全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(4): 672−678 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由陕西省“13115”科技创新工程重大项目(2007ZDKG-01)和农业部小麦现代产业技术体系建设陕西小麦综合试验重大项目(NYCYTX-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 高翔, E-mail: gx@nwsuaf.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wudanespn@hotmail.com
Received(收稿日期): 2008-09-08; Accepted(接受日期): 2008-12-12.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00672
小麦品种陕 253 低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达
吴 丹 1 高 翔 1,2,* 于 旭 1 董 剑 1,2 赵万春 1,2 陈其皎 1,2 庞红喜 1,2
李哲清 1,2
1 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2 陕西省小麦工程技术研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 利用 LMW-GS特异引物, 从强筋小麦品种陕 253中克隆了 1个 1 498 bp的片段(GenBank登录号为 FJ172533),
该片段包含全长为 912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列。经比较推导氨基酸序列的同源性, 发现该基因属
于 Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因, 编码产物 N-端具有 LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征, 系
统演化分析也支持这一结果。构建了该基因的表达载体 pET32a-GluD3-S253, 在宿主菌 E. coli Rosetta-gami B (DE3)
中经 IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE和 Western blot检测表达产物, 证实融合蛋白表达成功。
关键词: 小麦; 低分子量谷蛋白亚基; 基因克隆; 融合蛋白; 原核表达
Cloning and Prokaryotic Expression of a Low Molecular Weight Glutenin Gene
from Wheat Variety Shaan 253
WU Dan1, GAO Xiang1,2,*, YU Xu1, DONG Jian1,2, ZHAO Wan-Chun1,2, CHEN Qi-Jiao1,2, PANG Hong-Xi1,2,
and LI Zhe-Qing1,2
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Wheat Engineering Research Center of Shaanxi Province, Yangling
712100, China
Abstract: Low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) plays an important role in determination of flour viscoelastic
properties in wheat (Triticum aestivum L.). LMW-GS has large polymorphism and variation in molecular size, thus, it is difficult
to be isolated using one-dimensional electrophoresis. Shaan 253 is a wheat variety with characteristics of high yield and early
maturity, especially, with elite high-molecular-weight glutenin subunits, such as 5+10 on 1D, 14+15 and 20 on 1B, and 1 on 1A.
The purpose of this study was to understand the contribution of LMW-GS to the processing quality in Shaan 253. Using a pair of
specific primers of LMW-GS and pMD19-T vector, one DNA fragment of 1 498 bp (GenBank accession No. FJ172533) was ob-
tained from Shaan 253. The fragment contained the complete coding sequence of 912 bp and encoded 304 amino acid residues.
According to sequence analysis, this gene was involved in Glu-D3 loci, and had high similarities to other known LMW-GS genes
with the highest identity of 99.34%. Deduced amino acid sequence showed there were typical features of LMW-m type in
N-terminal region, which was confirmed by the phylogenetic analysis. The expression vector of pET32a-GluD3-S253 was con-
structed and transformed into the host bacteria Escherichia coli Rosetta-gami B (DE3). The expression product was testified using
SDS-PAGE and Western-blot, indicating that the fusion protein was successfully expressed.
Keywords: Wheat; Low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS); Gene cloning; Fusion protein; Prokaryotic expression
小麦(Triticum aestivum L.)低分子量谷蛋白亚基
(low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS)是
小麦麦谷蛋白的重要组成部分。编码 LMW-GS的大
多数基因被定位在第一同源组群 1A、1B和 1D染色
体短臂末端的 Glu-A3、Glu-B3和 Glu-D3位点, 距着
丝点 42~46 cM, 分别与 Gli-A1(1.3 cM)、Gli-B1(2 cM)
和 Gli-D1紧密连锁[1-2], 构成一个庞大的基因家族。
20世纪 80年代后, 通过各种单、双向电泳和反相高
效液相色谱及单克隆抗体等分析方法 , 证实
LMW-GS 在 Glu-A3 位点有 7 个等位基因, 分别是
Glu-A3a、b、c、d、e、f 和 g; 在 Glu-B3 位点有 9
个等位基因, 即 Glu-B3a、b、c、d、e、f、g、h 和
第 4期 吴 丹等: 小麦品种陕 253低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达 673


i; 在Glu-D3位点有 5个等位基因, 分别是Glu-D3a、
b、c、d 和 e [3-5]。此外, 在 Glu-D4 和 Glu-D5 位点
也有报道[6]。
研究表明, LMW-GS 基因家族成员的编码区在
结构上非常相似, 由信号肽、保守 N-端区、含有多
个重复短肽的重复区以及 C-端保守区构成[7], 不具
有内含子, 编码的氨基酸序列中通常含有 8 个半胱
氨酸残基 , 但某些 LMW-GS 含有 9 个半胱氨酸[8],
这些半胱氨酸位置保守, 对低分子量谷蛋白在面粉
加工品质中的作用有重要贡献[9]。LMW-GS 通过这
些半胱氨酸形成分子间二硫键, 结合到以高分子量
谷蛋白亚基为骨架的谷蛋白聚合体中, 从而影响小麦
面粉的黏弹性, 与面筋延展性和抗性密切相关[10-13]。
由于组成复杂, 分离较为困难, LMW-GS 在小麦品
质研究中没有得到充分重视, 研究相对滞后。近年
来, 国内外已在改进 LMW-GS分离方法、编码基因
的克隆、分子结构特征及功能研究等方面取得了显
著进展[14]。D’Ovidio等[15]首次报道利用 PCR方法分
离单个低分子量谷蛋白基因。Lee等[16]在 E. coli表
达系统中获得了野生一粒小麦 (T. boeoticum)
LMWG-E2 和 LMWG-E4 基因编码的成熟 LMW-GS
蛋白, 并用于随后的蛋白功能分析。Cloutier 等 [17]
通过 PCR 技术分离克隆了一个编码 LMW-i 型亚基
的基因 , E. coli 体外表达产物经 SDS-PAGE 和
Western 杂交分析 , 证明与小麦 Glenlea 中的
LWM-50具相同的杂交带。
陕 253 是本课题组选育的丰产、早熟、优质强
筋小麦新品种, 由陕 229/陕 213杂交而成, 具有面团
形成时间和稳定时间长等突出的品质特征。陕 253
的高分子量谷蛋白亚基组成中含有优异亚基, 即 1D
上含有 5+10亚基, 1B上含有 14+15、20亚基, 1A上
含有 1 亚基[18]。这说明陕 253 的高分子量谷蛋白亚
基品质和数量上都具有优质的构成, 但是目前关于
该品种 LMW-GS对面粉加工品质的贡献了解较少。
本研究从陕 253中克隆了一个 LMW-GS基因, 并构
建了其原核表达载体, 诱导其融合蛋白表达, 为其
体外结构及功能的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其基因组 DNA的提取
陕 253种子由本实验室保存, 以室内培养 4~5 d
的幼叶片为材料, 采用微量 CTAB 法[19]提取基因组
DNA。
1.2 目的基因克隆
以“陕 253”基因组 DNA为模板, 采用 LMW-GS
特异引物 P1: 5′-GCCTTTCTTGTTTACGGCTG-3′;
P2: 5′-TCAGATTGACATCCACACAAT-3′ [20](Invitro-
gen公司合成)扩增目的基因。PCR总体积 50 μL, 含
模板 DNA 100 ng、0.1 μmol L−1引物、1.5 U Taq DNA
聚合酶、0. 05 mmol L−1 dNTP。PCR 程序为 94℃预
变性 5 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 45 s, 72℃延伸 3
min, 共 35个循环; 最后 72℃延伸 10 min。用 1%琼
脂糖凝胶电泳检测 PCR产物, 并回收目的片段。
回收片段与 pMD19-T 载体(大连宝生物工程有
限公司 ) 16℃连接过夜 , 以连接产物转化 E. coli
DH5α 感受态(Promega 公司), 在涂有氨苄青霉素及
X-gal/IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选, 挑取白色
单克隆, 用克隆载体上的随机引物 M13做菌落 PCR
检测, 反应条件与目的片段扩增条件相同。随机选
取 3个独立的阳性克隆进行测序(上海生工生物工程
技术服务有限公司)。
1.3 目的基因序列分析
利用 NCBI 在线 BLAST 工具, 对开放阅读框
(ORF)、核苷酸及氨基酸序列进行同源性搜索 ; 用
DNAMAN (5.2.9 Demo version)进行 DNA序列翻译;
用 MEGA4.0软件构建系统演化树。
1.4 原核表达载体的构建与鉴定
根据目的序列的完整编码区, 利用 Primer5.0设
计一对表达引物, 即 P3: 5′-CGCGGATCCATGGAG
ACTAGATGCGTC-3′, P4: 5′-CCCAAGCTTCCGCTG
CATCGACATA-3′ (Invitrogen公司合成), 下画线分
别表示 BamH І、Hind Ш酶切位点。以阳性克隆质
粒为模板, 扩增并回收目的基因。PCR 体系总体积
50 μL, 含模板 DNA 100 ng、0.1 μmol L−1引物、1.5 U
Taq DNA聚合酶、0. 05 mmol L−1 dNTP。PCR程序
为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 58℃退火 45 s,
72℃延伸 2 min, 共 35 个循环; 最后 72℃延伸 8
min。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
纯化的 PCR产物及 pET-32a(+)质粒(MERCK公
司)分别用 BamH I和 Hind Ш进行双酶切, 回收纯化
酶切片段, 并用 T4 DNA连接酶 16℃连接过夜。将
连接产物转化至宿主菌 E. coli DH5α 中, 在含有氨
苄青霉素的 LB 琼脂平板上 37℃培养过夜。挑取白
色阳性菌落, 用随机引物 M13 及 P3、P4 引物进行
菌落 PCR 检测; 用碱裂解法提取质粒, BamH I 和
Hind Ш双酶切筛选, 并测序鉴定。
674 作 物 学 报 第 35卷

1.5 重组质粒的诱导表达
将重组表达质粒转化入宿主菌 E. coli Rosetta
gami B (DE3)(MERCK公司)中。挑取重组菌单菌落,
接种至含有羧苄青霉素的 LB培养基中, 37℃培养过
夜。将培养物按 1∶100接种至 5 mL LB培养基中,
培养至 A600 = 0.5~0.8时, 取 1 mL作为未诱导的阴性
对照, 同时设立诱导及未诱导的空载体对照, 向剩
余培养液加入 IPTG(终浓度为 1 mmol L−1), 37℃诱
导 6 h后取菌液 1 mL, 15 000 × g离心收集菌体 10
min, 加入 1× SDS 凝胶加样缓冲液 100 μL, 重悬,
煮沸 5 min, 用 12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的
表达情况。
1.6 重组蛋白的Western blot分析
采用 12%SDS-PAGE 电泳分析处理后的样品,
并将表达产物经 60 V 2 h 电转移到硝酸纤维膜上,
加入新鲜配制的封闭液(含 5%脱脂奶粉的 TBS), 室
温摇床封闭 1 h。弃封闭液, 加鼠抗 His抗体(1 5000)∶ ,
于室温摇床孵育 1 h。回收一抗, TBS洗膜 2次, TBST
洗膜 2次。用 HRP标记的羊抗鼠 IgG为二抗(1 500)∶
室温孵育 1 h。回收二抗, TBS 洗膜 2 次, TBST 洗
膜 2次, 用 DAB显色试剂盒进行化学发光法显色鉴
定。
2 结果与分析
2.1 目的基因的 PCR扩增及克隆
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物可见一
条约为 1 500 bp的条带(图 1)经回收纯化后, 连接进入
pMD19-T克隆载体, 转化产物经过蓝白斑及菌落 PCR
筛选后, 获得一阳性克隆, 命名为 pMD-LMW-S253。

图 1 PCR产物电泳分析
Fig. 1 PCR amplified products separated on 1% agarose gel
M: DL2000; 1: 陕 253 PCR产物; 箭头示 PCR条带。
M: DL2000; 1: PCR product from Shaan 253. Arrow shows the
target band from Shaan 253.

2.2 目的基因序列分析
阳性克隆测序表明, 插入片段长 1 498 bp。该序
列与已经发表的小麦低分子量谷蛋白 Glu-D3 位点
所编码氨基酸序列的同源性很高 , 而与栽培品种
“Glenlea”来源(GenBank 登录号为 EU189094)的
LMW-m 型亚基的一致性高达 99.34%(表 1), 仅在 2
个位点出现氨基酸变异(V→I, D→G)。
利用 NCBI 上的 BLASTx 及 DNAMAN 对序列
的 ORF 进行分析, 结果表明, 该序列含有一个 912
bp 完整的开放阅读框, 无内含子, 共编码 304 个氨
基酸。翻译后的氨基酸序列, 含一个N-端信号肽, 由
20个氨基酸组成; 13个保守的氨基酸残基组成的 N-
末端, 其中包含一个半胱氨酸, 重复短肽组成的具
有 100 个氨基酸的重复区, 该区富含谷氨酰胺(Q)和
脯氨酸(P), 以及由 171 氨基酸组成的保守 C 端, 其

表 1 pMD-LMW-S253 (GenBank序列号 FJ172533)推导的氨基酸序列与 Glu-3位点编码基因的氨基酸序列一致性比对
Table 1 Identity of LMW glutenin S253 from wheat cultivar Shaan 253 with homologous genes encoded by Glu-3 in wheat
亚基类型
Type of subunit
GenBank登录号
GenBank acc. No.
来源
Source
氨基酸序列的一致性
Identity of protein (%)
AY453159 T. aestivum 49.59
AY453160 T. aestivum 51.65
AY453156 T. aestivum 57.71
LMW-Glu-A3
DQ234069 T. monococcum 69.75

EU369729 T. aestivum 60.45
EU369716 T. aestivum 65.65
EU369708 T. aestivum 70.33
LMW-Glu-B3
EU369703 T. aestivum 74.93

EU189096 T. aestivum 64.77
EF437422 Aegilops tauschii 73.80
DQ457416 T. aestivum 77.12
LMW-Glu-D3
EU189094 T. aestivum 99.34
第 4期 吴 丹等: 小麦品种陕 253低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达 675


中含 7个半胱氨酸。N-/C-端氨基酸(图 2和图 3)及系
统演化(图 4)分析结果表明, 该基因编码产物为典型的
LMW-m型低分子量谷蛋白, 属于 Type V (Group 10),
但在 N-端存在单个氨基酸的替换(I→V)。


图 2 FJ172533推导的氨基酸序列
Fig. 2 Deduced amino acid sequence of FJ172533
方框示半胱氨酸残基。Cysteine residues are boxed.

图 3 FJ172533 编码的 N-/C-端部分氨基酸
Fig. 3 Partial N-/C-terminal amino-acids encoded by FJ172533
箭头示氨基酸变异位点。Arrowhead indicates the mutated amino acid.

图 4 FJ172533 所推导氨基酸序列的系统演化分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence of FJ172533
箭头示 S253(FJ172533)推导的氨基酸序列。
Arrowhead shows the LMW-GS gene from Shaan 253 (FJ172533).

2.3 原核表达载体的构建和重组子鉴定
目的片段及 pET32a(+)经过 BamH I和 Hind Ш
双酶切, 纯化、连接, 构建重组表达载体。单克隆经
菌落 PCR检测为 1 000 bp左右插入片段, 与目的片
段(912 bp)大小基本相符(图 5); 双酶切结果为 1 000
bp左右的目的基因片段及 5 900 bp左右的 pET32a(+)
序列(图 6)。重组质粒经再次测序表明, 与克隆序列
完全一致, ORF正确。表明成功构建了 Glu-D3原核
676 作 物 学 报 第 35卷

表达载体, 并将其命名为 pET32a-GluD3-S253。

图 5 pET32a-GluD3-S253 重组菌落 PCR
Fig. 5 PCR of recombinated single clone
箭头示表达载体插入片段。
Arrow shows amplification product from the positive clone.

图 6 pET32a-GluD3-S253 重组质粒双酶切
Fig. 6 Digestion of pET32a-GluD3-S253 with BamH I/Hind Ш
箭头示双酶切片段。
Arrows show enzyme digestion fractions of pET32a-GluD3-S253.

2.4 目的基因表达产物的 SDS-PAGE分析
经过 IPTG诱导, pET32a-GluD3-S253重组质粒
在 Rosetta gami B (DE3)中表达, 分子量 55 kD左右,
与预计的低分子量谷蛋白融合蛋白分子量相似(图
7), 目的蛋白约 34.602 kD, 标签蛋白 20.4 kD。
2.5 目的基因表达产物的Western blot分析
表达产物经 12%SDS-PAGE 后, 电转移至 NC
膜上, 经牛奶封闭后依次加入小鼠抗 His一抗, HRP
标记的羊抗小鼠 IgG 二抗, 最后在联苯胺溶液中观
察到一条 55 kD条带(图 8), 证明融合表达蛋白成功
表达。

图 7 诱导表达产物的 SDS-PAGE 分析
Fig. 7 Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE
M: 蛋白质分子质量标准; 1、4: 未诱导重组质粒; 2、3、5: IPTG
诱导后的重组质粒; 6: 未诱导空载体; 7: 诱导后空载。箭头示基
因 S253表达产物。
M: protein molecular weight marker; 1 and 4: protein of recombi-
nant plasmid pET32a-GluD3-S253 before induction; 2, 3, and 5:
protein of recombinant plasmid induced by IPTG; 6: uninduced
protein of pET32a (+); 7: induced protein of pET32a (+).
Arrow shows expression product of LMW-GS S253.


图 8 重组质粒 pET32a-GluD3-S253 表达产物的 Western blot
分析
Fig. 8 Western blot of expression product of the recombinant
plasmid pET32a-GluD3-S253
M: 蛋白质分子质量标准; 1: 未诱导重组质粒
pET32a-GluD3-S253; 2: 诱导后的重组质粒。
M: protein molecular weight marker; 1: uninduced recombinant
plasmid pET32a-GluD3-S253; 2: induced recombinant plasmid
pET32a-GluD3-S253.

3 讨论
低分子量谷蛋白是小麦种子中含量最丰富的贮
藏蛋白, 分别占小麦种子储藏蛋白及谷蛋白总量的
40%和 60%左右[21], 在一个普通小麦品种中具有多
达 30~40个 LMW-GS基因[22]。对于低分子量麦谷蛋
白亚基基因主要有 4 种分类系统 : (1) Gupta 和
Shepherd[23]、Jackson 等 [24]根据低分子量谷蛋白在
SDS-PAGE 以及 2D IEF/SDS-PAGE 的迁移率不同,
划分了 B、C 和 D 区, 其中 B 区为碱性蛋白, 分子
量 42~51 kD; C区为一组与 γ-和 α-醇溶蛋白重叠的
第 4期 吴 丹等: 小麦品种陕 253低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达 677


LMW-GS, 分子量 31.0~36.5 kD; D 区为酸性蛋白,
其迁移率介于 A和 B区之间, 且与 ω-醇溶蛋白位置
相近。(2) Lew等[25]、Sissons等[26]和 Cloutier等[27]
根据 LMW-GS 编码产物的 N-末端或起始氨基酸序
列将 LMW-GS分为 LMW-m、LMW-s和 LMW-i型,
其起始氨基酸序列分别是 METSH(R/C)I-、SHIPGL-
和 ISQQQQ-(缺少 N-末端区域)。(3) 根据染色体定
位, 可将 LMW-GS 划分为 Glu-A3、Glu-B3 和 Glu-
D3[28]。(4) Masci等[29]和 Ikeda等[30]根据半胱氨酸的
分布、C-/N-端保守氨基酸序列将 LMW-GS 基因划
分为 6种类型, 即 Type I至 Type VI, 共分 12组。基
于通用三联体密码推导的 LMW-GS 基因氨基酸序
列比较、演化分析及原核表达, 本研究克隆的 S253
属于 C组、LMW-m型、Type V (第 10组)亚基, 系
Glu-D3编码的新基因。
韩彬和 Shepherd[31]研究表明, A 组亚基(HMW-
GS-A)与 B 组亚基(LMW-GS-B)占谷蛋白的比例与
沉降值呈显著正相关, 而 C 组亚基(LMW-GS-C)呈
显著负相关, 籽粒蛋白含量主要通过 A和 C组亚基
比例影响品质。本研究发现的 LMW-GS 基因 S253,
其编码产物对强筋小麦陕 253 面粉烘烤品质有何作
用尚需进一步研究。
LMW-GS 亚基一般含有 8 个半胱氨酸残基, 与
高分子量谷蛋白亚基通过分子间二硫键形成蛋白质
聚合体, 从而影响面粉的品质。虽然已经知道小麦
LMW-GS 对面团阻力和延展性有着重要作用, 但由
于 LMW-GS 不仅数量远多于 HMW-GS, 其基因家
族也较为复杂, 且变异广, 在 SDS-PAGE 中与醇溶
蛋白谱带重叠[32], 给深入研究 LMW-GS带来了难度,
绝大多数低分子量谷蛋白亚基对小麦品质的作用并
没有得到清楚认识。因此, 有必要将低分子量谷蛋
白从小麦贮藏蛋白中分离出来。迄今, 国内外对低
分子量亚基的分离方法虽有一些报道, 但因分离量
少、操作繁琐、不易掌握等原因始终未能广泛用于
品质育种[14]。以 PAGE 改进的一系列电泳方法易受
实验过程中很多难以准确操作的影响, 使定性、定
量分析准确性较低 [33], 且分离效果差。与此相比 ,
液相色谱仪具快速、简单和高通量的特点, 可以定
性分析贮藏蛋白组分, 但其的定量分析能力相对较差
[34], 且其仪器、标样价格昂贵, 样品的前期制备也比
较繁琐。
目前还有一些关于低分子量谷蛋白功能的研究
方法, 如低分子量谷蛋白的转基因[35]、体内过量表
达低分子量谷蛋白亚基、筛选一系列仅一个或几个
低分子量谷蛋白亚基有差异的小麦体系等, 但这些
技术研究时间长, 试验技术复杂, 要求高。
目的蛋白微量掺粉试验为研究低分子量蛋白质
亚基对品质的影响提供了快速、简便的途径。该方
法只需将外源的低分子谷蛋白添加到面粉中, 用微
量揉和仪即可以测定其品质效应。但这种方法要求
足量的纯化蛋白质, 高水平的原核表达体系的产物
经纯化后能满足试验需求, 由于低分子量谷蛋白基
因本身的特性及该基因家族丰富的变异, 国内的相
似研究还比较少[36]。就目前而言, 针对 D 基因组的
LMWG-16/10 以及 LMW-i 型低分子量谷蛋白基因,
其表达载体主要采用 pET11、PAcYm1和 pET3a, 宿
主细胞 BL21SI、JM109/AD494(DE3)、BLR21(DE3)
pLysS, 但普遍表达量低或者无法成功表达[37-38]。本
研究利用 pET-32a 构建了 LMW-m 型亚基的表达载
体, 并在 E. coli Rosetta gami B (DE3)体系中实现对
单个低分子谷蛋白亚基的分离, 可获得大量纯化的
目的蛋白, 为微量掺粉试验对低分子量谷蛋白亚基
品质效应等的综合评定奠定了基础。
4 结论
获得全长为 912 bp 的完整编码序列 , 属于
Glu-D3位点基因。其 N-端氨基酸序列符合 LMW-m
型低分子量谷蛋白特征。获得基因融合蛋白表达产
物, 该基因编码产物为 C组 LMW-GS。
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