全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):198-202
食醋在中国拥有上千年的历史，因其具有色泽
红棕，酸味柔和，醇香回甜，久陈不腐等特点，成
为深受人们喜爱的一种调味品。食醋主要是以含淀
粉、糖或乙醇的原料发酵酿造而得，通过微生物的
代谢作用产生的众多酶系催化实现醋酸等基本风味
物质的转化，本质上是一个微生物菌种混合发酵的
复杂过程。目前国内关于食醋微生物的研究主要集
中在传统食醋酿造过程中微生物群落的多样性及功
能性方面。食醋中醋酸的形成包括淀粉转化为乙醇
和乙醇转化为乙酸两个过程，其中淀粉质原料的糊
化、糖化及酒化主要是通过霉菌和酵母菌以及分泌
的多种水解酶系的共同催化完成的，醋酸发酵阶段
是在包括醋酸菌在内的众多细菌以及分泌的水解酶
系作用下生成醋酸，形成食醋的主体风味［1-5］。
虽然微生物在酿醋过程中发挥着重要作用，但
是食醋酿造过程中的微生物污染是亟待解决的难题。
微生物污染后的食醋产生异味、出现颜色变浅、醋
中固形物减少等现象，大大降低了食醋的营养价值。
本研究采取 PCR-DGGE 技术对正常醋样和污染醋样
的微生物群落结构进行比较，研究发现引起食醋变
质的潜在污染菌 ；在此基础上，采用可培养的方法
对正常醋样和污染醋样的微生物进行分离纯化及鉴
定，结合污染菌回接试验以期分离得到引起食醋变
质的污染菌，旨为食醋生产企业进行微生物污染控
制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
某食醋生产企业食醋生产过程中的正常醋样和
收稿日期 ：2015-05-15
基金项目 ：国家微生物资源平台专项（NIMR2015-4），中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基金）项目（2015KJFZ-BS-04）
作者简介 ：翟磊，男，博士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：zhailei@china-cicc.org
通讯作者 ：程池，男，教授级高工，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
食醋中污染菌的分离与鉴定
翟磊  苏姣姣  刘洋  曹艳花  姚粟  程池
（中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015）
摘 要 ： 首次关于耐酸乳杆菌是引起食醋变质的报道，旨在为食醋生产企业进行微生物污染控制提供理论依据。采用 PCR-
DGGE 技术以及纯培养技术，对正常醋样和污染醋样的微生物群落结构和种类进行了研究，通过对比分析以及回接实验发现了引
起食醋变质的污染菌为耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）。
关键词 ： PCR-DGGE ；纯培养技术 ；耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.031
Isolation and Identification of Microorganisms from Spoilage Vinegar
ZHAI Lei SU Jiao-jiao LIU Yang CAO Yan-hua YAO Su CHENG Chi
（China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）
Abstract: The structure and diversity of microbial community in normal and spoilage vinegar samples were studied by PCR-DGGE
technology combined with pure culture technology. By comparative analysis and tie-back test，we found that Lactobacillus acetotolerans was the
polluting strain causing vinegar spoilage. This is the first domestic reports regarding that L. acetotolerans was the cause of the vinegar spoilage
and provided theoretical basis for the enterprises of vinegar production to control the microbial pollution.
Key words: PCR-DGGE ；pure culture technology ；Lactobacillus acetotolerans
2016,32(3) 199翟磊等：食醋中污染菌的分离与鉴定
污染醋样。
1.2 方法
1.2.1 样品理化特征比较 从醋样颜色、气味、可
溶性固形物、pH 值和 CO2 含量方面对正常醋样和污
染醋样的理化特征进行比较。
1.2.1.1 可溶性固形物含量测定 取正常醋样和污
染醋样各 20 mL，10 000×g，离心 10 min 后弃掉上
清，比较固形物含量。
1.2.1.2 pH 值测定 取正常醋样和污染醋样各 20
mL 至于灭菌的烧杯中，使用 pH 计直接测定。
1.2.1.3 CO2 含量测定 取正常醋样和污染醋样瓶中
的气体，使用气相色谱法测定。检测条件为 ：柱温
箱 170℃，进样器温度 120℃，检测器温度 120℃，
分析柱为 TDX-01，载气为 He。
1.2.2 样品微生物群落结构分析 利用 PCR-DGGE
对 正 常 醋 样 和 污 染 醋 样 的 微 生 物 群 落 进 行 比 较
分析［6-8］。
1.2.2.1 样品中微生物总 DNA 提取 微生物总 DNA
提取采用试剂盒方法进行，试剂盒购自天根生化科
技（北京）有限公司。提取获得的总 DNA 用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳检测，并置于 -20℃保存备用。
1.2.2.2 PCR 扩增 用通用引物 341f-GC 和 534r 进
行 16S rRNA 基因 V3 可变区片段的扩增。341f-GC ：
5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCC
CGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3（40 个碱基 GC
夹 ）；534r ：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3。PCR 反
应 50 μL 体系包括 10×PCR buffer（不含 Mg2+）5.0
μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq 酶（2.5 U/μL）
1.2 μL，模板各 1 μL，上下游引物 10 mmol/L 各 1 μL，
无菌双蒸水补齐至 25 μL。PCR 反应程序如下 94℃
预变性 5 min 后进入循环，94℃变性 30 s，54℃退
火 30 s，72℃延伸 45 s，35 个循环，72℃再次延伸
10 min。
1.2.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 16S rRNA 基
因 V3 可变区片段的 PCR 扩增产物通过 DGGE 系统
进行分离。丙烯酰胺凝胶浓度为 8%，变性梯度为
40%-60%。60℃恒温，80 V 下电泳 16 h，电泳完毕
后 用 SYBR green I（1×TAE，1∶10 000） 染 色 45
min，电泳结果通过凝胶成像系统（英国 UVI）及
Quantity one 分析软件进行分析。
1.2.2.4 DGGE 条带的回收、重新扩增、克隆、转化、
序列测定及分析 在波长为 354 nm 紫外线下，切取
DGGE 凝胶上的主要条带，溶于 50 μL 无菌去离子
水中，4℃过夜溶解。重扩增，扩增产物连接到载体
pEASY-T1（TRANS），转入 E. coli 感受态细胞，在
LB 固体培养基上 37℃ 筛选培养 16 h，挑取白色转
化子用含有氨苄青霉素抗性的 LB 液体培养基 37℃
震荡培养 8 h。T-载体通用引物进行菌液 PCR，经琼
脂糖凝胶电泳检测后，每个样品 3 个阳性克隆交由
生工生物工程（上海）有限公司完成测序。所测得
的 16S rRNA 基因 V3 可变区序列用 DNASTAR 软件
去除载体序列和 GC 夹后，将有效序列在 NCBI 上进
行比对，以其中同源性最高的序列为参考序列，相
似性≥ 97% 的序列归为同一操作分类单元（OTU）。
1.2.3 样品中可培养微生物的分离纯化与鉴定
1.2.3.1 样品中微生物的分离纯化 在限菌条件下
量取 25 mL 正常醋样，放入盛有 225 mL 无菌水带
玻璃珠的三角瓶中，充分振荡 20 min，之后静置 5
min。采用梯度稀释法制备 10-2 到 10-6 的系列稀释液，
分别涂布到 NA 和 MRS 培养基中在 37℃下培养 2-7
d。挑单菌落转接到新鲜的上述培养基斜面上于 4℃
保藏。采取同样的方法对污染醋样中微生物进行分
离纯化［9］。
1.2.3.2 样 品 中 微 生 物 的 鉴 定 以 基 因 组
DNA 为 模 板， 利 用 通 用 引 物 对 16S rRNA 基
因 进 行 扩 增。 引 物 序 列 为 ：正 向 引 物 799f
（5-AACAGGATTAGATACCCTG-3）， 反 向 引 物
1492r（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）［10］。50
μL PCR 反应体系 ：50 ng DNA 模板，1×Taq reaction
buffer，引物各 20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 单位 Taq
酶（Ferments）。 反 应 程 序 为 ：94℃ 预 变 性 5 min，
94℃变性 1 min，52℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，
30 个循环后 72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1%
的琼脂糖进行检测。纯化后的 PCR 产物用 ABI3700
基因测序仪测序。测序由北京诺赛基因组研究中心
有限公司完成。测序结果用 Chromas 软件参照正反
序列图谱人工校对。将测序得到的结果在 EzTaxon
server 2.1 进行比对［11］，确定与已知序列的同源关系。
1.2.4 食醋中污染菌的回接实验 将分离得到的食
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3200
醋污染菌接种到正常醋样中，37℃厌氧培养 7 d，观
察醋样变化。
2 结果
2.1 正常醋样和污染醋样理化特征
正常醋样和污染醋样的理化特征对比结果如表
1 所示。
表 1 正常醋样和污染醋样特征对比
特征 正常醋 污染醋
颜色 深棕色 棕红色
气味 无异常 淡且有腐臭味
可溶性固形物 较多 较少
pH 值 3.09 3.19
CO2 含量 1.21% 6.96%
2.2 正常醋样和污染醋样PCR-DGGE图谱分析
将正常醋样和污染醋样的总 DNA 经 PCR 扩增
获得大小约为 200 bp 的 16S rRNA 基因 V3 可变区的
序列。将 PCR 扩增产物进行 DGGE 检测，获得正常
醋样和污染醋样中微生物群落结构的 DGGE 指纹图
谱（图 1），每条泳带代表一种样品中微生物 DGGE
指纹图谱，不同位置的条带理论上应代表不同种类
的细菌，条带的荧光强度则反应了该细菌的含量，
条带信号越亮，表示该种细菌的相对数量越多。如
图 1 表明，正常醋样和污染醋样中之间微生物群落
结构存在一定的差异，但优势菌条带相对比较稳定。
2.3 正常醋样和污染醋样微生物群落结构比较
分析
为进一步研究正常醋样和污染醋样中微生物群
落结构组成成分，经 DGGE 电泳后，对其中 6 个优
势条带进行切胶、回收、克隆、测序（表 2）。测
序结果经 GenBank 数据库比对后，序列相似性均
大于 97%，比对结果显示正常醋样中出现的条带
1 和 4 均鉴定为木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter
xylinus），葡糖酸醋杆菌是制醋过程中产生醋酸的功
能微生物之一，能够将酵母菌分解产生的葡萄糖和
果糖转化为醋酸、葡萄糖酸等产物，同时分解醋酸
酶，将乙醇氧化为醋酸。而污染醋样中出现的条带 2，
3 和 5，6 尽管电泳的位置有所差别，但是均鉴定为
耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans），这可能是
由于少数碱基变异造成的。在生产过程中，耐酸乳
杆菌能够将葡萄糖等底物转化为醋酸和乳酸，丰富
醋的风味。一旦其出现在成品醋中就会引起醋的变
质和腐败。通过 PCR-DGGE 分析发现，污染醋样中
2
3
5
6
41
ķ ĸ Ĺ ĺ ķ ĸ Ĺ ĺ
①正常醋样 ；② ：污染醋样 ； ③ ：正常醋样 ；④ ：污染醋样 ；条带 1 和 4 代
表正常醋样中优势微生物的 PCR 扩增片段 ；条带 2，3 和 5，6 代表污染醋
样中优势微生物的 PCR 扩增片段
图 1 正常醋样和污染醋样中微生物 DGGE 分离图谱及分
析示意图
表 2 优势条带测序比对分析结果
DGGE 条带编号 NCBI 数据库中亲缘关系最近的菌种 相似度 /% GenBank 登录号 对应样品
1 木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus） 99.4 X75619 正常醋样
2 耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans） 100 AB303841 污染醋样
3 耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans） 100 AB303841 污染醋样
4 木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus） 100 X75619 正常醋样
5 耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans） 100 AB303841 污染醋样
6 耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans） 100 AB303841 污染醋样
2016,32(3) 201翟磊等：食醋中污染菌的分离与鉴定
存在的耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）是引
起食醋的潜在污染菌。
2.4 正常醋样和污染醋样可培养微生物的分离纯
化与鉴定
采用 PCR-DGGE 技术分析微生物群落结构
发 现 耐 酸 乳 杆 菌（Lactobacillus acetotolerans） 是 潜
在的引起食醋变质的污染菌，为了进一步确认，需
要采用稀释梯度平板法对正常醋样和污染醋样中的
微生物进行纯培养。通过平板划线纯化和分子生物
学鉴定，从正常醋样中分离得到了葡糖酸醋杆菌属
（Gluconacetobacter sp.）菌株，蜡样芽孢杆菌群（Bacillus
cereus group）菌株以及纤维微菌属（Cellulosimicrobium
sp.）菌株 ；而污染的样品中分离得到了耐酸乳杆菌
（Lactobacillus acetotolerans），短杆菌属（Brevibacterium
sp.）菌株以及赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）
菌株（表 3）。样品中可培养微生物的分离纯化与鉴
定结果发现，污染醋样中含有引起醋样变质的潜在
污染菌 - 耐酸乳杆菌，这也与非培养研究的结果一
致。目前耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）已
经保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号
为 CICC 10774。
表 3 正常醋样和污染醋样中可培养微生物
分离培养基 正常醋样 污染醋样
MRS 葡糖酸醋杆菌属
（Gluconacetobacter sp.）
耐酸乳杆菌
（Lactobacillus acetotolerans）
NA 蜡样芽孢杆菌群
（Bacillus cereus group）
短杆菌属
（Brevibacterium sp.）
NA 纤维微菌属
（Cellulosimicrobium sp.）
赖氨酸芽孢杆菌属
（Lysinibacillus sp.）
2.5 回接实验
为了进一步确认耐酸乳杆菌就是引起食醋变质
的污染菌，将耐酸乳杆菌接种到正常醋样中进行回
接试验。回接实验结果表明，耐酸乳杆菌的接入会
引起正常醋样出现产气，淡腐，臭味颜色变浅，可
溶性固形物减少以及 pH 值升高等变质现象。因此
我们确定耐酸乳杆菌就是引起食醋变质的污染菌。
3 讨论
非培养技术是指借助于分子生物学方法，直接
对样品的微生物结构进行分析，其中变性梯度凝胶
电泳（DGGE）技术是最为常见的研究微生物群落
结构组成的非培养分析方法，其基本原理为在含有
浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中对
PCR 产物分离，部分解链的双链 DNA 分子的电泳迁
移率降低，而序列不同的 DNA 分子有着不同的解链
行为，它们在凝胶的不同位置停止迁移从而使长度
相同而序列不同的 DNA 片段分离。广泛应用于研究
湖泊、海洋、活性污泥、发酵食品及各种土壤等生
态环境的微生态研究中［6-8］。可培养技术是根据样
品特征，设计一系列合适的培养基从样品中分离得
到微生物菌种的研究方法，包括微生物菌种的分离、
纯化、鉴定等多种方法，是研究微生物菌种最为常
用的分析方法。
本研究结合微生物的非培养技术和可培养技
术，比较分析了正常醋样和污染醋样的微生物结构
和种类，通过回接试验确定了耐酸乳杆菌（Lactoba-
cillus acetotolerans） 就 是 引 起 食 醋 变 质 的 污 染 菌。
Entan［12］在 1986 年首次从食醋发酵液中分离得到
了耐酸乳杆菌。该菌革兰氏染色呈阳性，兼性厌氧，
最适生长为 37℃，这也是食醋生产企业夏季易发生
微生物污染的原因。耐酸乳杆菌能够代谢产生醋酸
并且适应高酸环境，在醋酸发酵生产过程中发挥着
关键的作用，能够产生醋酸和乳酸等风味物质，是
主要生产菌之一。然而，成品醋都需要经过高温灭
菌工艺，如果灭菌不彻底耐酸乳杆菌出现在成品醋
中，会使正常醋样出现产气、淡腐、臭味颜色变浅、
可溶性固形物减少，以及 pH 值升高等变质现象，
降低食醋的营养价值。此外，有关研究发现耐酸乳
杆菌还是引起啤酒变质的主要污染菌，该菌能够引
起啤酒失光、异味、变酸、形成浑浊和沉淀［13］。
4 结论
本研究采用 PCR-DGGE 技术以及纯培养技术，
发现了导致食醋变质污染菌。通过分子生物学将污
染菌鉴定为耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）。
参 考 文 献
［1］ Haruta S, Ueno S, Egawa I, et al. Succession of bacterial and
fungal communities during a traditional pot fermentation of rice
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3202
vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel
electrophoresis［J］. International Journal of Food Microbiology,
2006, 109 ：79-87.
［2］许伟 , 张晓君 , 许泓瑜 , 等 . 镇江香醋醋酸发酵过程中细菌群落
组成分析［J］. 微生物学通报 , 2007, 34（4）：646-649.
［3］聂志强 , 汪越男 , 郑宇 , 王敏 . 传统食醋酿造过程中微生物群落
的多样性及功能研究进展［J］. 中国酿造 , 2012, 31（7）：1-6.
［4］ 苏敬东 . 传统酿醋过程中醋醅微生物时空动态变化规律研
究［J］. 甘肃科技 , 2011, 27（18）：70-72.
［5］ 崔云 , 卢红梅 , 张义明 , 刘佳 . 食醋中微生物的分离与鉴定［J］.
中国酿造 , 2008, 22 ：29-31
［6］朱扬玲 . 采用 PCR-DGGE 方法研究浙江玫瑰醋酿造过程中的
微生物多样性［D］. 杭州 ：浙江工商大学 , 2009.
［7］刘琳 , 刘洋 , 宋未 . PCR-DGGE 技术及其在植物微生态研究中
的应用［J］. 生物学通报 , 2009（3）：54-56.
［8］梁新乐 , 朱扬玲 , 蒋予箭 , 等 . PCR-DGGE 法研究泡菜中微生
物群落结构的多样性［J］. 中国食品学报 , 2008, 8（3）：133-
137.
［9］东秀珠 , 蔡妙英 , 等 . 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京 ：科
学出版社 , 2001.
［10］Baker GC, Smith JJ, Cowan DA . Review and re-analysis of domain-
specific 16S primers［J］. J Microbiol Methods, 2003, 55 ：541-
555.
［11］Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon ：a web-based tool for the
identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene
sequences［J］. Int J Syst Evol Micr, 2007, 57 ：2259-2261.
［12］Entan E, Masa H, Suzuki KI. Lactobacillus acetotolerans, a New
Species from Fermented Vinegar Broth［J］. Int J Syst Evol Bact,
1986, 36（4）：544-549.
［13］田小群 , 周世宁 . 一株啤酒污染菌的分离鉴定及快速检测方
法［J］. 中山大学学报 ：自然科学版 , 2006 45（4）：70-73.
（责任编辑 李楠）