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Proteomic study of andrographolide analogue mediated protection on cell apoptosis induced by H2O2 in RIN-m beta cells

穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究


采用蛋白组学方法筛选穿心莲内酯衍生物(AL-1)抗过氧化氢诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的差异蛋白质分子并探讨其作用分子机制.结果显示:AL-1浓度依赖性地提高H2O2处理的胰岛RIN-mβ细胞的存活率.经蛋白组学研究分析,成功地鉴定了18个与凋亡、应激等相关的蛋白,包括Prohibitin、Shmt2、RhoGDP-dissociationinhibitor-1、Galectin-1、Cyt b5、Hsps等;与对照组(H2O2)相比,处理组(AL-1+H2O2)中,有9个表达上调的蛋白和9个表达下调的蛋白.AL-1通过调控与细胞凋亡、应激等相关的蛋白发挥其抗H2O2诱导的凋亡作用.

To screen the differential proteins invovled in andrographolide analogue (AL-1) against apoptosis induced by hedrogen peroxide (H2O2) in Rin-m beta cells and investigate its molecular mechanism with proteomics. The results showed that:The survival rate of cells treated by H2O2 were increased by AL-1 in a dose-dependent manner. With proteomics analysis, 18 proteins related to apoptosis, stress were successfully identified, such as Prohibitin, Shmt2, Rho GDP-dissociation inhibitor-1, Galectin-1, Cyt b5, Hsps, and so on. Among them, 9 proteins were found to be up-regulated and 9 down-regulated in the AL-1 treated group compared with control (H2O2) group. AL-1 protected Rin-m beta cells against apoptosis induced by H2O2 via regulating proteins associated with apoptosis, stress.


全 文 :周辉华,丁 文,贾红玲,等. 穿心莲内酯衍生物抗 H2O2 诱导胰岛 RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究[J]. 生态科学, 2010, 29(1):
080-084.
ZHOU Hui-hua, DING Wen, JIA Hong-ling, et al. Proteomic study of andrographolide analogue mediated protection on cell apoptosis
induced by H2O2 in RIN-m beta cells[J]. Ecological Science, 2010, 29(1):080-084.
穿心莲内酯衍生物抗 H2O2 诱导胰岛 RIN-mβ细胞凋亡
的蛋白组学研究
周辉华 1,丁 文 1,贾红玲 1,王玉强 2,晏光荣 1*
1. 暨南大学生命与健康工程研究院,广州 510632
2. 暨南大学药学院新药研究所,广州 510632
【摘要】 采用蛋白组学方法筛选穿心莲内酯衍生物(AL-1)抗过氧化氢诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的差异蛋白质分子并探讨
其作用分子机制。结果显示:AL-1浓度依赖性地提高H2O2处理的胰岛RIN-mβ细胞的存活率。经蛋白组学研究分析,成功地
鉴定了18个与凋亡、应激等相关的蛋白,包括Prohibitin、Shmt2、Rho GDP-dissociation inhibitor-1、Galectin-1、Cyt b5、Hsps
等;与对照组(H2O2)相比,处理组(AL-1+ H2O2)中,有9个表达上调的蛋白和9个表达下调的蛋白。AL-1通过调控与细胞
凋亡、应激等相关的蛋白发挥其抗H2O2诱导的凋亡作用。
关键词:穿心莲内酯衍生物 AL-1;H2O2;胰岛 RIN-mβ细胞株;双向凝胶电泳;蛋白质组学
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2010.01.014 中图分类号:Q257 文献标识码:A 文章编号:1008-8873(2010)01-080-005
Proteomic study of andrographolide analogue mediated protection on cell
apoptosis induced by H2O2 in RIN-m beta cells
ZHOU Hui-hua1, DING Wen1, JIA Hong-ling1, WANG Yu-qiang2, YAN Guang-rong1
1. Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2. Institute of New Drug Research, Jinan University College of Pharmacy, Guangzhou 510632, China
Abstract: To screen the differential proteins invovled in andrographolide analogue (AL-1) against apoptosis induced by hedrogen
peroxide (H2O2) in Rin-m beta cells and investigate its molecular mechanism with proteomics. The results showed that: The survival rate
of cells treated by H2O2 were increased by AL-1 in a dose-dependent manner. With proteomics analysis, 18 proteins related to apoptosis ,
stress were successfully identified, such as Prohibitin, Shmt2, Rho GDP-dissociation inhibitor-1, Galectin-1, Cyt b5, Hsps, and so on.
Among them, 9 proteins were found to be up–regulated and 9 down–regulated in the AL-1 treated group compared with control (H2O2)
group. AL-1 protected Rin-m beta cells against apoptosis induced by H2O2 via regulating proteins associated with apoptosis, stress.
Key words: andrographolide analogue (AL-1); H2O2; RIN-m beta cells; two-dimensional gel electrophoresis(2-DE); proteomics



收稿日期:2010-01-10 收稿,2010-02-20 接受
基金项目:广东省科技计划项目(2007B030701008)
作者简介:周辉华(1984—),男,硕士,主要从事蛋白组学研究 TEL:13265045687 E-mail:jnuzhh@163.com
*通讯作者:晏光荣(1977—),男,博士,副教授、硕士生导师,主要从事蛋白组学研究
E-mail:tgryan@jnu.edu.cn
第 29 卷 第 1 期 生 态 科 学 29(1): 080-084
2010 年 2 月 Ecological Science Feb. 2010

1 引言 (Introduction)
氧化损伤是细胞发生凋亡的一个重要原因[1]。胰
岛β细胞功能障碍是1、2型糖尿病发生的重要原因,
氧化损伤与胰岛 β细胞凋亡密切相关。因此抗氧化损
伤及抗凋亡对保护胰岛 β 细胞具有重要的意义,对
防治 1、2 型糖尿病有实际的临床应用价值。AL-1
是由穿心莲内酯和硫辛酸经过脱水缩合合成的一种
新药[2]。以前的研究报道[3]AL-1 不仅能增加 β细胞胰
岛素的分泌,葡萄糖的吸收,而且作为抗氧化剂清除
活性氧基团(ROS)达到保护 β细胞的作用。本研究
采用 2-DE、MALDI-TOF/TOF-MS 技术结合生物信息
学分析,对 AL-1 作用于 H2O2 诱导损伤的胰岛
RIN-mβ细胞和H2O2诱导损伤的RIN-mβ细胞进行了
蛋白表达差异谱的分析,从蛋白质水平系统认识
AL-1 保护 H2O2诱导损伤的胰岛 RIN-mβ细胞的分子
机制,为 AL-1 的临床应用提供实验依据。

2 材料和方法 (Materials and Methods)

2.1 材料
2.1.1 细胞株
胰岛RIN-mβ细胞株由暨南大学药学院王玉强教
授馈赠。
2.1.2 试剂与仪器
AL-1 由暨南大学药学院王玉强教授馈赠;硫脲、
CHAPS、碘乙酰胺(Sigma);固相 PH 梯度干胶条
(pH3-10 NL,13cm;) 、 IPG 缓 冲 液 (pH3-10 NL)
(Amersham Biosciences);胰蛋白酶(Promega);其
他试剂均为国产分析纯。IPGphor 等电聚焦仪、Ettan
DALT 垂直电泳槽、Image Scanner 扫描仪(GE);4800
MALDI-TOF/TOF 串联时间飞行质谱(ABI)。

2.2 方法
2.2.1 MTT检测细胞活力
胰岛 RIN-mβ 细胞培养于含 10%胎牛血清的
RPMI1640 培养基中,生长至对数期,胰酶消化后,以
每孔 1x104cell•L-1的细胞密度接种于 96 孔板。分别设置
空白对照(control),H2O2 模型组(400 μmol•L-1处理
4h),AL-1 单用组(1 μmol•L-1),AL-1 对抗组(H2O2+
不同浓度的 AL-1),每组至少 5 孔。药物 AL-1 于 37℃
孵育 1h 后,再加入终浓度为 400 μmol•L-1的 H2O2培养
4 h;每孔加入 5 g•L-1 MTT 10 μL,继续孵育 4 h,加入
100 μL二甲基亚砜(DMSO)终止,振荡 15 min,Bio-TEK
酶标分析仪 495 nm 波长处检测吸光度。以溶媒(DMSO)
对照组为 100% ,计算细胞存活率。细胞存活率(%)=
试验组光密度值/对照组光密度值×100%。
2.2.2 细胞总蛋白的提取
取对数生长期的胰岛 RIN-mβ 细胞,给药组加入
AL-1 预孵 1 h 后加入 400 μmol•L-1的 H2O2处理 4 h,
对照组加溶解液(DMSO)1 h 后,加入 400 μmol•L-1
的 H2O2处理 4 h。胰酶消化收集细胞,PBS 洗 3 次。
取细胞沉淀加入适量裂解液(7M 尿素, 2M 硫脲,
4%CHAPS,65mM DTT, lmM PMSF,0.5% IPG buffer),
混匀,涡旋后放冰上裂解 30 分钟。离心,取上清即
细胞总蛋白至新管。Bradford 法测定蛋白浓度。
2.2.3 双向凝胶电泳(2D)
取含 250 μg 的总蛋白液加入水化液至总体积
250 μL,加入 IPGstrip 胶条槽中。在以下条件中进行电
泳: 30V12h, 500V1h,1000V1h ,8000V8h 下进行等电
聚焦( isoelectric focusing, IEF)。IEF 后干胶条经两步
平衡转入第二向 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)。
2.2.4 银染、图像分析和差异表达蛋白质酶解和
MALDI-TOF/TOF串联时间飞行质谱鉴定
将 2DE 胶用固定液固定 2 个小时,加入敏化液
在脱色摇床上摇 30 min 后;用双蒸水漂洗 3 次;加
入银染液,临用前加 37%甲醛 100 μL摇振 30 min;
加入显色液,临用前加37%甲醛50 μL显色5-10 min;
加入终止液终止显影。所有的分析胶均用 Image
Scanner扫描仪扫描。然后用 ImageMaster 2D Platinum
进行图像分析。根据图像分析结果,获取有 2 倍差异
的蛋白点作为候选鉴定的蛋白。
目标胶点用去离子水洗一遍,加入脱色液
[30 mmol•L-1 K3Fe(CN)6 : 100mmol•L
-1 Na2S2O3=1:1]
脱色后,用 25 mmol•L-1的 NH4HCO3 使凝胶吸胀;
用乙腈脱水,加入胰蛋白酶进行酶解;萃取,冻干,
点样质谱分析鉴定。
2.2.5 统计学方法
采用 SPSS11.0 软件进行统计分析,两组间比较
采用 t 检验, P﹤0.05 表示有统计学意义。

3 结果与分析 (Results and Analysis)

3.1 MTT检测细胞的存活率
MTT试验表明,H2O2组加入 400μmol•L-1的H2O2
1 期 周辉华,等:穿心莲内酯衍生物抗 H2O2 诱导胰岛 RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究 081

后,胰岛细胞的活力显著下降,与空白对照组相比有
显著的差异(p<0.05)。加入 AL-1 组的细胞存活率与
H2O2 组相比,细胞存活率有明显的提高(p<0.05);
并且成浓度依赖性。表明 AL-1 对 H2O2 引起的
RIN-mβ细胞凋亡有保护作用。结果见图 1。

图 1 AL-1 对细胞生存率的影响 # P<0.05 H2O2VS.control﹡
P<0.05 AL-1+ H2O2VS.H2O2
Fig.1 Influence of AL-1 on cell survival rate

3.2 细胞总蛋白的 2-D 图谱分析
在相同条件下对处理组(AL-1+ H2O2)和对照组
(H2O2)细胞样品进行 3 次双向电泳实验,2-DE 图
谱重复性较好。应用 ImageMaster 2D Platinum 软件分
析,找到 1128 个匹配蛋白斑点,结果见图 2。在 3
次重复中出现 2 倍以上差异点的蛋白有 62 个,上调
有 26 个,下调有 36 个。
3.3 差异蛋白质点的鉴定
选取部分差异蛋白质点(≧2倍)经切割、胰蛋
白酶消化后, 用MALDI-TOF/TOF鉴定。经鉴定,得
到了18种不同的差异表达蛋白,其中包括9个表达上
调的蛋白和9个表达下调的蛋白。结果见表1,其中发
现了多个与凋亡、应激相关的蛋白如:Prohibitin、
Shmt2、Rho GDP-dissociation inhibitor-1、Galectin-1、
Cyt b5、Hsps等。这些差异蛋白质分子的发现,为下
一步阐明AL-1通过抗氧化、抗凋亡保护细胞的分子
机制提供有意义的线索。

3.4 差异表达的蛋白质与 AL-1 抗凋亡的关系
本实验比较并鉴定了一组 AL-1+ H2O2/ H2O2 间
差异表达的蛋白质。在 AL-1 处理中上调的蛋白有 9
个,下调的蛋白有 9 个。其中与细胞凋亡、应激等有
关的蛋白有 Prohibitin、Shmt2、Rho GDP-dissociation
inhibitor-1、Galectin-1、Cyt b5、Hsps 等,这些蛋白
质分子可能参与了AL-1抗H2O2诱导的细胞凋亡过程。
Prohibitn 蛋白是一类新型的分子伴侣,不仅参与
抗细胞凋亡、衰老,而且具有转录调控、维持线粒体
结构和功能的作用。Liu 等[4]发现 prohibitin 能保护心
肌细胞免受氧化损伤。该蛋白经 AL-1 预处理后,再
用 H2O2处理比直接用 H2O2 损伤的细胞表达量上调。
推测由于 prohibitin 的上调,细胞膜的稳定性增加,
抵抗 H2O2 对细胞膜的损伤作用,抑制了细胞的凋亡。

图 2 RIN-mß细胞全蛋白差异蛋白质点(pH3-10 NL)
Fig.2 The differential protein spots of RIN-mß whole protein
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
-
-
-
1
+
-
+
0.01
+
0.1
+
1





%


C
e
ll
V
ia
b
il
it
y
(%
)
H202(400μmol/L)
AL-1(μmol/L)
MTT
﹡ ﹡


的浓度 The Concentration of Drug(µmol/L)
082 生 态 科 学 Ecological Science 29 卷

L!二_一 Eh。目t镕&一
陬iii订 ’\、二三2手三—].—H}n镕*$卜———————、、L!竺竺!二二!竺型
Ncmc‘
表1 质谱鉴定的差异蛋白质结果与分类
Table 1 The results and classifications of the differential proteins identified by mass spectrometry
Spot
No.


蛋白名称(Protein Name).②
Accession
No.


蛋白分子量
(Protein MW)
蛋白等电点
(Protein PI)
Protein
Score
F.D.


线粒体(Mitochondria)
1 ATP synthase subunit beta IPI00468481 56265.5 5.19 98 3.59
2 Cytochrome b5 IPI00230113 15231.5 4.96 136 -3.33
3 Prohibitin IPI00133440 29801.9 5.57 222 2.9
4 Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial precursor IPI00114209 61298.2 8.05 85 -2.57
5 heat shock protein 9 IPI00880839 73415.6 5.81 235 2.34
6
Isoform 1 of 60kDa heat shock protein,
mitochondrial precursor
IPI00308885 60917.4 5.91 279 2.03
7 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1 IPI00013847 52612.4 5.94 191 -2.01
内质网(endoplasmic reticulum)
8 78 kDa glucose-regulated protein precursor IPI00319992 72377.5 5.07 346 3.9
细胞骨架和其它组份(cytoskeleton and others)
9 Rho GDP-dissociation inhibitor 1 IPI00322312 23392.8 5.12 135 3.49
10 Galectin-1 IPI00229517 14856.2 5.32 71 -6.2
11 Elongation factor 2 IPI00466069 95252.9 6.41 74 -9.5
12 Beta-actin IPI00110850 41709.7 5.29 186 4.42
13
Isoform 3 of Programmed cell death
6-interacting protein
IPI00323483 96698.5 6.15 70 -3.4
14 Glycyl-Trna synthetase IPI00112555 81825.7 6.24 134 -2.9
15 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H IPI00133916 49168.4 5.89 75 2.6
16 Anxa2 20 kDa protein IPI00885367 19584.1 5.68 62 -2.58
17 Serine hydroxymethyltransferase IPI00454008 55725.6 8.72 94 2.48
18 Aldose reductase IPI00223757 35709.4 6.71 67 -2.28
①.Spot NO. 为图 2 上点的编号。②. Protein Name 来源于 IPI_mouse 数据库。③. Accession NO.来源于 IPI_mouse 数据库。④. F.D.
是指 AL-1 预孵后再经 H2O2 处理的 RIN-mβ细胞和经 H2O2 处理的 RIN-mβ细胞之间的差异倍数。正值表示蛋白在 AL-1 处理的
RIN-mβ细胞中表达上调;负值表示蛋白在 AL-1 处理的 RIN-mβ细胞中表达下调。


图3 AL-1对RIN-mβ细胞氧化损伤保护作用的可能机理图
Fig.3 The illumination of AL-1’s protective effect on endothelial cells

Serine hydroxymethyltransferase(Shmt2)是一种
吡哆醛酶,它能够催化丝氨酸和四氢叶酸转化为甘氨
酸和 5-l0-亚甲基四氢叶酸。四氢叶酸能为嘧啶和嘌
呤的合成提供一碳原子, 通过影响DNA 的合成以及
通过 DNA 修复来保持 DNA 的完整性。四氢叶酸
缺乏则会导致 DNA 损伤, 使 DNA 单链或双链发生
断裂或者氧化损伤[5]。该蛋白经 AL-1 预处理后再用
H2O2 处理比 H2O2 处理表达量上调。可见,AL-1 通
过增加细胞中四氢叶酸的水平,阻止了 DNA 的氧化
损伤,抑制了细胞的凋亡。
Rho 是一个小 G 蛋白家族,小 G 蛋白平时结合于
GDP dissociation inhibitor 上,处于非活化状态。而当
有外界刺激时,小 G 蛋白活化,激活下游的激酶
PKC,ROCK1,ROCK2 等。有研究[6]表明氧化压力可以
1 期 周辉华,等:穿心莲内酯衍生物抗 H2O2 诱导胰岛 RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究 083

激活 Rho 路径,而抑制 Rho 路径可以起到氧化损伤
的保护作用[7]。 AL-1 预作用于细胞,使细胞内 Rho
途径的自身的抑制 蛋白 Rho GDP-dissociation
inhibitor-1 表达量上调,从而有助于抑制 Rho 信号转
导路径来保护细胞。
Galectin-1 属于 β半乳糖苷结合蛋白家族。它可
以启动 T 细胞的凋亡程序,其介导的 T 细胞凋亡信
号转导通路涉及 Bcl-2 蛋白生成的调节,细胞色素 c
的释放,半胱天冬酶的激活等[8]。AL-1 预处理后再
用 H2O2处理比 H2O2 处理下调,说明 AL-1 有助于启
动抗凋亡程序阻止细胞的凋亡。Cytochrome b5 (Cyt
b5 )是一种含有血红素辅基的金属蛋白。研究发现,
它在细胞凋亡中存在着一定的作用[9]。AL-1 预处理
后再用 H2O2处理比 H2O2处理下调,可能有助于胰岛
RIN-mβ细胞免受氧化作用的毒害。
Heat shock proteins(HSPs)是一类结构上高度
保守的蛋白质,重要的抗凋亡蛋白。HSPs 在肿瘤细
胞中过度表达,对抑制肿瘤细胞凋亡发挥着重要的作
用[10-11]。Hspa9,Hsp60 在 AL-1 预处理后再用 H2O2
处理比 H2O2处理均上调,有助于减轻 H2O2导致的损
伤。其可能的机制是通过抑制线粒体通路介导的细胞
凋亡,即可能抑制细胞色素 C、凋亡诱导因子 AIF 等
从线粒体释放,还可能抑制死亡受体(Fas 受体)通
路介导的细胞凋亡。Hspa5 作为内质网行使功能的一
个中心调控子,在维持细胞正常运转的过程中起着极
为重要的作用。Hspa5 可与 caspase-7 和 caspase-12 等
前体 caspase 结合,其表达的增强可视为一种临时的细
胞保护防御机制[12]。Hspa5在AL-1预处理后再用H2O2
处理比 H2O2处理上调,可以抗 H2O2导致的损伤。

4 小结 (Conclusion)

本研究表明穿心莲内酯衍生物(AL-1)对H2O2诱
导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡有保护作用,基于蛋白组
学技术研究发现的凋亡相关蛋白质分子,推测这种保
护作用的可能机制如图(3)。

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084 生 态 科 学 Ecological Science 29 卷

穿心莲内酯衍生物抗H2O2 诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究
作者: 周辉华, 丁文, 贾红玲, 王玉强, 晏光荣, ZHOU Hui-hua, DING Wen, JIA Hong-ling, WANG Yu-
qiang, YAN Guang-rong
作者单位: 周辉华,丁文,贾红玲,晏光荣,ZHOU Hui-hua,DING Wen,JIA Hong-ling,YAN Guang-rong(暨南大学生命与健康
工程研究院,广州,510632), 王玉强,WANG Yu-qiang(暨南大学药学院新药研究所,广州,510632)
刊名: 生态科学
英文刊名: ECOLOGICAL SCIENCE
年,卷(期): 2010,29(1)

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2007(04)

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酰基-12-氨基亚甲基-14-脱氧穿心莲内酯衍生物的合成及其抗肿瘤活性[期刊论文]-中国药科大学学报2005,36(6)
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