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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):251-255
豆酱又称黄豆酱、黄酱或大豆酱，是以大豆为
主要原料，经过自然发酵而成的半流动状态的发酵
食品［1］。我国制酱的历史久远，起源于我国的制酱
工艺早已普及到韩国、日本、印度尼西亚等东南亚
国家和地区。东北作为我国大豆的主产区，其大豆
年产量占全国总产量的 50% 左右，东北传统豆酱的
收稿日期 ： 2015-07-30
基金项目 ：北京市教委面上项目（KM201310020010）
作者简介 ：高秀芝，女，博士，副教授，研究方向 ：食品微生物 ；E-mail ：gxz@bac.edu.cn
通讯作者 ：崔宗均，男，教授，研究方向 ：微生物分子生态学 ；E-mail ：acuizj@cau.edu.cn
东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性
高秀芝1  易欣欣1  刘慧1  王晓东1  崔宗均2
（1. 北京农学院食品科学与工程学院 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室 食品质量与安全北京实验室，北京
102206 ；2. 中国农业大学农学与生物技术学院 中国农业大学生物质工程中心，北京 100193）
摘 要 ： 以东北传统发酵豆酱为研究对象，分析豆酱发酵过程中微生物群落的动态变化。分别选择发酵豆酱 0、35、65、75
和 105 d（成品豆酱）作为研究材料，通过 PCR-DGGE 分析微生物多样性，检测了豆酱发酵过程中蛋白质和氨基酸态氮的变化。结
果表明，豆酱发酵过程中主要优势细菌为芽孢杆菌和乳酸菌，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、
地衣芽孢杆菌的近缘种等 ；主要乳酸菌为乳球菌、明串珠菌、魏斯氏菌等种属细菌的近缘种 ；东北豆酱发酵过程中优势真菌为米
曲霉、散囊菌和谢瓦氏曲霉的近缘种，随发酵时间延长数量逐渐减少 ；粗蛋白相对含量先略有平稳上升后下降，最后成品酱粗蛋
白含量下降为 24.76％ ；氨基态氮含量一直在增加，成品酱中为 101.2 g/kg。
关键词 ： PCR-DGGE ；传统发酵豆酱 ；微生物多样性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.034
Microbial Diversity of Traditional Soybean Paste During Fermentation
in Northeastern China
GAO Xiu-zhi1 YI Xin-xin1 LIU Hui1 WANG Xiao-dong1 CUI Zong-jun2
（1. Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and
Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing 102206 ；2. Center of Biomass
Engineering，College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193）
Abstract: This work is to analyze the dynamic variation of microbial community during the fermentation of traditional soybean paste in
northeastern China. Selecting the fermented 0 d，35 d，65 d，75 d and 105 d soybean pastes as research materials，the microbial diversity
was analyzed，and the changes of proteins and amino acid-nitrogen were detected，by PCR-DGGE technique. The results showed that the
dominant bacteria during the fermentation of soybean paste were Bacillus and Lactobacteria，and the Bacillus mainly covered the closely related
species of B. subtilis，B. pumilus，B. amyloliquefaciens，B. licheniformis，et al. The main species of Lactobacteria included the closely related
ones of Lactococcus，Leuconostoc，Weissella cibaria，et al. The dominant fungi during the fermentation of soybean paste were the closely
related species of Aspergillus oryzae，Eurotium rubrum，and Aspergillus chevalieri，and they decreased gradually with the fermentation time.
The crude protein of the soybean paste finally decreased to 24.76% after increasing smoothly in former fermentation process. The amino acid-
nitrogen kept on increasing during whole progress and its concentration was up to 101.2 g/kg in final soybean paste.
Key words: PCR-DGGE ；traditional fermented soybean paste ；microbial diversity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4252
制作也是非常普遍的，同时也是我国自制豆酱的主
要生产地区。
豆酱作为主要发酵豆制品之一，其传统发酵过
程在多种微生物的参与下，发生了多种生化反应，
产生了多种风味物质，这些风味物质赋予了豆酱特
殊的香味、适宜的口感和色泽［2］。豆酱发酵过程中
有多种微生物的参与，目前研究发现的主要类群有
霉菌、酵母菌和细菌［3，4］。霉菌能够分泌蛋白酶、
淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种酶类，
这些酶可以将原料中的蛋白质水解为多肽和多种氨
基酸，将淀粉水解为葡萄糖、双糖、三糖及糊精等
物质，为酵母菌和细菌发酵产生风味物质创造了条
件。本研究结合传统分离方法和现代分子生态学的
手段分析东北传统发酵豆酱中微生物菌群的变化，
结合蛋白质和氨基酸态氮的变化分析微生物在豆酱
发酵过程中的主要作用。
1 材料与方法
1.1 材料
根据东北豆酱的发酵工艺，分别选择发酵豆酱
0、35、65、75 和 105 d（成品豆酱）作为研究材料。
1.2 方法
1.2.1 豆酱样品总 DNA 提取 取不同时期的豆酱样
品各 2.0 g，采用氯苯法［5］，直接从各豆酱样品中提
取豆酱中的基因组总 DNA，然后用 RNA 酶进行纯
化［6］。
1.2.2 PCR-DGGE
1.2.2.1 细菌 PCR 以基因组总 DNA 为模板，357F-
GC 和 517R 作为细菌的引物［6］。PCR 反应体系为
（50 μL）：10×PCR Buffer（Tiangen）5 μL，2 mmol/L
dNTP mix 4 μL，45 pmol 357F 和 517R 各 0.5 μL，5
unit/μL Taq DNA 聚合酶（Tiangen）0.2 μL，模板 10
ng/μL DNA 1 μL。反应程序为 95℃ 10 min，93℃变
性 1 min，48℃ 退 火 1 min，72℃ 延 伸 1 min 20 s，
共 30 个循环 ；72℃延伸 5 min。扩增产物以 2% 琼
脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2.2 真菌 PCR 以基因组总 DNA 为模板，NL1-
GC 和 LS2 作为真菌引物
［6］。PCR 反应体系为（50
μL）：10×PCR Buffer（Tiangen）5 μL，2 mmol/L
dNTP mix 4 μL，45 pmolNL1-GC 和 LS2 各 0.5 μL，5
unit/μL Taq DNA 聚合酶（Tiangen）0.3 μL，模板 10
ng/μL DNA 1 μL。反应程序为 ：95℃ 5 min，95℃变
性 1 min，56℃ 退火 45 s，72℃延伸 1 min，共 35 个
循环 ；72℃延伸 7 min。扩增产物以 2% 琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.2.2.3 DGGE 及条带测序 对样品 DNA 的 PCR 产
物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE），仪器采用 Bio-
Rad DCode 突变检测系统。胶浓度为 20%-60%，取
PCR 产物 13 μL，加入 7 μL DGGE loading buffer，混
匀后进样，200 V 恒压，61℃恒温，电泳 5 h。
电泳结束后，使用 SYBRR Green I 染色 30 min，
用凝胶成像仪 302 nm 下观察，照相，对特征性条带
进行切胶，回收条带，对胶回收的条带再进行一次
无 GC-夹子的 PCR 扩增。PCR 产物经电泳检测后，
委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
根据 16S rDNA 和 26S rDNA 查询互联网数据库，分
析亲缘关系及相似性。
1.2.3 蛋白质及氨基酸的测定
1.2.3.1 粗蛋白的测定 凯氏定氮法测定样品中粗
蛋白［2］，将不同时期豆酱样品自然干燥，样品过 40
目筛，称取 0.1 g 左右放入样品管，每个样品做 3 个
重复。然后将样品进行消煮、蒸馏及滴定。称取 0.1
g 左右的蔗糖，代替样品，按以上步骤做空白测定，
要求消耗盐酸的体积不超过 0.2 mL ；精确称取 0.1 g
左右的（NH4）2SO4，按以上步骤做蒸馏回收率测定。
1.2.3.2 氨基酸态氮的测定 甲醛滴定法测定样品
中氨基酸态氮［6］，称取 0.2 g 样品于烧杯中，加去
离子水 50 mL，加 2-3 滴麝香草酚酞指示剂，摇匀，
用 0.100 N NaOH 溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛
20 mL，摇匀，静置 1 min，此时蓝色应消失。再用
0.100 N NaOH 溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定消
耗的碱液毫升数。
2 结果
2.1 东北豆酱发酵过程中细菌的多样性
东北豆酱发酵过程中细菌的 PCR-DGGE 图谱如
图 1 所示，0 d 样品（原材料）中有多条菌带，条带
具体信息见表 1，其中 b、d、k 和 l 均维持较长时间，
其它条带在随后的检测中很快消失 ；图谱中 35 d 条
带最少，优势种为 b、g、k 和 l，35 d 之后仍存在很
2016,32(4) 253高秀芝等：东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性
长时间，数据库比对结果为魏斯氏菌属、乳酸菌和
弗氏柠檬酸杆菌的近缘种，它们在整个发酵过程中
起到一定的作用 ；发酵 65 d 以后条带数逐渐增多，
在最后的成品酱中，条带较集中，优势种明显，h、k、
l、o 和 u 形成成品酱的最主要的 5 个条带。
2.2 东北豆酱发酵过程中真菌的多样性分析
东北豆酱发酵过程中真菌 PCR-DGGE 结果如图
2 所示，各条带具体分析信息见表 2。0 d 原料中真
菌组成较简单，k、l 和 p 为优势菌条带，k、l 为假
丝酵母属近缘种，条带 k 和 p 持续到发酵中后期一
直存在，但含量逐渐降低，其它条带（i 和 j）很快
消失 ；豆酱发酵中期（35-75 d）真菌种类较丰富，
有明显的优势条带（h、k 和 p），成品豆酱（105 d）
真菌条带很少，含量很低。条带 a、b、c、d、e、f
和 g 在发酵中期检测到，成品酱中消失，其中 a 和 d
均为曲霉菌（Aspergillus bridgeri）近缘种，b 和 f 均
为散囊菌（Eurotium rubrum），可能为同一种菌具有
的两个条带。
0 d 75 d
ab
cd
h
ik
m
o
p
s
j
eg
l
n
q
f
t
u
UF PA
20ˁ6ˁ
60ˁ12ˁr35 d 65 d 105 d
图 1 东北豆酱发酵各阶段细菌的 DGGE 分析图谱
表 1 图 1 中 DGGE 条带的近缘菌
条带 来源 登录号 相似率 /%
a Uncultured Lactobacillales bacterium EU112068 93
b Weissella cibaria EU121685 100
c Weissella cibaria EU121685 99
d Leuconostoc mesenteroides X95978 91
e Uncultured Bacillus clone EF663728 87
f Uncultured Bacilli bacterium EF703482 97
g Leuconostoc lactis AB295117 98
h Leuconostoc garlicum AB362724 91
i Uncultured bacterium AB233995 99
j Streptococcus equinus AB362710 98
k Citrobacter freundii EU124385 92
l Lactococcus lactis AB244439 100
m Uncultured Streptococcus sp. clone DQ016828 90
n Bacillus licheniformis EU071556 98
o Ureibacillus thermosphaericus AY299517 98
p Bacillus pumilus CP000813 100
q Bacillus sp. Ni36 AF539677 90
r Citrobacter freundii AY186052 99
s Uncultured bacterium DQ346926 86
t Leuconostoc mesenteroides X95978 84
u Clostridium sp. PML14 EF522948 90
0 d
a
b
d
f e
c
g
h
i
kl
m
n
o
q
p
j
75 d 105 d
UF PA
20% 6%
60% 12%
35 d 65 d
图 2 东北豆酱发酵各阶段真菌的 DGGE 分析图谱
2.3 东北豆酱发酵过程中蛋白质与氨基酸态氮的
变化
东北豆酱在发酵过程中粗蛋白含量呈现出平稳
上升然后又迅速下降的变化趋势（图 3），0 d 粗蛋
白含量为 40.4％，随后在豆酱发酵过程中平稳上升，
65 d 粗蛋白含量最高为 43.4％，发酵开始时微生物
消耗环境中的糖，使得豆酱中蛋白质的相对比例提
高，最后成品酱 105 d 中粗蛋白含量下降为 24.8％。
豆酱发酵过程中氨基酸态氮呈逐步上升最后趋于
平稳的变化趋势（图 3），0 d 氨基酸态氮的含量为
58.8 g/kg，最后成品豆酱 105 d 氨基酸态氮含量为
121.3 g/kg，比 0 d 增加了接近 1.1 倍，略低于 75 d
的氨基酸态氮的含量，究其原因可能是豆酱抽取酱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4254
油时流失到酱油中部分氨基酸态氮 ；说明豆酱在发
酵微生物体系中蛋白酶系的作用下，水解产生游离
氨基酸，使得环境中氨基酸态氮含量逐渐上升。
成酯类物质，认为该菌在成品酱风味形成中起到重
要的作用，另外乳酸菌合成的肽聚糖对免疫系统具
有调节作用［10］；条带 o 为解脲芽孢杆菌（98%）近
缘种，该菌也常参与物质分解，分析对豆酱发酵有
一定的作用 ；条带 u 为梭菌属（90%）近缘种，在
0 d 曾出现，发酵过程中没有检测到，而成品酱又重
新出现，分析可能为发酵过程中污染杂菌。
近年来多种散囊菌在砖茶中被分离和鉴定［11］，
研究发现散囊菌发酵液可促进 α-淀粉酶对淀粉的酶
解、胃蛋白酶和胰蛋白酶对蛋白质的酶解，有利于
淀粉、蛋白质消化吸收，同时还能抑制脂肪在消化
系统中的降解、吸收，从而改善人体肠道功能［12］，
分析对豆酱的保健功能的形成具有一定的作用 ；条
带 c 和 g 为谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）近缘
种，仅在 75 d 样品中有明显条带，为四川茯砖茶优
势菌，分析可协同散囊菌共同作用于豆酱发酵。条
带 p 为米曲霉（Aspergillus oryzae）近缘种，发酵过
程基本一直存在，0 d 含量甚微，15 d 含量最高，45
d 后含量逐渐下降，成品酱（90 d）隐约可见，可产
生蛋白酶、淀粉酶及糖化酶等多种酶类，将原料中
的蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，将淀
粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖；
条带 m 和 n 均为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）
近缘种，仅在 65 d 出现，尖孢镰刀菌是大豆根腐病
的主要致病菌，条带 m、n 和条带 e、o 分析可能为
发酵过程中污染的杂菌。
与山东的传统发酵豆酱比较分析，山东豆酱
中的细菌和真菌种类更丰富，原料不同和环境条件
差异是导致两种豆酱中微生物种类不同的主要原
因［13］。其主要的细菌类型为芽孢杆菌和乳酸菌，其
中芽孢杆菌基本贯穿整个豆酱发酵过程，淀粉液化
芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及乳酸菌中
明串珠菌（Leuconostoc）和魏斯氏菌（Weissella）为
首次从豆酱中分离到的细菌［13］。国内一些研究人
员认为芽孢杆菌有可能对发酵不利，但据国外报道
韩国传统发酵豆酱［14］和尼日利亚传统发酵豆制品
“Soy-daddawa”［15］中芽孢杆菌为发酵主要作用细菌，
本研究结果与国外报道是一致的。而乳酸菌在豆酱
发酵后期起作用，产生风味物质。真菌主要是存在
于豆酱发酵过程中的前期和中期，说明真菌主要是
表 2 图 2 中 DGGE 条带的近缘菌
条带 来源 登录号 相似率 /%
a Aspergillus bridgeri EF200084 93
b Eurotium rubrum AY213700 96
c Aspergillus chevalieri AF454151 96
d Aspergillus bridgeri EF200084 93
e Penicillium chrysogenum EU146308 100
f Eurotium rubrum AY213700 96
g Aspergillus chevalieri AF454151 93
h Mucor circinelloides EU186074 95
i Monascus sp. AF365018 98
j Candida krisii AJ539355 98
k Candida oleophila EU326130 95
l Candida sp. DQ195073 95
m Fusarium oxysporum EF363781 98
n Fusarium oxysporum EF363781 98
o Penicillium sp. EU069428 99
p Aspergillus oryzae AB088195 99
q Penicillium sp. AF481123 96
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
20
40
60
80
100
120
140ᰦ䰤/d㋇㳻ⲭ≘ส䞨ᘱ≞㋇㳻ⲭ% ≘ส䞨ᘱ≞g·kg-1 
图 3 东北豆酱发酵过程中粗蛋白与氨基酸态氮的变化
3 讨论
在细菌 DGGE 图谱中条带 h 为明串珠菌属（91%）
近缘种，明串珠菌能够代谢产生葡聚糖、甘露醇等
有益物质，同时代谢能生成风味物质［7］；条带 l 为
乳酸乳球菌（100％）的近缘种，该种菌在发酵食品
中尤其是乳制品中常被分离到［8，9］，乳酸菌在生长
代谢过程中能产生乳酸，与酵母菌代谢产物作用生
2016,32(4) 255高秀芝等：东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性
在豆酱发酵的前期和中期起作用。其中山东豆酱分
离特有菌为卷枝毛霉（Mucor circinelloides），东北豆
酱 PCR-DGGE 分 析 特 有 散 囊 菌（Eurotium rubrum）
和谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri），两种豆酱共
有酵母菌为（Saccharomyces dairensis）。东北豆酱和
山东豆酱粗蛋白和氨基酸态氮发酵过程中变化趋势
相同［16］，延吉豆酱的粗蛋白发酵前期至中期高于山
东豆酱，原因是延吉豆酱原材料为纯大豆，而山东
豆酱原料为大豆和玉米（大豆 75%，玉米 25%）；延
吉豆酱发酵过程中氨基酸态氮含量明显高于山东豆
酱氨基酸态氮含量，最后东北豆酱成品酱的氨基酸
态氮含量为山东成品豆酱的 1.2 倍。氨基酸本身就
是重要的呈味物质，特别是游离氨基酸与豆酱独特
风味的形成密切相关［17］。
4 结论
东北豆酱发酵过程中芽孢杆菌（Bacillus）和
乳 酸 菌（Lactobacteria） 为 优 势 细 菌， 主 要 芽 孢
杆 菌 包 括 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）、 短 小
芽 孢 杆 菌（Bacillus pumilus）、 淀 粉 液 化 芽 孢 杆 菌
（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus
licheniformis）等；主要乳酸菌为乳球菌（Lactococcus）、
明 串 珠 菌（Leuconostoc）、 魏 斯 氏 菌（Weissella
cibaria）等种属的近缘种。东北豆酱发酵过程中
主要工作真菌为米曲霉（Aspergillus oryzae）、散囊
菌（Eurotium rubrum） 和 谢 瓦 氏 曲 霉（Aspergillus
chevalieri）的近缘种，为豆酱发酵过程中优势真菌，
随发酵时间延长数量逐渐减少。粗蛋白相对含量先
略有平稳上升后下降，最后成品酱粗蛋白含量下降
为 24.76％ ；氨基态氮含量一直在增加，成品酱中为
101.2 g/kg。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）