全 文 ：第 32 卷 第 1 期 生 态 科 学 32(1): 027-033
2013 年 3 月 Ecological Science Nov. 2013
收稿日期：2012-10-11 收稿，2012-12-11 接受
基金项目：国家自然科学基金项目（40776078, 41176104, U1133003）资助
作者简介：刘静雅（1987—），女，硕士研究生，主要研究方向为水域生态学。E-mail：ljy870126@163.com
*通讯作者：徐宁，E-mail：txuning@163.com
刘静雅，赖海燕，徐宁，段舜山. 生长阶段及环境因子对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响[J]. 生态科学, 2013, 32(1):
027-033.
LIU Jing-ya, LAI Hai-yan, XU Ning, DUAN Shun-shan. Effects of growth phase and environmental factors on amino acid oxidase
activity of Prorocentrum donghaiense[J]. Ecological Science, 2013, 32(1): 027-033.

生长阶段及环境因子对东海原甲藻氨基酸氧化酶
活性的影响
刘静雅, 赖海燕, 徐宁*, 段舜山
暨南大学水生生物研究中心，广州 510632
【摘要】以中国沿海典型赤潮藻东海原甲藻为实验材料，研究了不同生长阶段以及温度、光照和氮源对其氨基酸氧化酶活性
的影响。结果表明，在缺氮条件下东海原甲藻显示较高的氨基酸氧化酶活性。在 15-30 ℃温度范围均检测出氨基酸氧化酶活
性，较低温度下(15-20 ℃)的氨基酸氧化酶活性显著高于高温处理组（25-30 ℃）（p<0.05），其中 20℃时的酶活最高。在 50-100
µmol/(m2·s)的光强下, 氨基酸氧化酶活性较高（0.38-0.47 fmol/(h·cell)）, 而在 2 µmol/(m2·s)的低光强下，虽然酶活受到显著
抑制，但仍达到 0.28 fmol/(h·cell)。氮源组成对氨基酸氧化酶活性具有显著影响，以丙氨酸为唯一氮源时的酶活最高(0.44
fmol/(h·cell)), NH4++丙氨酸为氮源时的酶活最低(0.22 fmol/(h·cell))。研究显示，光照、温度和氮源是东海原甲藻氨基酸氧化
酶活性的关键调控因子。东海原甲藻不仅能够有效利用游离氨基酸，而且适应较广的温度和较低的光照条件，这可能是东海
原甲藻赤潮形成和持续的重要原因。
关键词：东海原甲藻；溶解游离氨基酸；可溶性有机氮；氨基酸氧化酶；环境因子
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2013.01.005 中图分类号： Q178.1 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2013)01-027-07
Effects of growth phase and environmental factors on amino acid oxidase
activity of Prorocentrum donghaiense
LIU Jing-ya, LAI Hai-yan, XU Ning*, DUAN Shun-shan
Research Centre of Hydrobiology，Jinan University, Guangzhou 510632,China
Abstract: Effects of growth phase, temperature, irradiance and nitrogen source on the amino acid oxidase (AO) activity of
Prorocentrum donghaiense, a causative organism of large-scale harmful algal blooms (HABs) along the coastal waters of East China
Sea, were investigated in the laboratory. The results showed that P. donghaiense displayed higher amino acid oxidase activity in
N-depleted conditions. AO activity of P. donghaiense was detected at the temperatures ranging from 15 to 30 ℃, in which AO
activity was significantly higher at lower temperatures (15 ℃-20 ℃) than that at higher temperatures(25 ℃-30 ℃) (p<0.05), and the
maximum value was observed at 20 ℃. Although AO activity was relatively higher (0.38 to 0.47 fmol/(h·cell)) at higher irradiances
(50-100 µmol/(m2·s)), AO activity was still up to 0.28 fmol/(h·cell) at irradiance of 2 µmol/(m2·s1). Nitrogen source exhibited a
significant impact on AO activity of P. donghaiense. The highest AO activity (0.44 fmol/(h·cell)) was observed when alanine was
used as the sole nitrogen source, and the lowest AO activity (0.22 fmol/(h·cell)) was recorded in the combination of ammonium and
alanine. It suggested that temperature, irradiance and nitrogen source were key environmental factors regulating AO activity of P.
donghaiense. P. donghaiense is not only capable of utilizing free amino acids effectively, but also flexible in adapting to broad
temperature and lower irradiance, which may play important roles in the formation and duration of P. donghaiense blooms.
Key words: Prorocentrum donghaiense; dissolved free amino acid (DFAA); dissolved organic nitrogen (DON); amino acid oxidase
(AO); environmental factor

生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 28
1 引言（Introduction）

近年来，全球沿海水体富营养化程度不断上升，
导致赤潮爆发的频率、强度和持续时间都不断增加
[1-4]。研究表明，海洋环境中富营养化形成的主要原
因是氮负荷的增加[5]。通常认为无机氮是海洋浮游
植物生长的主要氮源，但事实上在大多数水域中，
最大的氮库是可溶性有机氮（DON）[6]。数据显示，
全球近岸海域的 DON 平均浓度为 280 µg/L，远远
超过无机氮（DIN）的平均水平[7]；现场调查发现，
夏季 DIN 浓度最低，而 DON 浓度最高时常促进某
些赤潮种类的增殖[8]，在 DIN 缺乏但 DON 充足的
环境中爆发的赤潮可能与赤潮藻利用 DON 有关[9]；
研究也发现，许多浮游植物（特别是甲藻）更倾向
于利用 DON[10,11,12]。故 DON 作为总氮（TN）的重
要组成部分，在浮游植物生长过程中的作用不可忽
视。
目前，对海水 DON 的研究主要涉及尿素、氨
基酸、核苷酸、ATP 等主要组分。其中，可溶性游
离氨基酸（dissolved free amino acid，DFAA）是 DON
中化学性质最不稳定的一种[6]，其含量在 0-5 uM 之
间波动[13]。传统观念认为细菌才是 DFAAs 的主要
消费者，但近期研究发现，DFAAs 不仅能为细菌提
供 N 源和 C 源， 且大约占浮游植物 N 吸收的
17%[14]，尤其在低 DIN、高 DON 的环境，浮游生
物群落对氨基酸的吸收可高达总氮吸收的 50%[15]，
在赤潮爆发过程中起重要作用[16]。目前，浮游植物
利用氨基酸的主要途径包括氨基酸转运系统[17]、酶
降解[18]及吞噬和胞饮作用等[19,20]。研究发现，一些
浮游植物细胞表面具有 L-氨基酸氧化酶，能在胞外
将游离氨基酸氧化成 H2O2、NH4+、a-酮酸或醛类，
NH4+则直接被浮游植物吸收利用[21-22]，相较于其它
吸收途径，该氧化机制能更节能地为浮游植物获取
大范围的有机氮物质[23]。初步估计，海洋环境中大
约 20% DON 的利用是依赖浮游植物的氨基酸氧化
酶作用[24]。虽然，近期研究已认识到细胞表面氧化
酶对浮游植物氮营养吸收的重要性，但是国内有关
微藻对 DFAAs 的吸收利用特性研究仍然较少，而
有关 DFAAs 细胞表面氧化机制的研究几乎没有。
东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）是中
国沿海常见的赤潮原因藻种，研究表明，该藻能在
无菌条件下以多种氨基酸为唯一氮源，并快速生长。
推测细胞表面氧化酶对氨基酸的降解发挥关键作用
[25]。但是，目前有关东海原甲藻氨基酸氧化酶的活
性及其调控机制并不清楚。因此，本文选取东海原
甲藻为对象，研究其在不同生长阶段、温度、光照
及氮源条件下的氨基酸氧化酶的活性大小及其变
化，比较其在不同生理状态与环境条件下对氨基酸
利用能力的差异，重点阐明赤潮藻的氨基酸氧化酶
活性与环境因子变化的关系，为揭示东海原甲藻赤
潮成因提供理论依据。

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 实验藻种及培养方法
试验藻种东海原甲藻（P. donghaiense）由暨南
大学水生生物研究中心藻种库提供。选取青霉素、
链霉素、卡那霉素和庆大霉素混合添加至藻液中，
最终浓度分别是 1000 IU、1000 IU、500 IU、500 IU。
定期用 2216E 培养基作细菌培养检测，直到无细菌
存在为止。对藻株进行传代培养以消除残留抗生素
的影响，实验过程均严格遵循无菌操作规则。
试验藻种于 LRH-400-G 光照培养箱中培养，培
养温度约为（23±1） ℃, 光照强度约为 100
µmol/(m2·s), 光暗比 12L:12D。基础介质为人工海水
（盐度为 30.5）[26]。选用无氮的 f/2 培养基[27]（氮
源另外添加）。
所有试验藻株都经过预培养：将指数生长期的
藻细胞离心，人工海水清洗，接种至低氮的 f/2 培
养基（氮源为丙氨酸，氮浓度为 3.5 μM）中培养一
周左右，再将藻细胞离心、清洗并转接到无氮的 f/2
培养基中培养 1-2 天，使藻细胞处于无氮状态。

2.2 实验设计
2.2.1 不同生长阶段东海原甲藻氨基酸氧化酶活性
的动态变化
将处于无氮状态的东海原甲藻接种于以 50 μM
丙氨酸为唯一氮源的 f/2 培养基中, 初始接种密度
为 9.0×105 cells/mL,根据细胞密度，每 24 h 取一定
量藻液，测定其 OD680及氨基酸氧化酶活性。
2.2.2 温度对东海原甲藻生长及氨基酸氧化酶活性
的影响
将东海原甲藻接种到以 50 μM 丙氨酸为唯一
氮源的 f/2 培养基中，等量分装至 250 ml 三角瓶中，
1 期 刘静雅，等. 生长阶段及环境因子对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响 29
培养液体积为 200 mL, 初始接种密度为 9.0×105
cells/mL ,将三角瓶分别置于温度为 15、20、25、30
℃的光照培养箱中培养（光照强度 100 µmol/(m2·s)，
光暗比为 12 h∶12 h）。每个处理设置 3 个重复。每
隔 24 h 取 5 mL 藻液观察，测定其 OD680 及其氨基
酸氧化酶活性。
2.2.3 光照强度对东海原甲藻生长及氨基酸氧化酶
活性的影响
将东海原甲藻接种到以 50 μM丙氨酸为唯一氮
源的 f/2 培养基中，等量分装至 250 mL 三角瓶中，
培养液体积为 200 mL, 初始接种密度分别为
9.0×105 cells/mL,将三角瓶分别置于光照强度为 2、
50、100 µmol/(m2·s)的光照培养箱中培养（温度为
（23±1）℃，光暗比为 12 h∶12 h）。每个处理设置
3 个重复。每隔 24 h 取 5 mL 藻液观察，测定其 OD680
及其氨基酸氧化酶活性。
2.2.4 不同氮源对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的
影响
将东海原甲藻接种到不添加氮源的 f/2 培养基
中，分装至 250 mL三角瓶中，培养液体积为 200 mL,
初始接种密度为9.0×105 cells/mL。分别添加NO3-N、
NH4-N、丙氨酸、硝氮-丙氨酸、氨氮-丙氨酸，使其
氮浓度均为 50 μM，每个处理设置 3 个重复。培养
条件为温度（23±1）℃，光照强度 100 µmol/(m2·s)，
光暗比为 12 h∶12 h。于指数生长期第 3 天将藻液
离心，人工海水清洗，再接种至以 50 μM 丙氨酸为
唯一氮源的 f/2 培养基中，隔 1 h 后取 5 ml 藻液，
测定氨基酸氧化酶活性。
2.2.5 氨基酸氧化酶活性的测定
以丙氨酸为氮源时，微藻细胞氨基酸氧化酶活
性的测定即丙酮酸浓度测定，采用改良的 2、4 二硝
基苯腙生成法[28]：取 2 mL 待测液，加入 1 mL 20 μM
的 Tris-HCl 缓冲液（pH8.2），混匀后再加入 0.3 mL2、
4 二硝基苯肼（0.2%（w/v））（溶于 2M 的 HCl 中）
和 0.5 mL 2M 的 NaOH，混匀后显色 10-15 分钟测
定波长 445 nm 处的吸光值。

2.3 数据处理
使用 Excel、Origin 7.5 和 SPSS 13.0 软件进行
数据统计分析。

3 结果（Results）
3.1 不同生长阶段东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的
变化特征
东海原甲藻加入丙氨酸后，细胞密度迅速增长，
第 8 d 即进入平台期(图 1)。培养期间，氨基酸氧化酶
活性呈现先下降后增高再下降的趋势。加入氮源 1 d
后，氧化酶活性出现第一个高峰，为 0.4 fmol/(h·cell)。
第 6 d 氧化酶活性达到最大，约为 0.49 fmol/(h·cell)。
方差分析结果表明，第 1 d 和第 6 d，东海原甲藻氨
基酸氧化酶活性显著高于其它时期的氧化酶活性
（P<0.05）。
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活
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•c
el
l)
OD680
酶活

图 1 生长阶段对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响
Fig.1 Effect of growth phase on amino acid oxidase activity
of P. donghaiense.

3.2 温度对东海原甲藻生长及氨基酸氧化酶活性的
影响
东海原甲藻在 4 个不同温度条件下均能快速
生长，且均检测出氨基酸氧化酶活性（图 2）。各
处理组在加入氮源后的第 3 d 和第 5 d 分别出现氨
基酸氧化酶活性高峰，其中，15 ℃和 20 ℃处理
组在第 3 d 的最大氧化酶活性（分别为 0.45 和 0.49
fmol/(h·cell)）比 25 ℃和 30 ℃处理组（分别为 0.18
和 0.2 fmol/(h·cell)）提高了 75%-125%。

3.3 光照强度对东海原甲藻生长及氨基酸氧化酶活
性的影响
在 2 µmol/(m2·s)1 光照条件下，细胞密度基本变
化不大。50 µmol/(m2·s)和 100 µmol/(m2·s)光照处理时，
东海原甲藻 1 d 后进入指数生长期，细胞密度迅速
增加，第 8 d 即进入平台期，两光强处理组生长无
明显差异（P>0.05），均显著高于 2 µmol/(m2·s)光强
处理组（P<0.01）。在试验所设的光强范围内，均检
生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 30
测出氨基酸氧化酶活性。加入氮源 1 d 后，酶活性
较高，均为 0.40 fmol/(h·cell)，随后酶活性基本呈现
先下降后上升再下降的趋势，在第 6 d 各处理组酶
活性达到最大值，其中光强为 100 µmol/(m2·s)时，酶
最大活性为 0.47 fmol/(h·cell)，光强为 50 µmol/(m2·s)
和 2 µmol/(m2·s)时，酶最大活性分别为 0.38 和 0.27
fmol/(h·cell)。平台期时，各处理组酶活性均逐渐降
低。结果表明，较高光照强度能促进东海原甲藻生
长及氨基酸氧化酶活性的提高。

A
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酶
活
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/(h
•c
el
l)

图 2 温度对东海原甲藻生长（A）及氨基酸氧化酶活性（B）
的影响
Fig. 2 Effect of temperature on growth（A） and amino acid
oxidase activity（B）of P. donghaiense.

东海原甲藻在以丙氨酸为唯一氮源时，其氨基
酸氧化酶活性最高，约为 0.44 fmol/(h·cell)；其次，
以 NO3-+丙氨酸为氮源时的酶活性较高，为 0.37
fmol/(h·cell)；NO3--N 和 NH4+-N 为唯一氮源时氧化
酶活性相接近，分别为 0.30 和 0.29 fmol/(h·cell)，
两处理组间没有显著差异（P>0.05）；NH4+-N+丙氨
酸处理组的氨基酸氧化酶活性最低，仅为 0.22
fmol/(h·cell)。结果表明，介质中存在氨基酸时，东
海原甲藻的氧化酶活性较高；但是 NH4+的存在，显
著抑制其氧化酶活性。

A
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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光照100
光照50
光照2


图 3 光照对东海原甲藻生长（A）及氨基酸氧化酶活性(B)
的影响
Fig.3 Effect of irradiance on growth (A) and amino acid
oxidase activity (B) of P. donghaiense.

3.4 氮源对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响









图 4 不同氮源对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响
Fig.4 Effect of nitrogen source on amino acid oxidase
activity of P. donghaiense.

4 讨论（Discussion）

4.1 不同生长阶段东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的
变化
不同生长阶段的浮游植物在其营养吸收及相关
酶活性等方面均有一定差异[29]。本研究显示，氮缺
乏的东海原甲藻细胞在刚加入大量丙氨酸后具有较
高氨基酸氧化酶活性，而且，在培养的第 6 d（指数

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0.05
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0
酶
活
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ol
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•c
el
l)
OD680 酶活
NO3- NH4 Ala NO3-+Ala NH4++Ala
1 期 刘静雅，等. 生长阶段及环境因子对东海原甲藻氨基酸氧化酶活性的影响 31
生长后期）酶活又出现一个高峰。这可能是由于培
养基中氮源耗尽而出现的酶活性的补偿性增长。由
此推测东海原甲藻细胞在氮浓度较低的条件下会启
动调控机制，提高氨基酸氧化酶活性进而促进氮源
的吸收。类似地，我们的前期研究证实，东海原甲
藻在指数生长初期具有最大脲酶活性[30]。但不同类
型酶的活性变化特征并不完全一致，如 Stoecker 等
发现，Alexandrium tamarense 和 Heterocapsa
triquetra 的亮氨酸氨肽酶（LAP）在指数生长期和
稳定期有较大活性[31]。因此，海洋微藻对不同类型
DON 的利用特性及其对环境因子的响应特征可能
具有很大差异性，有待进一步研究。

4.2 环境因子对海洋微藻氨基酸氧化酶的调控作用
温度是影响浮游植物生长、发育、繁殖和季节
分布的重要因素，而且对酶的活性、营养物的吸收
利用率及细胞分裂的周期等诸多方面都存在不同程
度的影响[32-34]。本研究结果表明，东海原甲藻在
15-20 ℃时，氨基酸氧化酶活性较高，但在 25-30 ℃
时，其酶活性较低，这与王金辉等（2003）的研究
结果较为一致，其分析了 2000-2002 年间东海原甲
藻赤潮爆发的现场理化因素，发现最适宜温度在
18-22 ℃，当水温超过 23 ℃，东海原甲藻种群迅速
衰退，中肋骨条藻成为优势种群[35]。研究显示，东
海原甲藻的脲酶活性在 15~70 ℃之间，随着温度的
升高而增强；当温度达到 80 ℃以后，脲酶活性才急
剧降低[30]；而本研究中，东海原甲藻的氨基酸氧化
酶活性在 20 ℃时，达到最大值，当温度达到 25 ℃
以后，其氧化酶活性随即大幅度降低。可能是相较
于热稳定性的脲酶，东海原甲藻的氨基酸氧化酶热
稳定性低，适于在低温发挥出最大活性。
浮游植物对光强的适应能力不仅决定其种间竞
争结果，而且影响其对营养的吸收[36]。例如，东海
原甲藻光补偿点较低，对低光强有更强的耐受力，
而 Cochlodinium polykrikoides,、Gyrodinium
instriatum 和 Akashiwo sanguinea 光补偿点高，在光
限制时则缺乏竞争力[4]。本研究发现东海原甲藻在
所设光强范围内，其氨基酸氧化酶活性与光照强度
成正相关，低光强（2 µmol/(m2·s)）时显著抑制氧化
酶的活性，高光强（100 µmol/(m2·s)）时，酶活性达
到最高。Muñoz-Blanco 等也有过类似研究，其发现
绿藻 Chlamydomonas reinhardtii 对氨基酸的脱氨作
用依赖于光照，尤其是对光不足（或黑暗环境）敏
感[37-38]。我们的前期研究显示，低光照（2 µmol/(m2·s)）
虽然显著抑制了东海原甲藻的生长，但其脲酶最大
活性仍能维持在 9.405 fmol·h-1·cell-1[39]，故相较于脲
酶，东海原甲藻的氨基酸氧化酶更依赖于光照。
浮游植物对氨基酸的氧化利用也受到周围氮源
的影响。本研究中，东海原甲藻在以丙氨酸为唯一
氮源时，其氨基酸氧化酶活性最高；而 NH4+-N 与
丙氨酸混合处理组的酶活性最低。研究结果表明，
介质中存在氨基酸时，东海原甲藻的氧化酶活性较
高。Mulholland 等于 2000 年 4-11 月观察美国长岛
Quantuck 湾褐潮藻 Aureococcus anophagefferens 的
氨基酸和氮吸收的季节变化，发现氨基酸的浓度在
夏末达到最高，相应的氨基酸氧化速率也最高，为
4.8±1.1 μM N/d，但在赤潮形成或消亡期时，氨基酸
浓度降低，其氧化率也仅为 0.22±0.27 μM N/d[40]。
本研究发现 NH4+的存在显著抑制东海原甲藻氨基
酸氧化酶的活性，这可能由于当 NH4+含量充足时通
过负反馈效应抑制了氨基酸氧化脱氨作用。有研究
报告指出，NH4+的添加阻止了绿藻 Chlamydomonas
reinhardtii 细胞氧化氨基酸，且相同条件下硝氮的
加入则不会影响氨基酸的吸收[38]。本研究也证实，
在 NO3--N 与丙氨酸混合氮源处理下，东海原甲藻
的氨基酸氧化酶活性均维持在较高水平。

5 结论(Conclusions)

东海原甲藻的氨基酸氧化酶活性不仅随生长阶
段发生规律性变动，而且受到温度、光照及氮源等
环境因素的调控作用。东海原甲藻适应较广的温度，
在 15 ℃-30 ℃温度范围均检测出氨基酸氧化酶活
性，低温时酶活较高。在 2-100 µmol/(m2·s)光照范
围内，其氨基酸氧化酶活性与光照强度呈正相关，
较高光照促进酶活的提高，但低光照时酶活也能维
持在 0.28 fmol/(h·cell)。氮源的组成对氨基酸氧化酶
活性具有显著影响，介质中存在氨基酸时氧化酶活
性较高，但是 NH4+的存在显著抑制其氧化酶活性。

生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 32
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