全 文 ：生态科学2006年2月第25卷第1期 ECOLoGICSC ENCEFeb．，2006，25(1)：25～27
微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建
廖婉琴，梁旭方+，王 琳，韩博平(暨南大学生命科学技术学院，广州510632)
【摘要】 根据已克隆的鲢鱼(硒拟矽办伪日锄渤舫声珑D蜘恢)微囊藻毒素去毒酶cDNA全序列设计特异引物，利用PcR方
法获得鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因编码区，将该编码区与绿色荧光蛋白连接，分别构建融合表达载体DEGFP．N1．sGST
和双顺反子表达载体pIREs2．EGFP．sGsT。利用脂质体转染法将融合表达载体pEGFP-N1．sGsT转染Hela细胞，60h
后检测到绿色荧光基因表达；通过显微注射，将双顺反子表达载体pIRES2．EGFP．sGST注入斑马鱼(D册如增rfD)受精卵，
获得了转鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因斑马鱼，从而构建了微囊藻毒素去毒酶转基因模型。上述2种转基因模型的成功
构建为进一步研究鲢鱼、鳙鱼似廊f配^砌姻盯D6f凰)、罗非鱼(D陀。砌阳朋括”ff0，^阳)等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因调控
元件、去毒分子机理及研发转基因鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等微囊藻毒素高效生物去毒器奠定了基础。
关键词：微囊藻毒素去毒酶；微囊藻毒素：转基因模型；调控元件；生物去毒器
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2006)Ol—025．03
Construction0fm cmsystin—detoxmzymetrans2enicodel
LIAOWan—qin，LIANGXu-fang謇，WANGLin，HANBo-ping(CollegeofLifeScienceandTbchnology，JinanUniversity，
Guangzhou5l0632，China) ．
AbstractcDNAf}agmentcodingcompletesequenceofsilVercarp(旦助叩^砌口胁lfc厅，，驴卅D，衙灰)micmcystin-deto—
xifizymewasubclonedtoconstllJctafusinggeneexDressionvectorpEGFP。N1．sGST，andadicis仃onicexpressionvector
plRES2．EGFP．sGST．UsingliDofectinmethod，themsinggeneexpressionvectorpEGFP—N1．sGSTwast啪sfectedintoHela
cells．TheemissionofnuorescencewasobservedaRer60hours．Througllmicroiniection，medicis仃onicexpressionvector
pIRES2．EGFP．sGSTwade“veredintoembryosofzebrafIsh(踟z如，柳-面)，andthesilvercarpmicrocystin—detoxifizyme
transgeniczebranshwasobtained．Thesucc ssofmetwot煳sgenicmodlelsmakesitpossibletonlnheranalyzeth
cis．regulatoryelementsofthemicrocystin．detoxifi2ymegene，andtodevelopas仃ainoftraIlsgenicpl棚1ktivorousfish，usedasa
high．efficientbiodetoxicatorfIormicrocvstininlakesandreservoirs．
Keywords：Microcystin．detoxifi巧megene；Microcystjn；T啪sgenicmodel；Regulatorye ement；Bio—detoxicator
，
。 ’ ’ 一 ’ 一 一 ’
随着水体富营养化加剧，藻类所引起的水污染问
题已越来越引起人们的关注。淡水藻类污染已成为一
个全球性的环境卫生问题【1I。微囊藻毒素(microcystin，
MC)是由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻等产生的单环七肽
肝毒素，可造成野生动物、家畜、家禽等中毒死亡【2卅，
并引发人类肝损伤和肝癌高发等危害【5’6】。微囊藻毒素
对人类健康所造成的威胁已引起世界各国公共卫生系
统的广泛关注【，嘣J。
以鱼类为主体的水生动物，在清除蓝藻，并在以
改善水质为目的的淡水水体生态管理中发挥重要作
用。我国学者用围隔等实验湖沼学方法在东湖进行长
年研究，发现鲢鱼(日切印办历口砌配向腩"肌。如护啪、鳙鱼
似，．括啦向砌俗聆D6f凰)在遏制微囊藻等蓝藻水华方面有
重要作用，提出了通过放养滤食浮游生物的鲢和鳙
直接控制微囊藻等蓝藻水华的非经典生物操纵理
论【9~1o|。另外，利用鲢鱼、鳙鱼控制藻类、改善水质的
生态作用也为国内外其它大量实验研究所证实【1卜12】。
但关于鲢鱼、鳙鱼等淡水鱼类对微囊藻毒素去毒作用
分子机理至今未见报道。最近研究证实，微囊藻毒素
去毒酶，即可溶性谷胱甘肽S转移酶(soluble
glutamioneS．transferase，sGST)[13】，在鱼类微囊藻毒
素去毒过程中起着关键作用。本室已成功克隆了鲢鱼、
鳙鱼、 罗非鱼(C忱D幽加惭括聆f肠ffc口)、草鱼
(D绷印办口，)啤rD面，z娩砌)、鲫鱼(∞，珊sf淞口甜朋m)、鲮
鱼((协7锄f门口所D，f幻地Z肠)、斑鳢(C％口门，2a朋口c甜肠砌)、
鳜鱼(跏z城w口c向”口细f)等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶
基因cDNA的核心片断，并进行了初步报道¨4|，最近
利用cDNA5’末端的快速扩增技术(r印idamplmcation
cDNAend，RACE)、基因组步移法(GenomeWalker
memod)已进一步获得鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼、唐鱼
(砀，2击办砌w口舾D删6耵)等微囊藻毒素去毒酶基因
cDNA全序列及5’侧翼调控序列(将另文报道)。
转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术，
收稿日期：2005．09．05，2006—01．20接受
基金项目：广东省水文局蓝藻重点项目；广东省自然科学基金项目(031886)；
教育部留学回国人员科研启动基金项目。
作者简介：鏖婉琴(1980一)，女，广东东莞人，硕士研究生，主要从事基
因分子生物学研究，E-mail：lical208@hotnlail．com
’}通讯作者：Bmail．tli粕gxf}功inu．edu．cn
万方数据
生态科学
不仅在鱼类遗传育种方面起重要作用【I孓汐】，同时也是
进行动物基因功能研究的重要手段[20-21]。本实验成功
构建微囊藻毒素去毒酶转基因模型，将为下一步研究
鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基
因调控元件、去毒分子机理及研发转基因鲢鱼、鳙鱼、
罗非鱼等微囊藻毒素生物去毒器奠定基础。
l材料与方法
1．1材料
总RNA提取试剂盒(SVTotalRNAIsolation
System)为Promega公司产品，cDNA合成试剂盒
(TaKaRaRNALAPCRTMKi’t(AMY)Ver．1．1)、pUC
18载体、TaqDNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司
产品；绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1、
plRES2．EGFP为美国Clontech公司产品，限制性内切
酶、高保真酶为日本东洋方(Toyobo)公司产品；其
它试剂均为进口分装或者国产分析纯试剂。大肠杆菌
JMl09由本室保存。
1．2方法
1．2．1总RNA提取和eDNA第一链的合成从鲢鱼分
离肝脏组织，总RNA的提取与纯化按Promega公司的
SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒推荐方法进行。
cDNA第一链的合成使用TaKaRaRNALAPCRTMKit
(AMY)Ver．1．1试剂盒，以鲢鱼总RNA为模板，
oligo(dT)18为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法
进行。
1．2．2融合表达载体pEGFP-N1一sGST的构建根据鲢
鱼微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列设计一对特异
引物Pl和P2。Pl于起始密码子ATG前引入EcoRI酶切
位点，P2于5’端引入BamHI酶切位点，但不含终止密
码子。以上述cDNA为模板，利用高保真酶进行PCR
扩增，反应条件为：94℃2min，94℃15s，55℃30s，
68℃90s，最后68℃延伸5min。PCR产物经EcoRI和
BamHI酶切消化后与经同样双酶切的pEGFP—N1混
合，16℃连接过夜，转化感受态E．coliJMl09，酶切、
电泳法筛选重组转化子。
1．2．3融合表达载体pEGFP—N1一sGST的转染挑取含
pEGFP-N1一sGST重组质粒的阳性克隆接种于含卡那
霉素的SOB培养基中培养过夜，抽提质粒。将这些载
体用脂质体介导的方法转染HeLa细胞，转染60h后于
荧光显微镜下观察荧光。
1．2．4双顺反子表达载体plRES2一EGFP—sGST的构建
根据鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列设计另
一特异引物P3。P3含有终止密码子TGA和BamHI酶切
位点。以Primerl矛DPrimer3为引物，鲢鱼肝脏cDNA为
模板，利用高保真酶进行PCR扩增，PCR反应条件与
1．2．2相同。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切消化后与
经同样双酶切的plRES2一EGFP混合，16。C连接过夜，
转化感受态EcoliJMl09，酶切、电泳法筛选重组转化子。
1．2．5基因导入与转基因鱼的检测挑取含
plRES2一EGFP—sGST重组质粒的阳性克隆接种于含卡
那霉素的SOB培养基中培养过夜，抽提质粒，浓度为
0．15岭·rtL～，参照朱新平等122J的方法，在立体解剖
镜下挑选高质量的受精卵注射，注射量为每受精卵
2nl。注射后的受精卵放入25～26℃水体，自然发育，
仔鱼出膜后在荧光显微镜下观察荧光表达情况。
2结果
2．1融合表达载体pEGFP—N1一sGST和双顺反子表达载
体plRES2一EGFP—sGST的构建分别以P1／P2，P1／P3为引
物扩增鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的编码区，PCR产
物经EcoRI和BamHI酶切消化后分别与经同样双酶切
的pEGFP．N1、plRES2一EGFP连接构建融合表达载体
pEGFP-N1一sGST和双顺反子表达载体
plRES2一EGFP—sGST，酶切方法筛选出重组子，结果
如图1所示。
23。lkb一
6。5kb一
2。3kb、一
2．Okb7
564bp—
M 王 2 3 4
图1 PCR产物鉴定与质粒酶切分析
Fig．1IdentificationofPCRproductandrestrictionmapping
analysisoftheplasmid
M：XDNA／HindIII；I：PCRroduct(P1／P2)；2：pEGFP—N1-sGST／(EcoRl
／BamHI)；
3：PCRProduCt(Pl／P3)；4：plRES2．EGFP—sGST／(EcoRI／BamHI)
2．2融合表达载体pEGFP—N1一sGST在Hela细胞的表达
利用脂质体转染法介导携带目的基因的表达载
体转染Hela细胞，转染后60h于荧光显微镜下进行观
察。结果显示，融合表达载体pEGFP—N1一sGST在Hela
细胞获得有效表达，与转染空载体pEGFP-N1比较，微
囊藻毒素去毒酶基因的融合表达使绿色荧光蛋白
(greenfluorescentprotein，GFP)荧光亮度降低(图2)，
表明转染成功。
万方数据
1期 廖婉琴，等：微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建 27
2．3双顺反子表达载体plRES2一EGFP—sGST在斑马鱼
的表达
仔鱼出膜后置于荧光显微镜下进行观察，可于仔
鱼头部和尾部肌肉观察到荧光，在头部呈现亮点状，
在尾部则为带状斑点(图3)，表明重组载体
plRES2一EGFP—sGST成功转入斑马鱼。
(a) (b)
(a)转染空载体pEGFP-N1的Hela细胞HelacellstransfectedwithpEGFP-N1；
(b)转重组载体pEGFP．NI．sGST的Hela细胞Helacel stransfectedwith
pEGFP—NI-sGST
图2转融合表达载体pEGFP-N1．sGST的Hela细胞
Fig2Helacellstransfectedwi hfusinggeneexpressionvector
pEGFP．．N1．．sGST
(a)
(a)头部head；(b)尾部tail
图3转双顺反子表达载体plRES2．EGFP．sGST斑马鱼(Danio
rerio)
Fig3Transgeniczebrafish(Daniorerio)
3讨论
微囊藻毒素去毒酶，即可溶性谷胱甘肽S转移酶，
在鱼体清除微囊藻毒素中起重要作用[131。相关研究发
现，含一定浓度MC的水体可使鱼卵变异、鱼类行为
及生长异常[11’231，因此水华暴发时常伴随着大量水生
生物死亡，但是某些鱼类(OH鲢鱼、罗非鱼等)的耐受
性较强，并可吞食、消化水华藻类，能与毒藻共存。。
这些鱼类对微囊藻毒素的抗性，可能跟这些鱼类体内
的微囊藻毒素去毒酶的表达有关。我们对鲢鱼、鳙鱼、
草鱼、罗非鱼、鲫鱼等微囊藻毒素去毒酶mRNA表达
的研究发现，不同鱼类微囊藻毒素去毒酶的表达水平
与其去毒能力存在相关性(将另文报道)。另外，最新
研究成果显示，活体处理鱼或其胚胎时，某些调制因
子(modulatingfactors)，特别是那些由蓝藻水华产生
的物质，对微囊藻毒素去毒酶活性有显著作用[13,24-251。
由于这种作用只有用这些调制因子活体处理鱼或其胚
胎时才存在，直接处理鱼或其胚胎的微囊藻毒素去毒
酶制备物时没有作用，因而这些调制因子的作用可能
涉及微囊藻毒素去毒酶合成而与微囊藻毒素去毒酶基
因的表达调控有关。但是，有关鱼类微囊藻毒素去毒
酶基因的调控机理至今未见报道。
本室已成功克隆了鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、．罗
非鱼等微囊藻毒素去毒酶基因eDNA的核心片断，并
进行了初步报道¨4l，最近利用RACE及GenomeWalker
技术已进一步获得鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼、唐鱼等微囊
藻毒素去毒酶基因eDNA全序列及5’侧翼调控序列，对
微囊藻毒素去毒酶基因5’侧翼调控区序列进行分析发
现含有LPS等调控元件(将另文报道)。微囊藻毒素去
毒酶基因转Hela细胞模型的成功构建，为下一步研究
鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基
因调控元件及其表达调控作用，从基因水平上阐述鱼
类微囊藻毒素去毒代谢分子机理具有重要理论价值，
而微囊藻毒素去毒酶转基因斑马鱼模型的成功构建，
则为从基因水平上定向培育微囊藻毒素高效去毒鱼品
系，及进一步研发转基因鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼微囊藻
毒素高效生物去毒器奠定基础。
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万方数据
万方数据
微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建
作者： 廖婉琴， 梁旭方， 王琳， 韩博平， LIAO Wan-qin， LIANG Xu-fang， WANG Lin， HAN
Bo-ping
作者单位： 暨南大学生命科学技术学院,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2006,25(1)

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