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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):102-109
收稿日期 ：2015-06-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31101427），国家“863”项目（2013AA102602），广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻
1222009-2c），山东省生物资源创新项目，山东省农业科学院青年英才培养计划
作者简介 ：钟瑞春，男，副研究员，研究方向 ：花生育种和栽培，E-mail ：rczhong6501@163.com ；李婷婷为本文并列第一作者
通讯作者 ：赵传志，男，副研究员，研究方向 ：花生基因组学和遗传育种 ；E-mail ：chuanzhiz@126.com
花生温度诱导载脂蛋白基因 AhTIL1 的克隆和表达研究
钟瑞春1  李婷婷2，3  唐荣华1  王兴军2，3  李翠2  侯蕾2  赵传志2，3
（1. 广西农业科学院经济作物研究所，南宁 530007 ；2. 山东省农业科学院生物技术研究中心 山东省作物遗传育种与生态生理重点实验室，
济南 250100 ；3. 山东大学生命科学学院，济南 250100）
摘 要 ： 温度诱导的载脂蛋白（temperature induced lipocalins，TILs）与植物在热、冷、光、氧化等胁迫下的稳定性相关，
旨在克隆花生中的温度诱导的载脂蛋白基因，分析其在响应低温、高温中的作用。从花生 cDNA 文库中筛选到一个 TIL 候选基因，
命名为 AhTIL1，通过 PCR 扩增获得了其基因组和候选启动子的序列，并利用实时定量 PCR 等方法检测了该基因在花生不同组织、
种子不同发育时期和温度胁迫下的相对表达量。序列分析结果表明，该基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）为 558 bp，
编码 185 个氨基酸。生物信息学分析显示，推测的 AhTIL1 蛋白质相对分子质量为 21.4 kD，等电点为 6.78。序列比对结果显示，
该蛋白氨基酸序列同其他物种 TIL 蛋白显示出很高的同源性。对候选启动子预测结果表明，该基因的候选启动子包含 ACE、Box4、
G-box、GAG-motif 等与光反应相关的调控元件以及与 ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的顺式调控元件。基因芯片和 RNA-
Seq 结果表明，该基因在花生的根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达，在花中表达量最高，茎中次之，在根中表达量最低 ；
AhTIL1 在果针入土后表达量下降，随着荚果的膨大和种子的成熟，AhTIL1 的表达量逐渐增加。实时定量 PCR 结果证明，AhTIL1
在高温和低温诱导 3、6、12 和 24 h 后上调表达，在 48 h 后表达量下降。AhTIL1 可能在花生响应低温、冷胁迫中发挥着重要的作用。
关键词 ： 花生 ；温度诱导载脂蛋白 ；基因克隆 ；表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.013
Cloning and Expression Analysis of Temperature Induced Lipocalin
Gene AhTIL1 of Peanut（Arachis hypogaea）
ZHONG Rui-chun1 LI Ting-ting2，3 TANG Rong-hua1 WANG Xing-jun2，3 LI Cui2 HOU Lei2
ZHAO Chuan-zhi2，3
（1. Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 ；2. Bio-tech Research Center，Shandong
Academy of Agricultural Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Ecology and Physiology，
Ji’nan 250100 ；3. College of Life Sciences，Shandong University，Ji’nan 250100）
Abstract: The temperature-induced lipocalins（TILs）is correlated with the stability of plant under stress environment of hot，cold，
lighting，and oxidizing. This study intended to clone the TIL gene from peanut and analyze its function in response to temperature stress. A gene
encoding TIL，designated as AhTIL1，was screened from the peanut cDNA library. The relative expressions of the gene in the different tissues
of peanuts，at the different stages of seeds，and under the temperature stress were detected by quantitative PCR. The results of sequence
analysis showed that the length of the ORF of AhTIL1 was 558 bp，encoding 185 amino acids. The bioinformatics analysis indicated that the
predicted molecular mass of encoded protein was 21.4 kD，ad pI was 6.78. Sequence alignment displayed that the amino acids of AhTIL1 were
in high homology with TIL of other species. The predicted results of candidate promoter showed that the candidate gene promoter contained
regulatory elements associated with the light reaction such as ACE，Box4，G-box，GAG-motif etc.，and other related cis regulatory elements
such as ABA，salicylic acid，gibberellin，anaerobic etc. Microarray and RNA-seq results showed that AhTIL1 expressed in roots，stems，
2016,32(4) 103钟瑞春等：花生温度诱导载脂蛋白基因 AhTIL1的克隆和表达研究
花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料
作物和经济作物，发展花生生产对于保障我国粮油
安全具有重要意义。花生种植和生产过程中经常受
到不利环境因素的影响，例如盐胁迫、高温胁迫等
都严重影响花生的产量和品质［1-3］，干旱胁迫不仅
影响花生的产量，而且也容易造成黄曲霉毒素的污
染［1］。越来越多的研究表明，温度诱导的载脂蛋白
（TIL）对于植物响应温度胁迫具有重要的作用。
载脂蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中，
是一类具有多种功能的胞外分泌小分子蛋白质［4，5］，
最显著的特点是具有 3 个保守的 SCR（Structurally
conserved region）结构域以及由 8 条反向平行的折
叠片层形成的 β 桶状结构［6］。在植物中，载脂蛋白
可以分为温度诱导的载脂蛋白（Temperature induced
lipocalins，TILs）和叶绿体载脂蛋白（Chloroplastic
lipocalin，CHL）。植物 TIL 和 CHL 在序列上和哺乳
动物的载脂蛋白（Apolipoprotein D）、细菌的载脂蛋
白（Lipocalin Blc）和昆虫的 Lazarillo protein 蛋白同
源［7］。植物在生长过程中会经常面对低温、高温、
干旱、盐碱等各种不利的环境因素，在受到胁迫后，
植物体内一些基因的表达会被诱导，间接或者直接
地参与植物的抗逆反应。在拟南芥中，温度诱导的
载脂蛋白（TIL）被认为是增加耐热性的必要因子［8］。
Kawamura 等［9］发现在低温诱导下拟南芥 TIL 蛋白
的积累显著增加［9］，随后的研究进一步表明在拟南
芥和水稻中 TIL 基因在低温和高温下均上调表达［10］。
反向遗传学证据表明，当 TIL 被敲除后，突变体对
除草剂、温度和光照更加敏感，在温度骤然减低、
除草剂处理，或将植物由黑暗环境转移到光照环境
下存活率大大降低。相反，过量表达 TIL 能够增强
拟南芥在冷冻、除草剂和光照胁迫下的适应性［11］。
最近的研究证实，TIL 蛋白可以通过调节离子的平
衡保护叶绿体的稳定，被认为是增加植物耐盐性的
重要因子［12］。叶绿体载脂蛋白基因（CHL）的表达
也响应干旱、光照、除草剂、ABA 等胁迫，但对盐
胁迫和温度胁迫并不敏感［13］。TIL 和 CHL 在响应逆
境胁迫的分工不同，但两者在保护脂质和延长种子
寿命上都发挥着重要的功能［14］。
载脂蛋白最基本的生物学功能是结合并转运脂
肪酸、类固醇、信息素、类维生素 A 等输水的配体。
越来越多的证据表明，载脂蛋白与植物的环境适应
性密切相关。花生在种植和储存过程中，也会面对
高温、低温、干旱等自然灾害，但对花生中的温度
诱导的载脂蛋白却鲜有研究。本研究以花生栽培品
种鲁花 14 号为材料，通过构建 cDNA 文库和高通量
测序，克隆花生 AhTIL1 cDNA 的全长序列 ；进一步
获得 AhTIL1 的基因组序列及其候选启动子序列，通
过生物信息学手段对其候选启动子序列、蛋白结构
等进行分析 ；通过实时定量 PCR 等手段对其在不同
组织及在冷、热处理下的表达量进行分析，旨为花
生 TIL 基因的功能鉴定和利用研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
栽培花生品种鲁花 14 号、大肠杆菌 DH5α 由
本实验室保存。高保真 Taq 酶购自北京全式金生
物公司，RNA 提取试剂、反转录试剂盒、普通 Taq
酶、pMD18-T Vector 购自大连 TaKaRa 公司 ；引物由
Invitrogen（上海）贸易有限公司合成 ；质粒提取和
琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 Sangon（上海）工程技
术有限公司 ；DNA Marker 购自北京天为时代生物有
限公司。
1.2 方法
1.2.1 构建花生 cDNA 文库并进行 EST 测序 收集
花生中果针入土 10-60 d 的未成熟花生种子，依据
RNAgent 试剂盒（Promega）的方法提取总 RNA 和分
离 纯 化 mRNA， 按 pBluescript II cDNA（Stratagene，
USA）的试剂盒构建花生种子的 cDNA 文库。花生
leaves，flowers，peg，and seeds，the highest in the flowers，second highest in the stems，and the least in the roots. After the peg penetrating
into soil，the expression level of AhTIL1 decreased immediately，and then increased gradually with the enlarging and maturing of seeds. Real
time quantitative PCR result proved that the expression level of AhTIL1 increased after low or high temperature treatment for 3，6，12 and 24 h，
however，decreased after 48 h. These results indicated that AhTIL1 may play an important role in peanut response to temperature stress.
Key words: peanut ；temperature-induced lipocalin ；gene cloning ；expression analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4104
EST 的序列测定采用 T3 和 T7 通用引物，EST 的常
规测序由山东省农业科学院测序中心完成 ；EST 序
列的功能注释通过与已知蛋白进行 BlastX 比对完成。
1.2.2 AhTIL1 基因的克隆 依据花生 EST 功能注
释结果，挑取与其它植物的 TIL 同源的 EST 序列
进行重新测序，结合与其它物种 TIL 基因的序列比
对 和 在 线 软 件 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/projects/gorf）的预测结果确定 AhTIL1 的编码区。
根据 AhTIL1 的序列设计基因克隆引物 pAhTIL1F ：
5-GAACAACAACAACTACAACAAAA-3 和 pAhTI-
L1R ：5-TTTATTTATAACATGGAATAACTCT-3。 将
AhTIL1 的 cDNA 序 列 信 息 与 花 生 二 倍 体 野 生 种
Arachis duranensis 和 Arachis ipaensis 全基因组序列数
据库进行比对（http://peanutbase.org/）。根据 AhTIL1
和野生花生基因组比对的结果设计启动子克隆引
物 ppAhTIL1F ：5-TGCTAATTTTATTGATTTTG-3 和
ppAhTIL1R ：5-GAACATAGAACTTGACCTTGA-3。
利用 CTAB 法提取花生基因组 DNA，分别以基因
组 DNA 和 cDNA 为模板进行 PCR，条件为 ：94℃ 3
min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1.5 min，31 个 循
环 ；72℃ 7 min ；4℃结束反应。PCR 后，用 1% 琼
脂糖电泳检测结果。切胶回收目的条带 DNA，连接
到 pMD18-T 的克隆载体上进行 DNA 序列的测定。
1.2.3 AhTIL1 的生物信息学分析 用 DNAstar 预测
花生 AhTIL1 基因编码蛋白质的氨基酸数、分子量、
等电点。用在线软件 PlantCARE（http://bioinformati
cs.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 分 析 AhTIL1
的 候 选 启 动 子 的 顺 式 元 件。 用 多 序 列 比 对 软 件
ClustalW 1.83 对 AhTIL1 和大豆、苜蓿、拟南芥等植
物的 TIL 蛋白进行多序列同源比对和进化树分析，
输出的文件通过 BOXSHADE 3.21 进行着色［15］。
1.2.4 AhTIL1 基因的表达分析 花生 cDNA 芯片的
制备和种子不同发育时期的表达谱分析由上海博星
公司完成。在试验地中收集花生根、茎、叶、花、
果针和成熟种子，以及花生果针入土后（Date after
pegging，DAP）15、25、35、45 和 70 d 的 花 生 种
子，提取总 RNA 进行芯片杂交。以营养钵中生长
两个星期、长势比较一致的花生植株为材料，分
别 用 高 温（42℃） 和 低 温（8℃） 处 理 花 生 0、3、
6、12 和 24 h。 分 别 提 取 不 同 处 理 下 花 生 叶 片 的
总 RNA， 用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis
Kit 合 成 cDNA， 根 据 AhTIL1 基 因 的 序 列 设 计 引
物 ：ahTILRTF ：5-TCCATTCTTGCCTATCATCCC-3，
ahTILRTR ：5-CTCCTCATCTAATCGGTTCTGC-3。
用 Actin 基因作为内参，引物为 ：ahActinF ：5-GTC-
ATCGTCATCCTCTTCTC-3，ahActinR ：5-CATTCC-
TGTTCCATTGTCAC-3。采用 FastStart SYBR Green 试
剂盒（Roche）在 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上进行
PCR 反应，程序为 ：预变性 95℃ 10 min ；95℃ 30
s，59℃ 1 min，35 个循环 ；测定熔解曲线 95℃ 15 s，
60℃ 15 s，95℃ 15 s。每个反应设 3 次重复，根据
熔解曲线来检测 PCR 产物的特异性，基因表达水平
的测定使用相对表达，用 2- △△ CT 的方法计算。
2 结果
2.1 基因序列克隆及序列分析
提 取 花 生 总 RNA（ 图 1-A）， 反 转 录 后 构 建
cDNA 文库，从 cDNA 文库中筛选并克隆到 1 个 TIL
基因（662 bp），包含一个 558 bp 的开放阅读框，将
其命名为 AhTIL1。AhTIL1 编码 186 个氨基酸，其中
59 个为疏水氨基酸。推测 AhTIL1 蛋白质的相对分
子质量为 21.4 kD，等电点为 6.78。提取了花生基因
组 DNA（图 1-B），通过在花生基因组中进行扩增，
获得了 AhTIL1 基因的基因组序列，长度为 790 bp，
包含 1 个内含子和 2 个外显子（图 1-C，图 2）。
与 其 他 植 物 TIL 蛋 白 的 比 对 结 果（ 图 3） 表
明，花生 AhTIL1 与其它植物的 TIL 具有较高的同
源性，与番茄的同源性高达 86%，与拟南芥 AtTIL1
（At5g58070） 的 同 源 性 为 77%。 花 生 AhTIL1 蛋 白
的第 11-27 位氨基酸为 SCRI 区，通过比较发现该
区段包含一段非常保守的序列“RYMGRWYEIA”。
SCRII 和 SCRIII 的保守性较差，但是分别在各自特
异氨基酸“D”和“R”上非常的保守（图 3）。系统
进化树结果（图 4）表明，花生 AhTIL1 与番茄、烟
草、蓖麻等物种中 TIL 的亲缘关系较近，与百脉根、
大豆次之。
利用 PlantCARE 对候选启动子的预测结果表明，
AhTIL1 基因的候选启动子包含 ACE、Box4、G-box、
GAG-motif 等与光反应相关的调控元件，候选启动子
区域包含与 ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的
2016,32(4) 105钟瑞春等：花生温度诱导载脂蛋白基因 AhTIL1的克隆和表达研究
顺式调控元件（表 1）。
2.2 AhTIL1基因的表达分析
花 生 cDNA 芯 片 的 杂 交 结 果（ 图 5-A） 显 示，
AhTIL1 在花生根、茎、叶、花和种子中均有表达，
在花中的表达量最高，茎中次之，在根中表达量最
低，即地上部分（茎、叶、花、果针）的表达量要
高于地下部分（根和种子）。芯片杂交检测花生果针
入土（Days after pegging，DAP）15、25、35、45 和
75 d AhTIL1 的表达量，结果（图 5-B）显示 DAP15
和 DAP25 时期 mRNA 表达水平最低，在种子成熟的
中后期，随着成熟度的增加 AhTIL1 的表达也随之增
加。在种子成熟后期，种子内脂肪酸等脂类物质的
积累增加，载脂蛋白表达量的增加可能与转运和保
护脂类物质相关。我们通过 RNA-seq 的方法检测了
在即将入土果针（S1）、刚刚入土后 3 d 左右还未膨
大的果针（S2）、入土 9 d 左右刚刚膨大的果针（S3）
中 AhTIL1 的表达量，结果显示，在 S1、S2 和 S3 中
AhTIL1 的相对表达水平（RPKM）分别为 2.842 77、
0.588 875 和 2.198 386。结果表明，在花生果针刚
刚入土后，由于光照、机械刺激等因素的影响，
AhTIL1 的表达量迅速降低，但随着花生胚胎发育的
启动和种子内物质的积累，AhTIL11 的表达量又有
所增加。这表明，花生 AhTIL1 的表达容易受到光信
号的调控，同时也与种子脂质的积累相关。
28S
1 2 1 2M 1 2 3M
18S
5
kb
1
kb
5S
A B C
A ：1，2 ：总 RNA 的提取 ；B ：1，2 ：基因组 DNA 的提取 ；C ：花生 AhTIL1 cDNA、基因组和部分启动子序列的扩
增（M ：DNA 分子量标准 DL5000 ；1 ：cDNA ；2 ：基因全长 ；3 ：启动子）
图 1 花生 AhTIL1 基因的克隆$K7,/JHQRPLF1$$7**&**$*$$$*$*$7**&7*7**7*$**$$&&7**$&*7*$$$&*&7$&$7***7&**7**7$&*$*$7$*&*7&&77&&&$7&$$**$K7,/F1$ $7**&**$*$$$*$*$7**&7*7**7*$**$$&&7**$&*7*$$$&*&7$&$7***7&**7**7$&*$*$7$*&*7&&77&&&$7&$$**$K7,/JHQRPLF1$77&&$$&&&$$$*$7**7*77*$&$&*$*$*&&$&&7$&$&7&7&$$&*$**$7**$$&&*7*&$7*7*&7&$$7*$*$&77**$*7**7$K7,/F1$ 77&&$$&&&$$$*$7**7*77*$&$&*$*$*&&$&&7$&$&7&7&$$&*$**$7**$$&&*7*&$7*7*&7&$$7*$*$&77**$*7**7$K7,/JHQRPLF1$**&$$$$*$**&77&$77*$$**7$&7*&$7$&$$**&7*$7&&&$$7$*&*$7*$$*&7$$*&7&$$**7&$$*7777$7*77&&7&&$$K7,/F1$ **&$$$$*$**&77&$77*$$**7$&7*&$7$&$$**&7*$7&&&$$7$*&*$7*$$*&7$$*&7&$$**7&$$*7777$7*77&&7&&$$K7,/JHQRPLF1$77&77*&&7$7&$7&&&7*77$&7**7*$&7$77***77&7&77&$77*$7&$$*$77$7&$*7$7*&&&7&$77**&&$$&&&$*7$**$K7,/F1$ 77&77*&&7$7&$7&&&7*77$&7**7*$&7$77***77&7&77&$77*$7&$$*$77$7&$*7$7*&&&7&$77**&&$$&&&$*7$**$K7,/JHQRPLF1$$*$7$7&777***7$$*77$$777&7&7&7&777777&*&7777&&$7*7&$$$*77*77$7&7777&$&$$$7***7*7*77**777**$K7,/F1$ $*$7$7&777**$K7,/JHQRPLF1$$$7***$$*$7&$$$**&*$$$&$777**$777&7&$$77****77*7&$777*$$$$7$7*77**$$7*77*$$7$$**7*$$7&$$$7$K7,/F1$ $K7,/JHQRPLF1$*7$*7*$$$7$*77**$*77*$77$7*$7*7*&7&$777&77&7&$7&7**7$7777*&777$*$7$77*7&$$**&$7$$&&*$77$*$$K7,/F1$ $7$77*7&$$**&$7$$&&*$77$*$$K7,/JHQRPLF1$7*$**$*$7&77&$$7*$*&77*77&$*$$$*&7$$**$**7****7$7*$7*7*$*&$$$&7&&$&$$*$&7&&$&$7$*7*$*$&$&&$K7,/F1$ 7*$**$*$7&77&$$7*$*&77*77&$*$$$*&7$$**$**7****7$7*$7*7*$*&$$$&7&&$&$$*$&7&&$&$7$*7*$*$&$&&$K7,/JHQRPLF1$$&&$*$***$*$$*$$**&&&&$$$*$&$&&$$$**&$777**7**$77$$$7&&$77&7****$*$7$*$K7,/F1$ $&&$*$***$*$$*$$**&&&&$$$*$&$&&$$$**&$777**7**$77$$$7&&$77&7****$*$7$*
图 2 花生 AhTIL1 基因组和 cDNA 的序列（阴影部分为外显子）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4106㣡⭏ Arachis hypogaea L.⮚㤴 Solanum lycopersicumgi:350539735Ⲯ㜹ṩ Lotus japonicusgi:388518293㬆哫 Ricinus communisgi:255565025✏㥹 Nicotiana tabacumgi:669253418བྷ䉶 Glycine maxgi:351734470ỹ㣡 Gossypium arboretumgi:77744897ᶘṁ Populus trichocarpagi:566215395㤌㬯 Medicago truncatulagi:357480171ᤏই㣕 Arabidopsis thalianagi:15242942㨌䉶 Phaseolus vulgarisgi:593783743⋩㨌 Brassica napusgi:674888819㪑㨴 Vitis viniferagi:526117984儈㋡ Sorghum bicolorgi:242065756⦹㊣ Zea maysgi:226530914≤に Oryza sativagi:115476610㣡⭏ Arachis hypogaea L.⮚㤴 Solanum lycopersicumgi:350539735Ⲯ㜹ṩ Lotus japonicusgi:388518293㬆哫 Ricinus communisgi:255565025✏㥹 Nicotiana tabacumgi:669253418བྷ䉶 Glycine maxgi:351734470ỹ㣡 Gossypium arboretumgi:77744897ᶘṁ Populus trichocarpagi:566215395㤌㬯 Medicago truncatulagi:357480171ᤏই㣕 Arabidopsis thalianagi:15242942㨌䉶 Phaseolus vulgarisgi:593783743⋩㨌 Brassica napusgi:674888819㪑㨴 Vitis viniferagi:526117984儈㋡ Sorghum bicolorgi:242065756⦹㊣ Zea maysgi:226530914≤に Oryza sativagi:115476610㣡⭏ Arachis hypogaea L.⮚㤴 Solanum lycopersicumgi:350539735Ⲯ㜹ṩ Lotus japonicusgi:388518293㬆哫 Ricinus communisgi:255565025✏㥹 Nicotiana tabacumgi:669253418བྷ䉶 Glycine maxgi:351734470ỹ㣡 Gossypium arboretumgi:77744897ᶘṁ Populus trichocarpagi:566215395㤌㬯 Medicago truncatulagi:357480171ᤏই㣕 Arabidopsis thalianagi:15242942㨌䉶 Phaseolus vulgarisgi:593783743⋩㨌 Brassica napusgi:674888819㪑㨴 Vitis viniferagi:526117984儈㋡ Sorghum bicolorgi:242065756⦹㊣ Zea maysgi:226530914≤に Oryza sativagi:115476610
1
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SCRI
SCRII SCRIII
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65
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65
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145
146
161
158
140
图 3 花生 AhTIL1 与其它植物同源蛋白的序列比对
用高温（42℃）和低温（8℃）处理花生 0、3、
6、12 和 24 h，用实时定量 PCR 检测 AhTIL1 的相对
表达量。结果（图 6）表明，AhTIL1 在高温和低温
诱导后的表达趋势一致，即在处理 3、6、12 和 24 h
后其表达量逐渐增加，在 48 h 后表达量下降。在高
温和低温处理 24 h 后，AhTIL1 基因的表达水平分别
比对照上调 6 倍和 3 倍。结果提示，AhTIL1 可能在
花生响应高温和冷胁迫过程中发挥着重要的作用。
3 讨论
随着全球变暖，农业生态环境不稳定，温度、
干旱等非生物胁迫成了制约农作物种植的重要因素。
从植物中挖掘耐逆相关的基因资源，利用这些基因
资源提高农作物的抗性是未来分子育种需要解决的
问题。温度诱导载脂蛋白最基本的生物学功能是与
2016,32(4) 107钟瑞春等：花生温度诱导载脂蛋白基因 AhTIL1的克隆和表达研究
配体结合，在人、动物和微生物中的研究表明 TIL
与细胞膜的稳定性相关［16-18］。近年来，植物中的
TIL 也陆续被报道。研究结果证实，在受到低温或
高温胁迫后，拟南芥、小麦和番茄的 TIL 基因均上
调表达［7，9］。拟南芥 TIL1-GFP 融合蛋白基因转化洋
葱表皮瞬时表达实验表明，拟南芥 TIL 蛋白定位在
膜上，表明植物 TIL 的功能可能也与膜的稳定性相
关［10］。最新的研究表明，TIL 还与保护种子内的脂
类物质和延长种子寿命相关［14］。这些研究表明 TIL
可能在植物耐逆机理研究和作物分子育种中具有重
要的应用潜力。花生是异源四倍体（AABB，2n=
4x=40）植物，是由两个祖先野生种 A. duranensis（A
基因组供体）和 A. ipaensis（B 基因组供体）杂交自
然加倍的结果［19］。近年来随着分子生物学和测序技
术的发展，花生功能基因组学研究取得了长足的进
步，从花生中已经鉴定了大量的抗逆基因［20-23］。本
研究从花生中克隆了花生的载脂蛋白基因 AhTIL1 及
其候选启动子序列，发现该基因也响应低温和高温
subsp.
Group
图 4 TIL 蛋白的进化树分析
表 1 花生 AhTIL1 候选启动子元件预测
调控元件 序列 同源物种 位置 得分 功能注释
TC-rich repeats ATTCTCTAAC Nicotiana tabacum -157 10 involved in defense and stress responsiveness
TCA-element GAGAAGAATA Brassica oleracea -893 9 involved in salicylic acid responsiveness
Skn-1_motif GTCAT Oryza sativa
-513 5
required for endosperm expression
-733 5
P-box CCTTTTG Oryza sativa +937 7 gibberellin-responsive element
GTGGC-motif GATTCTGTGGC Spinacia oleracea +72 10 part of a light responsive element
G-box
CACGTG Arabidopsis thaliana +783 6
involved in light responsiveness
CACGAC Zea mays +806 6
GARE-motif AAACAGA Brassica oleracea
-359 7
gibberellin-responsive element
-576 7
GAG-motif AGAGATG Spinacia oleracea -413 7 part of a light responsive element
circadian CAANNNNATC Lycopersicon esculentum
+3 6
involved in circadian control
+430 6
+493 6
-703 6
Box 4 ATTAAT Petroselinum crispum
+150 6
part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
+20 6
ARE TGGTTT Zea mays -538 6 essential for the anaerobic induction
ACE ACGTGGA Petroselinum hortense +784 7 involved in light responsiveness
ABRE CACGTG Arabidopsis thaliana +783 6 involved in the abscisic acid responsiveness
AAGAA-motif GAAAGAA Avena sativa -986 7 unknown
注 ：N 表示任意一个碱基序列
的胁迫。
在拟南芥中只有一个 TIL 基因，小麦中有 TIL1
和 TIL2 两个基因，研究发现只有 TIL1 响应温度胁
迫，在序列上响应温度胁迫的 TIL1 和拟南芥的 TIL
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4108
有更高的同源性［10］。我们从花生中克隆的 TIL 基因
在序列上与小麦的 TIL1 更接近，而且也能响应温度
胁迫，因此，本研究将在花生中克隆的载脂蛋白基
因命名为 AhTIL1。我们的研究还发现，在花生野生
种 A. duranensis 和 A. ipaensis 中均含有 1 个温度诱导
载脂蛋白同源基因，与鲁花 14 号的 AhTIL1 的同源
性均为 97%，仅从编码区序列上很难判断该基因来
源于哪一个野生种。然而，有意思的是在候选启动
子区域，AhTIL1 与野生种 A. ipaensis 100% 匹配，而
与 A. duranensis 只有 60% 的一致性，这表明 AhTIL1
可能来源于花生的 B 亚基因组。尽管 A. duranensis
中同源基因的候选启动子在序列上与 AhTIL1 差异很
大，但是在候选启动子区域也有与光、ABA 等相关
的调控元件，说明 TIL 的表达和功能在二倍体祖先
种和栽培种中可能具有很高的保守性。另外，在栽
培花生鲁花 14 号中可能还有一个 AhTIL11 的同源基
因，这两个基因的同源性可能很高，揭示这两个基
因的功能和分化将是我们下一步的工作。
4 结论
本研究从花生中克隆了响应温度诱导的载脂蛋
白基因 AhTIL1，分析了该基因的结构和启动子元件，
阐明了其在花生不同组织及种子发育不同时期的表
达特性，证明该基因能够分别响应高温和低温胁迫。
参 考 文 献
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7
6
5
4
3
2
1
0
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
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A B
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图 5 花生 AhTIL1 在不同组织（A）和种子不同发育时期（B）的表达模式
7
6
5
4
3
2
1
0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 3 6ߧ༴⨶ᰦ䰤h12 24 48 0 3 6✝༴⨶ᰦ䰤h12 24 48⴨ሩ
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A B
图 6 花生 AhTIL1 在 8℃（A）和 42℃（B）处理下的表达模式
2016,32(4) 109钟瑞春等：花生温度诱导载脂蛋白基因 AhTIL1的克隆和表达研究
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（责任编辑 马鑫）