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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):166-170
1930 年，Tillett 和 Francis 首次在急性大叶性肺
炎患者的血清中发现了一种能够在 Ca2+ 存在时与肺
炎球菌细胞壁中的 C-多糖发生特异性沉淀反应的物
质，1941 年，Avery 等测知它是一种蛋白质，故称
其为 C 反应蛋白（CRP）。之后，人们在非感染性疾
病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了 CRP，
收稿日期 ：2015-05-20
基金项目 ：国家重点研发计划（2012BAI19B05）
作者简介 ：李江峰，硕士研究生，研发工程师，研究方向 ；E-mail ：lijiangfeng511@163.com
通讯作者 ：才蕾，博士，E-mail:leicai@wondfo.com.cn
人 C 反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及
免疫反应性分析
李江峰  矫丽媛  赵晓妮  王继华  才蕾
（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510660）
摘 要： 构建人 C 反应蛋白（CRP）原核表达载体，并分别将其转化进入 E.coli BL21（DE3）和 Rosetta gami 2（DE3）pLysS 中，
诱导 CRP 重组蛋白的表达 ；主要运用了基因工程，亲和层析及透析复性等方法。成功构建了 CRP 原核表达载体及菌株。经 IPTG
诱导后，得到了不同的重组 CRP 蛋白。结果表明，相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别，分别在大肠杆菌及
Rosetta gami2（DE3）pLysS 中表达并得到了重组 CRP 的包涵体，对复性后的 CRP 重组蛋白进行 Westen blotting 及 ELISA 检测，结
果表明原核表达的重组 CRP 蛋白的免疫反应性很低，CRP 蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。
关键词 ： C 反应蛋白 ；原核表达 ；包涵体 ；复性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.026
The Expression and Immunoreactive Analysis of Recombinant Human
C-reactive Protein in Different Prokaryotic Expression Vectors and
Strains
LI Jiang-feng JIAO Li-yuan ZHAO Xiao-ni WANG Ji-hua CAI Lei
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510660）
Abstract: The prokaryotic expression vector of human C-reactive protein（CRP）was constructed and transferred into Escherichia coli
BL21（DE3）and Rosetta gami2（DE3）pLysS，respectively，and then these recombinant strains were induced for the expression of CRP.
Mainly gene engineering，affinity chromatography and dialysis refolding methods were employed. The expression vectors and recombinant
strains of human CRP were constructed successfully，and the varied CRPs with different protein tags were acquired by IPTG. In conclusion，
expressions of the same vector in different strains differed ；it expressed in the E. coli BL21（DE3）and Rosetta gami2（DE3）pLysS
respectively，and the inclusion bodies of recombinant CRP were obtained. The results of detecting the refolded recombinant CRP by Western
blotting and ELISA revealed that the immunoreactivity of recombinant CRP in the prokaryotic expression vector was low，and CRP may have the
immunoreactivity while it is in the pentamer form.
Key words: C-reactive protein ；prokaryotic expression ；inclusion bodies ；refolding.
2016,32(3) 167李江峰等：人 C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析
其中 CRP 是急性期蛋白中变化最为显著的一种。
CRP 在正常人血清中其含量极微，在组织受到损伤、
炎症、感染或肿瘤破坏时 CRP 可以在数小时内急剧
上升，CRP 因此被广泛应用于临床疾病的早期预判
及鉴别诊断［1］。
人源 CRP 蛋白为同源五聚体结构，每个单体
都具有 224 个氨基酸，由信号肽酶切除掉位于 N 端
的 18 个氨基酸后成为成熟形式，成熟的人源五聚体
CRP 分子量约为 125 kD［2，3］。CRP 在临床疾病的诊
断及预防中具有重要的作用，近年来有关人 CRP 蛋
白临床研究已成为热点，重组人 CRP 蛋白的研究也
有报道［4，5］。本研究基于 CRP 的临床应用价值，利
用多种表达载体及菌株，对重组人 CRP 蛋白（rhCRP）
的原核表达及免疫学性能进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料
菌 株 ：E.coli DH5α，BL21（DE3） 及 Rosetta
gami2（DE3）pLysS ；原 核 表 达 载 体 ：pET28a（5
369 bp，His-tag），pET32a（5 900 bp，Trx-His-
tags），pET41a（5 933 bp，GST-His-tags），pCold1（4
407 bp，His-tag）；限制性内切酶 BamH I，Hind III
（TaKaRa），人源 CRP 蛋白（Fitzgerald）；Ni-NTA 树
脂（GE）；捕获抗体为鼠源 CRP 单克隆抗体 mAb1
及 mAb2，检测抗体抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗
鼠 CRP 单克隆抗体。
1.2 方法
1.2.1 CRP 原核表达载体的构建及鉴定 利用核酸
序列分析软件（DNAstar）对 crp 基因进行核苷酸序
列的优化，并去掉信号肽序列，使其易于在大肠杆
菌中进行表达［6］，在优化后的 crp 序列两端加上合
适的限制性酶切位点（BamH I，Hind III），并合成
无信号肽的 crp（618 bp）核苷酸序列，将其插入到
原 核 表 达 载 体 pET28a、pET32a、pET41a 及 pCold1
中。CRP 核酸序列在 3 端带有终止密码子，因此没
有选取 Nco I 作为 5 端的酶切位点，以保留 5 端的
His 标签，为了构建的方便，其余载体也都用 BamH
I 和 Hind III 作为酶切位点。为了消除蛋白质标签对
复性后 rhCRP 活性的影响，本研究对 pCold1 重组表
达载体进行了进一步的改造，得到无 His-tag（命名
为 nh）的重组表达载体 pCold-crp（nh），使得 rhCRP
（与人源 CRP 相比仅在 N 端多出两个氨基酸，即
BamH I 酶切位点编码的甘氨酸和丝氨酸）分子量大
小接近于人体内成熟形式的 CRP 单体。将构建好的
原核表达载体分别转化进入 E.coli DH5α 中，抗性筛
选得到阳性克隆，提取质粒进行鉴定。
1.2.2 CRP 在大肠杆菌中的诱导表达 将鉴定为阳
性的重组表达载体分别转化进入 E.coliBL21（DE3）
和 Rosetta gami2（DE3）pLysS 中；在不同的温度（携
带有 pCold1 重组表达载体的菌株于 20℃进行诱导
表达［7］，其他的菌株于 20-37℃进行诱导表达）及
IPTG 浓度（0.25 mmol/L，0.5 mmol/L）下对各表达
菌株进行培养及诱导，分析 CRP 重组蛋白在各个菌
株之中的表达情况。其中，载体 pET28a、pET32a、
pET41a 及 pCold1 对应的重组蛋白形式分别为 ：His-
CRP（ 约 27 kD），Trx-His-CRP（ 约 40 kD），GST-
His-CRP（ 约 48 kD） 和 His-CRP（ 约 27 kD），Trx、
GST 及 His 标签均位于重组蛋白的 N 端。
1.2.3 rhCRP 的纯化及复性 对各重组表达菌株进
行诱导培养，收集菌体，超声破碎后得到各 rhCRP
的包涵体。对包涵体进行洗涤，用 8 mol/L 尿素进行
溶解，利用亲和层析的原理，通过 Ni 柱对 CRP 重
组蛋白进行纯化。选择合适的透析复性液对纯化后
的 rhCRP 进行透析复性，复性的过程均在低温下进
行（2-8℃）［8，9］。
1.2.4 对复性后的 rhCRP 进行免疫反应性检测 选
用鼠源单克隆抗体及 HRP 标记的二抗（羊抗鼠），
并分别用 Western blotting 和 ELISA 等免疫学方法对
复性后的重组 CRP 蛋白及天然状态的人源 CRP 蛋
白进行体外免疫反应性检测。比较免疫反应的结果，
分析重组和天然 CRP 蛋白在免疫学活性方面的区别。
2 结果
2.1 CRP原核表达载体的构建及鉴定结果
利用基因工程方法将连接产物转化进入克隆
菌株 DH5α 中，经 LB 抗性板筛选，挑取并培养阳
性 DH5α 重组菌株，提取质粒进行酶切鉴定（图
1）。由图 1 可知，利用基因工程方法成功得到重组
原 核 表 达 载 体 pCold1-crp、pET28a-crp、pET32a-crp
和 pET41a-crp。将这些表达载体分别转化进入 E.coli
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3168
BL21（DE3） 及 Rosetta gami2（DE3）pLysS 中， 经
抗性筛选后得到相应的重组表达菌株。
2.2 CRP重组蛋白在各个原核表达菌株中的诱
导、表达情况分析
分别携带有重组表达质粒 pCold1-crp、pET28a-
crp、pET32a-crp 或 pET41a-crp 的原核表达菌株 BL21
（DE3） 和 Rosetta gami2（DE3）pLysS 在 经 过 LB
培 养 基 及 IPTG 诱 导 后， 菌 体 被 用 来 进 行 SDS-
PAGE 分 析（ 图 2-A，2-B）。 从 SDS-PAGE 分 析 可
知，rhCRP 蛋白可以在菌株 BL21 pCold1-crp，BL21
（DE3）pET32a-crp 及 BL21 pET41a-crp 中 表 达， 而
在 BL21 pET28a-crp 中则没有明显可见的表达 ；在菌
株 Rosetta gami 2（DE3）pLysS pCold1-crp 和 Rosetta
gami2（DE3）pLysS pET32a-crp 中有明显的表达，而
在 Rosetta gami2（DE3）pLysS pET28a-crp 和 Rosetta
gami2（DE3）pLysS pET-41a-crp 中 则 没 有 明 显 可
见的表达。并且，菌株 BL21（DE3）pCold1-crp 和
Rosetta gami2（DE3）pLysS pCold1-crp 在没有诱导的
情况下（图 2-A），重组 CRP 蛋白有微量的本底表达，
这一点也通过使用 HRP 标记的 6×His 标签抗体借
助 Western blotting 检测方法得到验证（图 2-C）。
通过降低培养温度温度（37℃、25℃、20℃）
及 IPTG 浓度（1、0.5 和 0.25 mmol/L）等对诱导条
件进行优化，发现低温及低诱导剂浓度下，CRP 重
组蛋白仍以包涵体的形式存在，并且由于低温条件
下菌体生长缓慢，菌体产量减少，菌株 BL21（DE3）
pET32a-crp 及 BL21 pET41a-crp 中 的 重 组 CRP 蛋 白
的表达量有所降低。
利用相同的方法将重组表达载体 pCold1-crp（nh）
转化进入 BL21（DE3）中，LB 板抗性筛选得到阳性
克隆菌株 BL21（DE3）pCold1-crp（nh），经诱导后
成功得到无 His 标签的 rhCRP 蛋白（图 3-A）。
2.3 CRP重组蛋白的纯化、复性及免疫反应性
分析
由于重组菌株 Rosetta gami2（DE3）pLysS 的生
bp
5000
3000
2000
1000
500
250
100
1 2 3 4 M 5
618
bp
1-5 ： 分 别 为 质 粒 pCold1-crp，pET28a-crp，pET32a-crp，pET41a-crp 和
pCold1-crp（nh） 经 过 BamH I 和 Hind III 酶 切 后 得 到 的 结 果 ；M ：DNA
marker
图 1 CRP 重组菌株的酶切鉴定结果
kD
116
66.4
45
35
25
MA
B
C
M1 2 3 4 5 6 7 8
kD
66.4
45
35
25
M
kD
118
62
49
38
28
M 9 10
M1 2 3 4 5 6 7 8
A ：未加 IPTG 进行诱导的菌株的菌体总蛋白分析（为对照组）；B ：加 IPTG
进行诱导的菌株的菌体总蛋白分析 ；C ：未经 IPTG 诱导而表达 rhCRP 的菌
株的 Western blotting 检测结果 ；1-4 ：E.coliBL21（DE3）重组菌株，携带的
重组表达载体分别为 pCold1-crp、pET28a-crp、pET32a-crp、pET41a-crp；5-8：
Rosetta gami 2（DE3）pLysS 重组菌株，携带的重组表达载体分别为 pCold1-
crp，pET28a-crp（nsp），pET32a-crp），pET41a-crp；9：菌株 E.coli BL21（DE3）
pCold1-crp 未经诱导 ；10 ：菌株 Rosetta gami 2（DE3）pLysSpCold1-crp 未经诱
导 ；M ：蛋白质 marker。箭头所示为目的蛋白
图 2 CRP 蛋白在不同载体及菌株中表达情况的 SDS-
PAGE 分析
2016,32(3) 169李江峰等：人 C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析
长 周 期 要 长 于 BL21（DE3）， 故 选 取 BL21（DE3）
重组表达菌株进行诱导培养。收集菌体并进行超声
破碎，对得到的包涵体进行洗涤（3 次或以上），溶
解于 8 mol/L 尿素后用 Ni 柱进行纯化。菌株 BL21
（DE3）pCold1-crp（nh）表达的重组 CRP 蛋白由于
不具有 His 标签，故对包涵体进行多次洗涤，以便
得到纯度较高的重组蛋白。用 SDS-PAGE 对纯化后
的重组蛋白进行了分析（图 3-A）。
人源 CRP 蛋白发生结合，而不能同 Western blotting
中经煮沸变性处理后失去高级结构的目的蛋白（人
源 CRP）结合，表明实验中使用的单克隆抗体所针
对的 CRP 抗原表位是构像表位，而不是线性表位。
A
kD
116
66.4
45
35
25
M B
kD
125
1 2 3 4 51 2 3 4
A ：对纯化后的重组 CRP 蛋白进行 SDS-PAGE 检测，其中 1 ：从 BL21（DE3）
pCold1-crp（nh）中分离纯化的重组 CRP 蛋白（无 his 标签），2：从 BL21（DE3）
pCold1-crp 中分离纯化的重组 His-CRP 蛋白，3 ：从 BL21（DE3）pET32a-crp
中分离纯化的重组 Trx-His-CRP 蛋白，4 ：从 BL21（DE3）pET41a-crp 中分
离纯化的重组 GST-His-CRP 蛋白，M ：蛋白质 marker。B ：对透析复性后的
重组 CRP 蛋白进行非变性 PAGE 检测，其中 1 ：人源 CRP 五聚体蛋白，2 ：
重组 CRP 蛋白（无 his 标签），3 ：重组 His-CRP 蛋白，4 ：重组 Trx-His-CRP
蛋白，5 ：重组 GST-His-CRP 蛋白
图 3 重组 CRP 蛋白的纯化（A）及复性后的检测（B）
由图 3-A 可知，纯化后得到的各种 rhCRP 蛋白
所携带的蛋白质标签不一样，表现出不同的分子量
大小。对纯化后的 rhCRP 进行透析复性，得到了可
溶的 rhCRP 蛋白。利用人源 CRP 蛋白（五聚体结
构）作为对照，对复性后的各种重组人 CRP 蛋白进
行了非变性 PAGE 电泳分析（Native-PAGE，图 3-B）
和免疫反应性分析。Native-PAGE 结果显示复性后
的 rhCRP 形成多聚体结构，其聚集程度远高于天然
状态的 CRP 五聚体结构。Western blotting 结果（图
4）显示，CRP 单克隆抗体（mAb1 及 mAb2）均不
能同包括天然人源 CRP 蛋白在内的各种 CRP 重组
蛋白发生免疫反应，而 ELISA 结果显示单克隆抗体
mAb1 及 mAb2 能够同人源 CRP 蛋白发生较强免疫
反应，而与复性后的 rhCRP 蛋白几乎没有免疫反应。
另外，单克隆抗体能够同 ELISA 中未经变性处理的
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0
O
D
45
0
O
D
45
0
CRP㳻ⲭ⎃ᓖμg·mL-110-2 10-1 100 101 102
0
CRP㳻ⲭ⎃ᓖμg·mL-110-2 10-1 100 101 102
a
b
c
d
e
a
b
c
d
e
A
B
系列 a ：人源 CRP 蛋白 ；b ：重组 CRP 蛋白（无 his 标签）；c ：重组 His-
CRP 蛋白 ；d ：重组 Trx-His-CRP 蛋白 ；e ：重组 GST-His-CRP 蛋白。鼠源单
克隆抗体的工作浓度均为 1 μg/mL
图 4 使用鼠源单克隆抗体 mAb1（A）和 mAb2（B）对
重组 CRP 蛋白复性后的 ELISA 检测结果
3 讨论
本研究基于基因工程手段和原核表达的方法利
用 大 肠 杆 菌 BL21（DE3） 和 Rosetta gami2（DE3）
pLysS 成功表达出重组人 CRP 蛋白。对表达结果进
行分析后发现，重组 CRP 蛋白在不同的表达载体和
菌株中的表达情况及表达量是有差别的［10，11］。其
中，在宿主 BL21（DE3）中利用 pET32a 作为表达
载体得到的重组 CRP 蛋白的表达量要高于以 pCold1
和 pET41a 作为表达载体的表达量，这可能是由不同
的表达载体所具有的蛋白质标签或启动子的不同所
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造成的［12，13］；另外，从分析结果可知当以 pET41a
作为表达载体时，重组 CRP 蛋白只能在 BL21（DE3）
中进行表达而不能在 Rosetta gami2（DE3）pLysS 菌
株中进行表达，由此可知，在进行原核表达时表达
菌株的选取也能影响重组蛋白的表达［14］。
在对重组 CRP 蛋白包涵体进行透析复性的过
程中，一些有利于蛋白质保持结构稳定，促进其正
确折叠的试剂被使用，如 L-精氨酸、DTT、GSSG、
GSH、甘油及一些盐离子等，这些试剂的使用是
影响蛋白质折叠和得到可溶性 CRP 重组蛋白的关
键因素之一。另外，合适的 pH 环境对于包涵体的
复性也很重要［15，16］。使用鼠源单克隆抗体 mAb1
和 mAb2 对复性后的重组 CRP 蛋白进行的 Western
blotting 检测结果表明这两个抗体所针对的不是线性
表位，对 ELISA 检测结果进行分析后发现，相对于
天然人源 CRP 蛋白，重组 CRP 蛋白同样不具有免
疫活性，而人源 CRP 蛋白则能够同鼠源单克隆抗
体发生免疫反应。由此说明，单克隆抗体 mAb1 和
mAb2 针对的是 CRP 的构象表位，而复性后的 CRP
重组蛋白不能够进行正确的折叠及形成正确的五聚
体结构。非变性 PAGE 电泳分析结果也表明，复性
后 CRP 重组蛋白的聚集程度要高于人源 CRP 的五
聚体结构，并且由菌株 BL21（DE3）pET32a-crp 分
离纯化得到的重组 CRP 蛋白在经过复性后出现不同
程度的聚集。透析复性的结果说明在体外进行类似
于 CRP 蛋白这种多聚体蛋白的复性具有较高的难度，
而其它重组 CRP 蛋白所具有的蛋白质标签也可能在
较大程度上影响了 CRP 五聚体结构的正确形成。总
之，重组 CRP 蛋白不具备免疫活性一方面主要和复
性后的空间结构有关 ；另一方面，原核生物不具备
真核生物蛋白质翻译后加工修饰的功能，这也是造
重组 CRP 蛋白活性缺失的一个重要原因。
4 结论
成功对人 CRP 蛋白进行了原核表达，得到重组
CRP 蛋白的包涵体，但复性后的包涵体与天然人源
CRP 相比不具备五聚体结构，在体外缺失与特定抗
体的免疫反应性。
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（责任编辑 李楠）