全 文 ：2012 年 6 月 Vol． 30 No ． 6
June 2012 Chinese Journal of Chromatography 584 ～ 589
研究论文 DOI:10． 3724 /SP． J． 1123． 2012． 01018
* 通讯联系人:赵 榕，主任技师，主要研究方向为食品安全． E-mail:lxyue@ yeah． net．
基金项目:北京市自然科学基金项目(No ． 7102087)．
收稿日期:2012-01-13
超高效液相色谱-串联质谱法检测螺旋藻
保健品中 7 种微囊藻毒素
李 兵， 刘 伟， 范 赛， 赵 榕* ， 吴国华
(北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所，北京 100013)
摘要:采用固相萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS /MS)测定了螺旋藻保健品中 7 种微囊藻毒
素(MCs)。螺旋藻保健品经 70%(体积分数)的甲醇超声提取，冷冻离心沉淀杂质后，经 HLB 柱净化。在Waters
ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱上以乙腈和 0. 2 mmol /L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱分离，采用电喷
雾离子源正离子模式进行多反应离子监测，外标法定量。7 种 MC 在线性范围内线性关系良好(相关系数(r)不小
于 0. 995) ;检出限为 6. 7 ～ 33. 3 μg /kg，定量限为 20. 0 ～ 100. 0 μg /kg。各分析物在阴性螺旋藻保健品中的加标回
收率在 87. 5% ～ 97. 9%之间，相对标准偏差(RSD)在 1. 6% ～ 6. 9%之间。该方法准确可靠，灵敏度高，可用于螺旋
藻保健品中 MC 污染的确证定性、定量检测。
关键词:固相萃取;超高效液相色谱-串联质谱;微囊藻毒素;螺旋藻保健品
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2012)06-0584-06
Determination of 7 microcystins in Spirulina health food
products by ultra performance liquid chromatography-
tandem mass spectrometry
LI Bing，LIU Wei，FAN Sai，ZHAO Rong* ，WU Guohua
(Ins ti tu te of Nutr i tion and Food Hygiene，Bei j ing Centr e for Dis ease Control
and Preven tion，Bei j ing 100013，China)
Abstract:Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS /MS)
combined w ith solid phase extraction (SPE)has been developed for the determination of 7 mi-
crocystins (MCs)in Spirulina health food products． The sample w as extracted by 70% (v /v)
methanol． The lipid substances w ere iso lated by centrifugation under freezing condition，and
then fo llow ed by clean-up w ith a Waters Oasis HLB solid phase extraction cartridge． The sepa-
ration w as performed on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column w ith gradient elution
using acetonitrile and 0. 2 mmol /L ammonium acetate． The electrospray ionization (ESI)
source in positive ion mode w as used for multiple reaction monitoring (MRM)． The external
standard method w as used for the quantification． The linear ranges for 7 MCs w ere 20 － 400
μg /kg，and the correlation coefficients w ere not less than 0. 995． The limits o f detection w ere
6. 7 － 33. 3 μg /kg． The limits o f quantification w ere 20. 0 － 100. 0 μg /kg． The recoveries o f the 7
MCs spiked in blank Spirulina samples ranged from 87. 5% to 97. 9% w ith the relative standard
deviations of 1. 6% － 6. 9%． The results demonstrated that the method is easy，fast，sensitive，
and suitable for the confirmation and quantification of the 7 MCs in Spirulina samples．
Key words:so lid phase extraction (SPE) ;ultra performance liquid chromatography-tandem
mass spectrometry (UPLC-MS /MS) ;microcystins (MCs) ;Spirulina health food products
第 6 期 李 兵，等:超高效液相色谱-串联质谱法检测螺旋藻保健品中 7 种微囊藻毒素
图 1 MC的化学结构
Fig． 1 Chemical structures of MCs
X and Z are variable L-amino acids w ith one letter abbreviations used as the suffix o f the MC names．
螺旋藻是一种含有丰富的蛋白质、矿物质与维
生素的蓝藻，国内外曾对螺旋藻进行过系统的安全
性毒理学评价，确认它是安全的保健食品［1］。目前
生产螺旋藻主要通过人工方式在开放的环境下进行
养殖。随着环境污染的进一步加剧，部分养殖螺旋
藻的水域受到了产毒蓝藻的侵害，因此使螺旋藻受
到了不同程度的微囊藻毒素(microcystins，MCs)
污染［1］。MC 是一类单环七肽结构的天然毒素(结
构见图 1) ，具有多器官毒性、遗传毒性和致癌
性［2 － 4］。最初普遍认为饮水暴露是 MC 对人群产生
健康危害的主要途径，但是近年来的研究发现，食用
受 MC 污染的螺旋藻产品带来的危险可能更大［1］。
因此研究和开发针对螺旋藻中 MC 的分析技术有利
于对我国螺旋藻保健食品的安全现状进行调查和
评价。
目前较为经典的 MC 检测方法为蛋白磷酸酶抑
制试验。为了满足快速检测的需要，酶联免疫吸附
试验(ELISA)也有较多的应用。Sassolas 等［5］采用
蛋白磷酸酶-比色法对 MC 进行了检测，检出限在
0. 17 μg /L 左右。Hu 等［6］建立了一种新的 ELISA
·585·
色 谱 第 30 卷
方法对鱼与水样中的 MC 进行检测，该方法的检测
范围在 0. 05 ～ 10 μg /L，最低检出限可达到 0. 024
μg /kg。但是蛋白磷酸酶抑制试验和 ELISA法检测
的均为 MC 的总量，同时存在着较高的假阳性比率。
近年来随着大型仪器的普及与应用，高效液相色谱
法(HPLC)［7，8］ 与 高效液相色谱-质谱联用法
(HPLC-MS)［9 － 15］被广泛应用于 MC 的定性检测，
且主要针对环境水样［8，15，16］与鱼类样品［8，11］。如
Law rence 等［8］采用 HPLC 测定了蓝藻、鱼、水样品
中 MC-RR、MC-YR、MC-LR 和 MC-LA，在上述样品
中的检出限分别为 0. 03 μg /g、0. 03 μg /g、0. 02
μg /L。本文发展了螺旋藻保健品中 MC 的痕量分
析技术，采用 70%(体积分数，下同)的甲醇超声提
取，冷冻离心沉淀杂质后，经 HLB 固相萃取(SPE)
柱净化，以超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-
MS /MS)同时检测了 7 种 MC。与传统的检测方法
相比，本方法的最低检出限可达 6. 7 μg /kg，并可同
时满足定性、定量的需要，更适用于螺旋藻保健品及
水样中 MC 的检测。
1 实验部分
1． 1 仪器与试剂
ACQUITYTM 超 高 压 液 相 色 谱 仪 和 Mi-
cromass-Quattro Premier XE 质谱仪(美国 Wa-
ters 公司) ，AllegraTM X-22R型离心机(美国 Beck-
man 公司) ，氮吹浓缩仪(美国 Organomation Asso-
ciates 公司) ;Oasis HLB 固相萃取小柱(6 mL，150
mg)和 Oasis MCX固相萃取小柱(6 mL，150 mg)
(美国 Waters 公司)。
甲醇、乙腈和乙酸铵均为色谱纯(迪马公司) ，
甲酸(纯度为 99%，Ameisensaeure 公司) ，浓氨水
(优级纯，北京化工厂) ;超纯水(电阻率为 18. 2 MΩ
·cm，Millipore 公司超纯水器制备)。
MC 标准品:MC-LF、MC-LR、MC-YR、MC-RR、
MC-LW、MC-LA、MC-LY 均购自瑞士 Alexis 公司，
纯度 ＞ 95. 0%。精确称取一定量的标准品，以甲醇
为溶剂，分别制备质量浓度为 100 mg /L 的标准储
备液，于 － 20 ℃冰箱中保存。需要时各取储备液
0. 1 mL置于 10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释成 1
mg /L的混合标准液。
1． 2 样品前处理
准确称取螺旋藻保健品 1. 0 g，样品经 10. 0 mL
70%甲醇溶液以 200 r /min 的速率振荡提取 20
min，再以 8 000 r /min 于 4 ℃离心 10 min，将上清
液分离，并重复提取一次。合并两次上清液，用超纯
水定容至 100 mL，待净化。Oasis HLB 柱经 6 mL
甲醇、6 mL 水活化。提取液上柱后，采用 6 mL 纯
水、6 mL 20%甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，以
5 mL纯甲醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液以氮气流
吹干，用初始流动相复溶后过 0. 22 μm 有机滤膜，
滤液供仪器测定。
1． 3 分析条件
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色
谱柱(100 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm)。流动相:A相为
乙腈，B 相为 0. 2 mmol /L乙酸铵溶液。梯度洗脱程
序:0 ～5 min，20%A ～ 90% A;5 ～ 6 min，90% A;6
～6. 5 min，90% A ～ 20% A。流速:250 μL /min;柱
温:40 ℃;进样量:5 μL。
电喷雾电离正离子模式(ESI +) ;质谱扫描方
式:多反应离子监测(MRM) ;脱溶剂气:氮气;碰撞
气:氩气;离子源温度:100 ℃;脱溶剂气温度:450
℃;流速:700 L /h;毛细管电压:3. 0 kV;锥孔电压:
35 V。具体质谱参数见表 1。
表 1 7 种MC在MRM模式下 UPLC-MS /MS分析的质谱参数
Table 1 MS parameters for 7 MCs by UPLC-MS /MS
in MRM mode
Compound
tR /
min
Parent
ion
(m /z)
Daughter
ion
(m /z)
Cone
voltage /
V
Collision
energy /
eV
MC-YR 2． 31 1045． 4 106． 8 80 70
135 80 65
MC-LR 2． 33 995． 4 106． 9 70 70
135 70 70
MC-LA 2． 47 910 135 50 50
357． 1 50 30
MC-LY 2． 58 1002． 52 135 45 50
265． 15 45 50
MC-RR 2． 59 519． 8 126． 85 45 45
135 45 30
MC-LW 2． 9 1025． 4 135 50 60
212． 9 50 60
MC-LF 2． 97 986． 4 135 45 60
213 45 55
2 结果与讨论
2． 1 仪器条件的优化
首先利用流动注射的方式进行了 MS 条件的优
化:对各种待测化合物的毛细管电压、锥孔电压、离
子源温度、脱溶剂温度等条件进行了确定，并对不同
化合物的碰撞能量进行了优化，得到的各物质的特
征离子和碰撞能量如表 1 所示。由于 MC 具有多肽
类结构，其分子结构中存在羟基与氨基等极性基团，
极易生成［M + H］+与［M + 2H］2 +离子［15］，尤其以
MC-RR和 MC-LW最为明显。为了确定这两种 MC
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第 6 期 李 兵，等:超高效液相色谱-串联质谱法检测螺旋藻保健品中 7 种微囊藻毒素
的母离子，本文分别对比了 MC-RR 及 MC-LW 的
［M + H］+ 与［M + 2H］2 + 的二级碎片离子的响应
值。结果表明 MC-RR 的［M + 2H］2 + 离子(m /z
520)作为母离子可以得到响应更强的二级离子碎
片，而 MC-LW的［M + H］+离子(m /z 1 025)比［M
+ 2H］2 + 离子(m /z 514)的二级特征离子响应更
高。因此，最终选择［M + 2H］2 +离子作为 MC-RR
母离子，而［M + H］+离子作为 MC-LW母离子。
然而，对于 MS 检测器而言，不同的液相体系也
会影响目标化合物的离子化效率，从而影响目标化
合物的检测灵敏度。为增强目标化合物的离子化效
率，通常在流动相中添加一定量的甲酸［15］。本实验
亦采用甲醇-(0. 02% ～ 0. 1%)甲酸溶液、乙腈-
(0. 0% ～0. 1%)甲酸溶液等为流动相进行一系列预
试验。结果发现乙腈体系的响应值优于甲醇体系。
并且随着甲酸含量的降低，MC-RR 的响应明显下
降，而 MC-LR与 MC-YR等 6 种 MC 的响应值呈明
显的上升趋势。当甲酸比例降为 0 时，MC-LF、MC-
LW、MC-LA、MC-LY的峰形出现严重拖尾。水相中
加入一定量的乙酸铵后峰形恢复正常，但随着水相
中乙酸铵浓度升高，MC-RR 响应值下降。因此，最
终将流动相确定为乙腈-0. 2 mmol /L 乙酸铵溶液
体系。
2． 2 提取溶剂的选择
动物性水产品中 MC 的提取方法已有报
道［6，9，10，16，17］，也有文献报道了蓝藻中 MC 的提取与
制备［15］。本实验参考文献报道选择了不同浓度的
甲醇溶液作提取溶液，优化了螺旋藻保健品中 MC
的提取方法。经验证，70%的甲醇溶液具有更好的
提取效率，可满足大部分 MC 的提取要求。
为达到更好的提取效率，在提取过程中一般会
采用超声、振荡、长时间静置等物理手段以使目标物
自样品中充分析出。但 Smith 等［18］的研究也指出，
在 MC 的加标试验中提取效率随着提取时间的延长
而呈现明显的下降趋势。主要原因是 MC 与样品中
的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽特异性地结合［9］。由于
该结合过程为不可逆反应，且一般认为结合态的
MC 不会对人体带来危害，因此检测主要针对游离
态的 MC。针对这种现象，本实验缩短了螺旋藻样
品的提取时间，样品采用 200 r /min 的速率振荡提
取 20 min 的方式来进行提取。
2． 3 SPE柱的对比优化
在生物样品分析中常会遇到基质效应的问题，
由于离子抑制作用会降低回收率和精确度，而且增
加仪器维护成本和时间，因此样品前处理过程中需
采用可靠的净化手段去除杂质，以便后续的检测。
SPE 是目前 MC 分析中应用最为广泛的前处理技
术。由于 MC 是一种由氨基酸组成的环肽类化合
物，所含有的氨基(－NH2)和羧基(－COOH)具有一
定的极性。因此 MC 的氨基和羧基基团在溶液中通
常会呈现出带正电荷或负电荷的特性，因此实验最
终在净化时选用了 Oasis HLB 小柱。同时优化了
HLB 小柱的淋洗与洗脱条件，空白螺旋藻加标水平
为 200 μg /kg，分别用 0%、10%、20%、30%、40%、
50%、70%和 100%甲醇作淋洗液，考察 MC 的损失
情况。结果表明，淋洗液中甲醇的含量超过 30%
后，目标物均会受到不同程度的洗脱，因此淋洗液中
甲醇的含量不应超过 30%。
实验对洗脱液的用量分别为 2、3、4、6、8、10 mL
时目标物的回收率进行了比较。由图 2 可看出随着
洗脱液用量的增加，目标物的回收率亦增加，当洗脱
液的用量为 3 mL 时，仍有部分目标物未被完全洗
脱下来。为了保证目标物的完全洗脱，最终确定洗
脱液的用量为 5 mL。
图 2 洗脱液体积对MC回收率的影响
Fig． 2 Effect of the elution volume on
the recoveries of MCs
Sample:blank Spirulina spiked w ith MC standards at 200
μg /kg．
2． 4 精密度与准确度
为消除基质抑制作用，以阴性螺旋藻样品制作
空白基质溶液，分别添加相应的标准品制备空白基
质匹配的混合标准溶液，其 MRM 谱图见图 3。分别
以各分析物的峰面积(y)和对应的含量(x，
μg /kg)进行线性回归计算，得到线性方程和相关系
数(见表 2)。在线性范围内，各分析物均有良好的
线性关系(相关系数(r)均不小于 0. 995)。检出限
采用空白基质溶液加标的方式上机测定，以信噪比
(S /N)为 3 对应的含量作为方法的检出限，以 S /N
为 10 对应的含量作为方法的定量限，结果见表 2。
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色 谱 第 30 卷
图 3 空白基质匹配的混合标准溶液(40 μg /L)的MRM谱图
Fig． 3 Chromatograms of blank matrix-matched
standard (40 μg /L)in MRM mode
表 2 7 种MC的线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限
Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation
coefficients (r)，limits of detection (LODs)
and limits of quantification (LOQs) of 7
MCs
Compound
Linear
range /
(μg /kg)
Linear
equation
r
LOD /
(μg /
kg)
LOQ /
(μg /
kg)
MC-LY 20 － 80 y = 17． 3x + 0． 992 0． 995 6． 7 20
MC-LA 100 － 400 y = 31． 9x － 618． 937 0． 995 33． 3 100
MC-LW 40 － 160 y = 59． 2x － 322． 176 0． 996 13． 3 40
MC-LF 40 － 160 y = 60． 3x － 107． 906 0． 998 13． 3 40
MC-YR 100 － 400 y = 102． 7x － 539． 676 0． 996 33． 3 100
MC-LR 100 － 400 y = 205． 7x － 814． 745 0． 997 33． 3 100
MC-RR 40 － 160 y = 236． 7x － 131． 268 0． 995 13． 3 40
y:peak area;x:content o f the analyte，μg /kg．
在 1. 0 g 空白螺旋藻中添加不同量的混合标准
溶液，按实验条件进行处理后测定，计算方法的加标
回收率。空白样品中 7 种 MC 的加标回收率在
87. 5% ～97. 9%之间，相对标准偏差(RSD)在 1. 6%
～6. 9%之间(见表 3)。结果表明所建立的方法准
确可靠，重复性好，灵敏度高，且加标样品中目标物
的特征子离子丰度比与标准物基本一致，满足质谱
方法的确证要求。
表 3 空白螺旋藻中 7 种MC的加标回收率
Table 3 Recoveries of 7 MCs spiked in
a blank Spirulina sample
Compound Spiked /(μg /kg) Recovery /% RSD /%
MC-LY 20 93． 5 5． 9
30 87． 5 5． 6
40 90． 3 6． 9
MC-LA 100 96． 0 3． 0
150 92． 1 6． 4
200 91． 3 2． 8
MC-LW 40 94． 3 5． 1
60 89． 7 4． 1
80 90． 6 4． 7
MC-LF 40 88． 6 6． 4
60 91． 8 4． 8
80 92． 4 5． 6
MC-YR 100 97． 9 1． 6
150 93． 7 5． 7
200 96． 6 2． 7
MC-LR 100 97． 7 2． 3
150 95． 6 5． 0
200 93． 8 3． 6
MC-RR 40 95． 2 2． 8
60 95． 8 3． 2
80 96． 8 3． 2
2． 5 实际样品的检测
采用所建立的方法对所采集的 11 个品牌的 24
份螺旋藻样品进行了测定，测定结果表明从上述样
品中未检出所测定的 7 种 MC。由于所采集的样品
品牌相对单一，样本量较少，因此还不能根据该测定
结果来确定该类产品的质量，我们计划扩大采集样
品的种类，开展进一步的筛查。另外，对实验室培养
的铜绿蓝藻培养液进行了测定，测得其中 MC-LR的
质量浓度为 18. 2 ～ 20. 23 μg /L。
3 结语
本文建立了螺旋藻保健品中 7 种 MC 的 UPLC-
MS /MS 检测方法。从实际样品的检测结果来看，本
方法准确可靠，灵敏度度高，适用于螺旋藻保健品及
水样中 MC 多残留的确证定量检测，对螺旋藻保健
品中 MC 污染水平的评价具有较好的应用价值。
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