trx-IFN-CSP 的复性工艺。对重组融合 Trx-IFN-CSP 进行体外复性研究，考查 pH、温度、
蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示，适合 Trx-IFN-CSP 复性的方法为，反
复冻融联合超声破菌获得包涵体 ；用含有 1% TritonX-100、2 mol/L 尿素、2% DOC 洗涤液初步纯化包涵体 ；再用 6 mol/L 盐酸胍溶
解液变性包涵体 ；脉冲加样稀释变性液后 4℃条件下梯度透析复性，使用 L-Arg 辅助复性。经肠激酶切去 Trx 标签后，每升发酵液
最终获得 110-130 mg 肝靶向干扰素，每批蛋白纯度都在 95% 以上，比活性在 1.9-2.4×108 U/mg 之间，制备工艺稳定。
关键词 ： 融合蛋白 ；肝靶向干扰素 ；包涵体 ；脉冲稀释 ；梯度透析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.032
Renaturation Technology of Recombinant Fusion Protein
Trx-IFN-CSP
HUANG Yan-ting1，2，3  LU Xue-mei2，3  YANG Xiao-rong1  JIN Xiao-bao2，3  ZHU Jia-yong2，3
（1. The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006 ；2. Institution of Pharmaceutical Bioactive
Substances，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006 ；3.Guangdong Key Laboratory of
Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006）
Abstract:  This work  is  to establish and optimize  the method of refolding  fusion protein Trx-IFN-CSP. The refolding of  recombinant 
protein in vitro was studied，i.e.，investigating the effects of pH，temperature，protein concentration，redox systems and auxiliary refolding 
molecules on the refolding process of fusion protein. The results were as below. The proper measure to refold the Trx-IFN-CSP was to obtain the 
inclusion bodies by repeated combined freeze-thaw with ultrasonic to crack bacteria. The inclusion bodies were preliminarily purified using scrub 
solution of 1％ TritonX-100，2 mol/L urea，and 2% DOC，and then denatured in 6 mol/L guanidine hydrochloride. After the pulse dilution，
the renaturation was conducted under 4℃ by gradient dialysis with  the assistance of L-Arg. After  the Trx-tag was removed by recombinant 
enterokinase digestion，approximately 110-130 mg of  the pure recombinant liver-targeted interferon was obtained from 1 L Escherichia coli 
culture. Each batch of protein had a purity of over 95% and antibacterial activities were about 1.9-2.4×108 U/mg，thus the technology of 
preparation was stable.
Key words:  fusion protein ；liver-targeted interferon ；inclusion body ；pulse dilution ；gradient dialysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6220
（Inclusoin bdoy）。目前，包涵体的形成机制仍不清 
楚，但一般认为包涵体是由部分折叠的中间态之间
疏水性相互作用形成的，是蛋白质过量表达的结果，
而与其相对分子质量、疏水性以及折叠途径等内在
性质没有必然的联系［1］。即对于任何蛋白质和任何
表达系统来说，在过量表达的情况下都可能形成包
涵体。包涵体表达量高且一级结构正确，经过变复
性即可恢复蛋白生物活性，因此许多蛋白质药物的
生产依赖于蛋白质复性技术的提高。
1961 年，Anfinsen［2］在研究 RNaseA 中发现蛋
白质多肽链的折叠是一个自发的过程，主要决定于
它的氨基酸序列，这也被称为生物体内的第二套遗
传密码。目前，虽然仍无法明确解释蛋白质如何从
伸展态转变为具有生理活性的天然态。但普遍认为，
分子间疏水作用是导致蛋白质聚集、变性蛋白复性
收率降低的主要原因。随着对蛋白质折叠机理的深
入研究发现，暴露在变性蛋白表面的疏水基团既有
通过分子内疏水作用逐步折叠为天然态蛋白质的趋
势，也有通过分子间相互作用形成二聚体、三聚体
等无活性沉淀的趋势。蛋白质的分子间疏水基团各
不相同，所以没有任何一种复性方法能复性所有的
蛋白。对于某一特定蛋白的复性最佳方案，需要经
过具体实验研究确定。探讨各种复性方法及相关因
素，有助于寻找到最适宜的复性方案，对蛋白药物
的开发生产具有重要指导意义。
Trx-IFN-CSP 是本实验室通过基因工程方法构
建的重组融合蛋白，初步研究证实具备了 CSP I-plus
高效而特异的肝细胞靶向性与 IFN 的抗 HBV 作用。
本研究在前期基础上旨在筛选出一套适合 Trx-IFN-
CSP 复性的方法，采用反复冻融联合超声破菌收集
包涵体，经过洗涤后选用盐酸胍溶解变性；考查
pH、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小
分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响，并验证
优化得出的制备工艺的稳定性，旨在为获得一套稳
定的肝靶向干扰素制备工艺和足够肝靶向干扰素开
展后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  菌株  含 Trx-IFN-CSP 基因的重组菌株 E.coli 
BL21/pET32a-IFN-CSP，系本课题组构建。
1.1.2  主要试剂  蛋白预染 Marker 购自 Fermentas
生物公司；DTT、GSSG、GSH、DOC 购自 Sigma 公司；
其余常用试剂均为国产分析纯。
1.1.3  主要溶液  （1）细菌裂解液：30% 蔗糖、1 
mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。（2）
IBs 洗涤液：10 mmol/L EDTA、1% Triton X-100、2 
mmol/L 尿 素、2% DOC、50 mmol/LTris-HCl。（3）
IBs 溶解液：6 mol/L 盐酸胍、5 mmol/L EDTA、2.5 
mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl。（4）IBs 稀释液：
2 mol/L 盐酸胍、0.1 mol/L 精氨酸、2 mmol/L GSH、
0.2 mmol/L GSSG、5% 甘 油、50 mmol/L Tris-HCl。
（5）透析外液 A：1.5 mol/L 盐酸胍、0.1 mol/L 精氨
酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG、5%甘油、50 
mmol/L Tris-HCl。（6）透析外液 B：1.0 mol/L 盐酸胍、
0.05 mol/L 精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/LGSSG、
3%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（7）透析外液 C：0.5 
mol/L 盐酸胍、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、3%
甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（8）透析外液 D：1%甘
油、50 mmol/L Tris-HCl。
1.2  方法
1.2.1  包涵体的释放  发酵液经 6 000 r/min 离心 10 
min 后，弃上清收集菌沉，用 0.1 倍体积的 4℃预冷
的细菌裂解液重悬菌沉，-20℃结冻过夜后，37℃水
浴冻融细胞，冰浴条件下使用超声细胞破碎仪破碎
30 min（功率 450 W，工作 2 s，停顿 2 s）。破碎后于 
4℃，12 000 r/min  离心 30 min，弃去上清，即得
Trx-IFN-CSP 包涵体粗品。
1.2.2  包涵体的洗涤与溶解  用 IBs 洗涤液重悬包
涵体，漩涡混匀后室温静置 15 min 后，10 000 r/min，
4℃离心 10 min。分别于洗涤前后各取 40 μL 样品，
加入 10 μL 5×SDS 上样缓冲液，混匀后沸水煮 5 
min，冷却后 10 000 r/min 离心 10 min，吸上清，进
行 15% SDS-PAGE 检定，利用 Gel DOCTM 凝胶成像
系统分析包涵体洗涤前后重组蛋白的比例。
将洗涤后的包涵体重悬于 IBs 溶解液，漩涡混
匀，室温放置至包涵体全部溶解。分别于溶解前后
各取 50 μL 样品，加入 9倍体积的无水乙醇 -20℃放
置 2 h，4℃，10 000 r/min 离心 15 min 收集沉淀，进
2016,32(6) 221黄演婷等：重组融合蛋白 Trx-IFN-CSP 复性工艺研究
行 15% SDS-PAGE 检定，利用 Gel DOCTM 凝胶成像
系统分析包涵体溶解前后重组蛋白的比例。
1.2.3  Trx-IFN-CSP 的复性研究
1.2.3.1  pH 对复性的影响  冰浴条件下，将包涵体
变性液脉冲加样逐滴加入不同 pH值（pH 6.5、pH 7.0、
pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5 和 pH 9.0）的 IBs 稀释液中，
低温放置 2 h 后，将稀释后的变性液装进透析袋中
开始梯度透析，从透析外液 A 依次到透析外液 D，
每次透析至少 8 h。测定上清液中的蛋白浓度及经肠
激酶切去 Trx 标签后，肝靶向干扰素的抗病毒活性
以评价 pH对复性的影响。
1.2.3.2  温度对复性的影响  其他实验条件不变，
分别在 0℃、4℃、11℃、25℃和 37℃开始梯度透析。
1.2.3.3  蛋白浓度对复性的影响  其他实验条件不
变，调整 IBs 稀释液的量使变性蛋白终浓度分别为
100、200、300、400 和 500 μg/mL，开始梯度透析。
1.2.3.4  氧化还原体系对复性的影响  其他实验条
件不变，将包涵体变性液脉冲加样逐滴加入分别含
有 Cysteine/Cystine、DTT/GSSG、β-ME/GSSG、GSH/
GSSG的氧化还原体系的IBs稀释液中开始梯度透析。
1.2.3.5  小分子添加剂对复性的影响  其他实验条
件不变，将包涵体变性液脉冲加样逐滴加入分别含
有 Glycero、Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、
CTAB、Sucrose 辅助复性小分子的 IBs 稀释液中开始
梯度透析。
2 结果
2.1  包涵体释放
将收集的细胞重悬于 30% 高渗蔗糖缓冲液中，
在 -20℃结冻，渗透压和低温使细胞内的水分变成了
冰晶，造成细胞明显脱水，另外冰晶能对细胞膜造
成物理损伤，在 37℃水浴解冻时，细胞吸水溶胀将
导致细胞壁部分破碎，经过反复冻融处理可进一步
提高细菌破碎率。由于超声破碎过程中有大量热量
释放，所以使用冰浴及间歇破碎的方式，对于达到
较好的破碎效果以及避免 Trx-IFN-CSP 包涵体的热
变性有重要作用。细胞破碎后，8 000 r/min 离心 30 
min，弃去上清，即获得包涵体粗品。1 L 发酵液可
得到 1.17 g Trx-IFN-CSP 包涵体。
2.2  包涵体的洗涤及溶解
超声破菌后高速离心获得的包涵体沉淀除了融
合蛋白外，还含有膜蛋白及脂质体等其他成分，而
这些成分会影响包涵体蛋白的变复性。所以溶解变
性前应先洗涤包涵体，以去除杂质。对包涵体的洗
涤时发现，洗涤液的成分不同对包涵体的洗涤效果
有较大的影响。首先实验发现盐酸胍洗涤包涵体
会造成融合蛋白的大量损失，而低浓度的尿素的
洗涤效果更好。再者实验结果证明 1% TrionX-100 
和 2% DOC 对宿主菌蛋白有很好的增溶作用，但
是 TrionX-100 洗涤时间不宜过长，否则也会导致目
的蛋白的降解。利用 2 mol/L 尿素、1% TrionX-100 
和 2%DOC 联合洗涤的方法，有很好的纯化效果，
15%SDS-PAGE  显示（图 1-A，条带 3）其纯度为
62.3% 左右，而且包涵体的可溶性大大提高。
在洗涤过后，包涵体的纯度及可溶性都有所提
高，在此基础上分别选用过 8 mol/L 尿素和 6 mol/L
盐酸胍变性包涵体，实验结果表明 Trx-IFN-CSP 包
涵体在 8 mol/L 尿素中溶解相当困难，超声助溶及
37℃震荡助溶效果都不理想，而使用 6 mol/L 盐酸胍
变性，室温放置 30 min 则可有效地将包涵体溶解。
为了彻底的将包涵体中的二硫键打开，提高包涵体
溶解度，降低重组蛋白的损失率，在 IBs 溶解液中
加入 5 mmol/L EDTA  和 2.5 mmol/L DTT，15% SDS-
PAGE 显示（图 1-B，条带 3）其纯度为 64.7%。
2.3  Trx-IFN-CSP的复性研究
2.3.1  pH 对复性的影响  不同 pH 对复性的影响结
果示于图 2-A。可知在 pH7.0-8.0 时复性的融合蛋
白活性高于其他 pH 复性的样品，干扰素对于发挥
其生物活性作用时的 pH 有严格的范围，若超出范
围其活性受限。所以当 pH 偏酸或偏碱时，包涵体
虽然可以发生折叠，但折叠后的融合蛋白处于不利
于保持其活性的环境中，活性易丧失。当复性液 pH
为 7.0 和 7.5 时，其蛋白收率明显低于 pH8.0。当蛋
白质处于等电点时蛋白质的净电荷为零，由于相邻
蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于结聚形成沉淀，
所以复性 pH应避开蛋白质等电点。由此可见，Trx-
IFN-CSP 复性宜在 pH8.0 左右进行。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6222
2.3.2  温度对复性的影响  温度对复性的影响结果
如图 2-B。由图可知，在 4℃复性的融合蛋白的活性
和收率都高于在 25℃和 37℃复性的样品。包涵体变
性蛋白在折叠过程中，分子内的疏水氨基酸残基暴
露在外，使多肽链的疏水基团之间相互发生碰撞，
形成错误折叠导致蛋白聚沉。而随着复性温度的升
高，疏水作用力增强，使聚集体更容于形成，造成
活性及收率的降低。由此可见，Trx-IFN-CSP 复性宜
在低温条件（4℃）下进行。
2.3.3  蛋白浓度对复性的影响  不同蛋白浓度对复
性的影响结果示于图 2-C。传统的稀释复性时，复
性液的蛋白浓度需在 10-100 μg/mL 才会有较理想
的复性效率，但这无疑会加大对活性蛋白回收的难
度，不利于大规模操作。所以本研究选用脉冲加样
的方式稀释变性液。当复性体系中蛋白浓度为 200 
μg/mL、300 μg/mL 时，复性后融合蛋白的活性与
100 μg/mL 时复性的相当。而复性体系中各蛋白浓度
对蛋白收率的影响不大。脉冲稀释时，保证了有足
够的时间间隔使蛋白折叠通过易聚集的早期中间体
阶段，Trx-IFN-CSP 包涵体变性蛋白的终浓度越低，
越有利于变性蛋白的重折叠。在复性时，蛋白中间
态含有大量的疏水基团，溶液中蛋白浓度越高，分
子间作用力越大，蛋白质分子间聚合趋向性就越大，
蛋白质相互结合形成寡聚体或多聚体，这些聚合体
再进一步聚合则形成沉淀，导致复性失败。蛋白浓
度一般在 200-300 μg/mL 为宜。
2.3.4  氧化还原体系对复性的影响  不同氧化还原
体系对复性的影响结果示于图 2-D。4 对氧化还原
体系实验组中，GSH/GSSG 复性组的融合蛋白复性
后比活性高于其他实验组，而各组氧化还原体系对
Trx-IFN-CSP 复性的蛋白收率影响不大。Trx-IFN-CSP
含有两对半胱氨酸，在重折叠过程中通过添加氧化
还原体系来提供合适的氧化还原电位，GSSG 负责促
进二硫键的形成，而 GSH则催化错误配对的二硫键
进行重排，可促进其二硫键的正确配对。DTT/GSSG
和 β-ME/GSSG 复性组的比活性低的原因可能是由于
GSSG 与 DTT 和 β-ME的比例超出了合适范围，以致
于复性液还原性太强，二硫键将难以形成。
2.3.5  小分子添加剂对复性的影响  不同辅佐复性
小分子对复性的影响结果示于图 3。添加了辅助复
性小分子的各复性组的比活性和蛋白收率与对照组
相比都有大大的提高。这些辅助添加剂一般情况下
都是通过增强分子间相互作用来稳定蛋白质的天然
结构，或是通过减弱分子内的疏水作用来抑制聚集
体形成，从而辅助蛋白折叠。其中 L-Arg 的辅助效
率最高，表明 L-Arg 可选择性与错误折叠结构结合，
使错误折叠的分子不稳定从而促进分子形成正确构
象，其辅助复性有一定的通用性，因为其结合错误
折叠分子时不具有蛋白质种类特异性。
2.4  Trx-IFN-CSP复性工艺的稳定性
综合上述实验的结果，得出一套适合 Trx-IFN-
CSP 复性的方法：将包涵体变性液脉冲加样缓慢逐
滴加预冷的 IBs 稀释液中，将变性液蛋白浓度调至
300 μg/mL 左右，低温放置 2 h 后，开始梯度透析复 
性，温度 4℃，从透析外液 A 依次到透析外液 D，
每次透析至少 8 h。对复性前后的蛋白进行 15% 
SDS-PAGE 检定，上样量 10 μg，利用 Gel DOCTM 凝
胶成像系统分析结果（图 4）显示融合蛋白复性后
纯度达 95.0%。
连续 3 次进行 Trx-IFN-CSP 的制备，确认该工
艺的合理性与稳定性，同时大量获得 Trx-IFN-CSP。
结果如表 1 所示，经肠激酶切去 Trx 标签后，每升
发酵液最终获得的肝靶向干扰素约 110-130 mg 之
间，每批蛋白纯度在95%以上，比活性在1.9-2.4×108 
U/mg 之间，制备条件稳定。
170
kD
130
100
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65
40
35
25
15
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170
130
100
70
65
40
35
25
15
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kD
M 1 2 3 MBA 1 2 3
A：包涵体洗涤结果（M：蛋白质分子量标准；1：超声后收集的包涵体；2：
溶于洗涤液的杂蛋白；3：洗涤后的包涵体）；B：包涵体溶解结果（M：蛋
白质分子量标准；1：洗涤后的包涵体；2：不溶于变性液的杂蛋白；3：变
性后的融合蛋白）
图 1 融合蛋白洗涤、变性溶解结果
2016,32(6) 223黄演婷等：重组融合蛋白 Trx-IFN-CSP 复性工艺研究
3 讨论
Trx-IFN-CSP 是本实验室通过基因工程方法构
建的重组融合蛋白，是将 IFN-α2b 与疟原虫环子孢
子蛋白多肽 CSP I-plus 进行融合，连接到 pET32a 载
体上表达而获得的。Trx-IFN-CSP 经肠激酶切去 Trx
标签后即获得肝靶向干扰素（IFN-CSP），旨在利用
CSP I-plus 高效特异的肝细胞靶向性可将 IFN-α2b 导
向肝脏，使其在肝脏富集，有从而提高干扰素治疗
4
3
2
1
0
4
3
2
1
0
20
15
10
5
0
20
15
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0
25
15
20
10
5
0
25
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15
20
10
5
0
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
6.5 7.5
pH ⑙ᓖć
≗ॆӔᦒ㌫㔏∄⍫ᙗ㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷㳻ⲭ䍘⎃ᓖ/μg·mL-1
8.5 9.0 0 4 11 25 37
CystelneCystlne DTT/GSSG β-ME/GSSG GSH/GSSG100 200 300 400 500
8.07.0
∄⍫ᙗ104 U·mg-1  ∄⍫ᙗ104 U·mg-1 㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷% 㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷%
∄⍫ᙗ104 U·mg-1  㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷%∄⍫ᙗ104 U·mg-1  㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷% ∄⍫ᙗ㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷
∄⍫ᙗ㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷ ∄⍫ᙗ㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷
A B
C D
A ：复性液 pH 对 Trx-IFN-CSP 包涵体复性的影响；B：复性温度对 Trx-IFN-CSP 包涵体复性的影响；C：复性蛋白浓
度对 Trx-IFN-CSP 包涵体复性的影响；D：氧化交换系统对 Trx-IFN-CSP 包涵体复性的影响
图 2 Trx-IFN-CSP 的复性条件研究
图 3 添加剂对 Trx-IFN-CSP 包涵体复性的影响
Con
Glycero/% Tween-20/% Glycine/mmol·L-1 Arginine/mmol·L-1 β-CD/mmol·L-1 CTAB/mmol·L-1 Sucrose/mmol·L-1
6
5
4
3
2
1
0
10 5 1 0.5 0.3 0.1 50 25 10 0.5 0.3 0.1 8 4 2 1.5 0.5 100 50 10
70
60
50
40
30
20
10
0
1
∄⍫ᙗ104 U·mg-1  㶽ਸ㳻ⲭ᭦⦷ %
㳻ⲭ᭦⦷ ∄⍫ᙗ
乙型肝炎病毒慢性感染的特异性，减少全身用量，
降低毒副反应，提高量效比。初步研究证实，肝靶
向干扰素具备了 CSP I-plus 高效而特异的肝细胞靶
向性与 IFN 的抗 HBV作用，有重大的开发应用潜力。
本研究正是为了获得一套稳定的肝靶向干扰素制备
工艺，为开展后续新药研究工作奠定物质基础。
Anfinsen［2］经典的 RNaseA 折叠研究中发现蛋
白质的结构、稳定性和功能的全部信息都来源于其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6224
氨基酸组成和排列；多肽链的折叠是一个自发的过
程，主要决定于它的氨基酸序列。这一规律也被称
为生物体内的第二套遗传密码。不同的蛋白质需要
的复性条件不同，相同的因素对不同蛋白质的复性
的影响也不同。本研究结合稀释复性及透析复性方
法复性，一方面无需过大地增加溶液体积，便于后
续回收；另一方面提高复性率。
稀释和透析都是传统的复性法，其方法简单，
易于实验室操作［3］。但在单纯的稀释复性时，为了
减少聚集提高复性收率，通常需要在很低的蛋白浓
度（10-100 μg/mL）下进行［4］。这对于于大规模工
业生产来说，效率太低，后续工作过多而显得不大
实际。Katoh 等［5］将流加操作引入复性过程，即脉
冲稀释，以流加的方式向复性缓冲液中注入变性蛋
白质。这种复性方法已在变性溶菌酶复性中得到了
验证。所以本研究采用了复性，以求在提高蛋白质
复性收率的同时设法增大蛋白质浓度，使复性过程
中维持较低的变性蛋白浓度而复性终蛋白浓度较高，
其关键在于掌握变性蛋白加入的时间间隔，在后一
部分加入之前，前一部分有一段时间可以折叠，相
当于降低了稀释时复性体系中变性蛋白的浓度，从
而降低了变性蛋白发生分子间作用而聚集沉淀的几
率。脉冲稀释复性在每次蛋白加入之间，保证有足
够的时间间隔使蛋白折叠通过易聚集的早期中间体
阶段，提高单位体积复性液的复性蛋白量，是实现
高复性浓度下的稀释复性的一条途径。
在优化复性方式的基础上，本实验对影响复性
的因素如 pH、温度、变性蛋白质的浓度以及氧化还
原体系进行考察，以经肠激酶去除 Trx 标签后肝靶
向干扰素的比活性与融合蛋白收率为双指标，摸索
出较优的复性条件。（1）体外折叠复性的缓冲液 pH
值常控制在 7.0-9.0 之间，这是因为碱性环境能够
防止变性蛋白质中还原的自由巯基因为硫醇质子化
作用而影响二硫键的正确形成［6］。在不同 pH值下，
蛋白质所带电荷量不同，在溶液 pH值等于其 pI 时，
蛋白质所带净电荷数最少，而蛋白质带电荷的情况
直接影响其在溶液中的稳定性，进而影响其在复性
中的行为［7］。所以复性液 pH 在偏碱性的同时还需
尽量远离蛋白的 pI 值，以减少蛋白质的聚集。（2）
折叠复性的温度范围为 0-40℃［8］，在这个温度范围
内，折叠复性的速度和复性率随温度的增高而增高，
但聚集的速度也随之增高。低温时复性虽慢但成功
率高。（3）复性过程中蛋白的折叠为一级反应，而
蛋白质的聚集是二级以上的反应［9］，其速度受浓度
影响大，低蛋白浓度有利于获得较高的复性收率。
在复性时，当蛋白质浓度过大会产生不稳定的中间
物，使疏水基暴露在中间物表面，在疏水基团相互
作用下，产生聚集沉淀物。如此不但产物收率降低，
还增加了不溶性无活性蛋白质聚积物。（4）氧化还
原体系，是由小分子氧化型和还原型的巯基化合物
混合组成。蛋白质折叠的机制显示，具有二硫键蛋
白质的复性成功与否与二硫键的形成与重排紧密相
关。由于体外折叠没有二硫键异构酶的存在，蛋白
质折叠时巯基氧化容易产生错误配对的二硫键。所
以需要氧化还原体系帮助蛋白质通过分子内重排成
天然配对，二硫键的重排过程可能是这类蛋白质折
叠的限速步骤。
在复性过程中产生聚集体的主要原因是蛋白
质肽链间的疏水相互作用［1］，因此抑制肽链间的
疏水相互作用是提高复性收率的关键。为此，本研
170
kD
130
100
70
65
40
35
25
15
10
M 1 2 3
M：蛋白质分子量标准；1：变性的融合蛋白；2：复性中聚沉的蛋白；3复
性的融合蛋白
图 4 Trx-IFN-CSP 包涵体复性
表 1 肝靶向干扰素连续三批制备结果
批次 包涵体 /g SDS-PAGE 
纯度 /%
纯品总 
量 /mg
比活性 / 
U/mg
120920 1.17 96.6 134.0 1.96×108
120924 1.19 96.2 112.5 2.40×108
121002 1.23 95.8 121.4 2.07×108
2016,32(6) 225黄演婷等：重组融合蛋白 Trx-IFN-CSP 复性工艺研究
究比较了多种折叠促进剂和聚集抑制剂（Glycero、
Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、CTAB、
Sucrose）辅助 Trx-IFN-CSP 复性的效果。助折叠剂
稳定蛋白质的原理在于它们能被蛋白质优先排斥，
结果使蛋白质优先水化，从而增加蛋白质的稳定
性［10］。聚集抑制剂是通过减弱分子内的疏水作用，
从而稳定天然构象来抑制聚集发生［11］。蛋白质稳定
性的提高表明从变性态到复性态的过程是热力学有
利的过程，也就是说渗透质的加入可以促进蛋白质
的折叠。实验结果显示，L-精氨酸对 Trx-IFN-CSP 复
性的辅助效率最高。早在 Fischer［12］和 Buchner［13］
的复性研究中，已经发现 L-精氨酸可以大大提高变
性蛋白的复性成功率，分别是 80%和 100%。虽然，
对 L-精氨酸辅助蛋白复性的机制尚不完全清楚，但
相关研究发现与低浓度的盐酸胍及脲相比，L-精氨
酸对蛋白质的稳定性影响微弱，因此推测可能是其
增加了折叠中间体的溶解度才促进了复性。
4 结论
通过反复冻融联合超声破菌能高效获得包涵体
蛋白，尿素洗涤后再用盐酸胍变性、脉冲加样稀释
后梯度透析复性，建立了较为稳定的制备工艺。经
肠激酶切去 Trx 标签后，每升发酵液可制备纯度
95% 以上、比活性在（1.9-2.4）×108 U/mg 之间的
肝靶向干扰素 110-130 mg。
参 考 文 献
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（责任编辑  李楠）