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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):111-119
收稿日期：2015-09-18
基金项目：国家自然科学基金项目（31370052），广东省科技项目（2014A030313459，2014A050503058）
作者简介：胡文哲，男，硕士研究生，研究方向：遗传育种与生物技术；E-mail ：huwenzhe1216@163.com
通讯作者：谭志远，男，博士生导师，研究方向：生物固氮和微生物分类；E-mail ：zytan@scau.edu.cn
藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析
胡文哲 谭泽文 王勇 徐羡微 谭志远
（华南农业大学农学院，广州 510642）
摘 要 ： 从广西梧州市藤县药用野生稻中筛选内生固氮菌，为微生物肥料生产收集菌种资源。采用 3 种无氮培养基经平板
划线法筛选内生固氮菌 ；通过乙炔还原法测定其固氮酶活性 ；利用 IS-PCR（Insertion sequence-based PCR）指纹图谱和全细胞蛋白
电泳图谱对获得的内生固氮菌进行聚类分析 ；根据 16S rRNA 基因序列分析确定其进化关系 ；使用分光光度计比色法检测其产生长
素能力、产铁载体能力、溶磷能力和 ACC 脱氨酶活性。结果显示，从野生稻中筛选获得 34 株内生固氮菌分为 5 个类群，类群 I 和
II 各有 8 株，类群 III、IV、V 分别有 2 株、5 株和 11 株，其固氮酶活性介于 5.0 和 1 036.7 nmol/（mL·h）之间。类群 I 代表菌株
HU33 与无乳固氮螺菌（Azospirillum amazonense ATCC 35119T）相似性为 97.13%；类群 II 代表菌株 HU31 与变栖克雷伯氏菌（Klebsiella
variicola DSM 15968T）相似性为 99.71% ；类群 III 代表菌株 HU17 与蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii ATCC 700476T）相似性为
99.86% ；类群 IV 代表菌株 HU13 与黄黄色杆菌（Xanthobacter flavus ATCC 35867T）相似性为 100% ；类群 V 代表菌株 CM05 与越南
伯克霍尔德菌（Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T）相似性为 99.86%。药用野生稻内生固氮菌资源具有遗传多样性 ；有些菌株
有较强的产生长素、产铁载体、ACC 脱氨酶活性和溶磷能力，在农业生产上具有一定的应用潜力 ；类群 I 可能是一个新类群。
关键词 ： 药用野生稻 ；内生固氮菌 ；系统发育分析 ；全细胞蛋白电泳 ；IS-PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.016
Isolation，Identification and Phylogenetic Analysis of Endophytic
Diazotrophs in Tengxian Medical-use Oryza officinalis
HU Wen-zhe TAN Ze-wen WANG Yong XU Xian-wei TAN Zhi-yuan
（College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）
Abstract: This research aims to select the endophytic diazotrophs from wild medical-use Oryza officinalis growing on Teng County
of Guangxi for collecting the strain resources contributing to the production of microbial fertilizer. Endophytic diazotrophs were isolated from
O. officinalis using three selective mediums of free nitrogen and plate streaking method. Acetylene reduction assay was used to determine
the activity of nitrogenase in the endophytic diazotrophs. The SDS-PAGE（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis）
patterns of whole-cell proteins and IS-PCR DNA fingerprinting patterns were employed for the clustering analysis of the isolated endophytic
diazotrophs. The 16S rRNA gene sequences of the representative strains of each group were analyzed to construct the phylogenetic tree. The
abilities of producing auxin，producing siderophores，dissolving phosphorus and the activity of ACC deaminase were tested by colorimetry
of spectrophotometer method. Thirty-four strains of endophytic diazotrophs were isolated from O. officinalis and assigned to 5 groups and their
nitrogenase activity was between 5.0 to 1 036.7 nmol/（mL·h）. Group I and II each had 8 strains. Group III，IV，V had 2，5，11 strains
respectively. The homology of 16S rRNA gene was 97.13% between Group I and Azospirillum amazonense ATCC 35119T，99.71% between
Group II and Klebsiella variicola DSM 15968T，99.86% between Group III and Pseudomonas monteilii ATCC 700476T，100% between Group
IV and Xanthobacter flavus ATCC 35867T，and 99.86% between Group V and Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T. In conclusion，some
strains have the ability of producing auxin，producing siderophores，ACC deaminase activity，and dissolving phosphorus. The results suggest
that endophytic diazotrophs in medical-use Oryza officinalis present genetic diversity and potential applications in agricultural practices ；and
group I probably is new.
Key words: medical-use Oryza officinalis ；endophytic diazotrophs ；phylogenetic analysis ；whole-cell protein electrophoresis ；
insertion sequence-based PCR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6112
药用野生稻是原产中国的 3 种野生稻之一，由
于长期生长在恶劣的自然条件下，药用野生稻经受
了各种自然灾害和不良环境的自然选择，是一种很
稀缺和重要的野生稻种质资源，具有极高的科学研
究价值［1］。
氮素是植物需求量最大的营养元素，长期大量
单一施用化肥会造成肥料利用率低、农产品质量下
降和环境污染，生物固氮可以为农作物提供氮素，
与化肥相比不会降低土壤生产力、不污染环境，还
是取之不尽、用之不竭的廉价氮源［2］。
植物内生固氮菌是指那些定殖在健康植物体内，
与宿主植物进行联合固氮的一类微生物［3］。人们最
早发现于 1986 年从巴西的甘蔗中分离得到内生固氮
菌，迄今不到 30 年［4］。内生固氮菌是植物微生态
系统的天然组分，可以通过固氮作用、产生生理活
性物质、抗逆境、抗动物摄食和拮抗病原菌等作用
从而促进宿主对环境的适应［5］。研究表明某些内生
固氮菌具有促进植物生长、提高作物产量、生物防
治等作用。Glick 等［6］研究表明植物根际促生菌可
产生 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸（1-Aminocyclopropane-1-
carboxylate，ACC）脱氨酶，该酶通过催化乙烯的前
体 ACC 分解成 α-丁酮酸和氨来降低植物体内乙烯的
合成，从而减少过量乙烯对植物生长造成的不利影
响。王桂文等［7］研究认为内生固氮菌对植物的促生
作用主要是通过生物固氮为植物提供氮营养或合成
某些植物生长调节物质，如生长素、赤霉素。还有
研究表明铁载体在植物根际促生菌对土传病害的生
防有重要作用，田方等［8］发现产铁载体菌株可与根
际病原微生物争夺有限铁营养而抑制病原微生物生
长。还有研究表明某些内生固氮菌有强大的溶磷功
能，通过分泌物或吸收作用把土壤中无效态磷转化
为植物可以利用的有效态磷［9］。国内外对很多禾本
科植物内生固氮菌的研究非常多，但是对生长于自
然生态环境的药用野生稻内生固氮菌研究并不多。
本研究采用 3 种选择性无氮培养基从广西藤县
药用野生稻中分离得到 34 株内生固氮菌，通过 IS-
PCR 指纹图谱和全细胞蛋白电泳对所分离的内生固
氮菌进行聚类分析。根据每个类群代表菌株的生理
生化鉴定和 16S rRNA 基因序列分析构建系统发育
树，旨在丰富内生固氮菌的菌种资源库和挖掘其在
农业生产上的潜在应用价值，为微生物肥料生产收
集菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
药用野生稻采集于广西梧州市藤县蒙江镇那塘
村一处山洼。
采用 Döbereiner 改良无氮培养基［10］（简称
DN）、NFb 无氮培养基［10］和 CCM 低氮培养基［11］
3 种选择培养基进行固氮菌的分离与筛选，VM-
Ethanol 培养基［10］进行富集培养。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离纯化和固氮酶活性测定 消毒：将
野生稻的根、茎、叶冲洗干净后，切成 3 cm 左右
小段放入灭菌培养皿中，先用 70%乙醇浸泡 3 min，
再用 0.1% HgCl2 表面消毒 3 min，最后用无菌水振
荡洗涤 5-7 次，每次 5 min，取最后一次洗涤液涂布
LB平板，以检查消毒是否彻底。
分离纯化：将消毒后的根、茎、叶用灭菌剪刀
剪碎，分别接种到 3 种半固体无氮培养基中用反口
胶塞密封，37℃培养 72 h 后向试管中注射 1/10 体积
10% 乙炔（使其终浓度为 1%）再培养 24 h，用气
相色谱仪检查固氮酶活性。将有活性的菌株通过对
应无氮培养基划线分离，待长出单菌落后挑取单菌
落接种至对应半固体培养基，用乙炔还原法检测固
氮酶活性，再次划线分离直至获得纯的菌株，最后
通过镜检观察其形态确定是否纯化。将纯化的菌株
分别用 15% 无菌甘油保存于 -80℃（长期保存）和
-20℃（日常使用）。
固氮酶活性测定：将获得的纯菌株制成 OD600=1
的菌悬液，取 10 μL 菌液接种于 3 mL 相对应的半
固体无氮培养基的 10 mL 试管中，反口胶塞密封。
37℃培养 12 h 后，向管内注射 1/10 体积 10% 乙炔
气体（使其终浓度为 1%），同样条件再次培养 12 h，
从管中抽取 0.5 mL 气体注入气相色谱仪（北京天
普分析仪器厂 SP-2100）中，测定样品 C2H4 和 C2H2
的峰面积。仪器参数为：柱箱温度 80℃，进样器
120℃，FID 180℃。根据下列公式计算固氮酶活性［12］：
EA=（58.0×Se×T×Pe）/（Sb×Te×P×t×V）
（μmol·mL-1·h-1）
2016,32(6) 113胡文哲等：藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析
式中，Se：乙烯峰面积；T：开氏绝对温度（T=273.13
K）；Pe：实验条件下大气压强（Pa）；Sb：乙炔峰面积；
Te ：实验条件下温度（K）；P：绝对大气压强；t ：
培养时间；V：容器体积。
1.2.2 细菌总 DNA 提取 采用溶菌酶破壁提取
DNA，参照毕江涛等［13］方法。
1.2.3 IS-PCR 指纹图谱聚类分析 参照王华荣等［14］
方法，以单引物 J3（5-GCTCAGGTCAGGTGGCCT-
GG-3）为引物，PCR 反应条件为：95℃预变性
3 min ；95℃变性 1 min，56℃复性 50 s，72℃延伸
60 s，35 个循环；72℃延伸 5 min。PCR 产物先用
1.5% 琼脂糖电泳初步分析，再用高分辨率 PAGE 电
泳进一步聚类分析。电泳图谱通过凝胶图像分析软
件 GIS3.74 分析，获得电泳图谱相似性矩阵之后用
软件 TREECON 进行 UPGMA聚类。
1.2.4 SDS-PAGE 全细胞蛋白电泳分析 菌株全细
胞可溶性蛋白提取参照谭志远等［11］方法。
SDS-PAGE 电泳分析：选择 10%分离胶、 5%浓
缩胶进行 SDS-PAGE 电泳，电泳条件先以 60 V 恒压
30 min 左右，待样品进入分离胶之后再以 110 V 恒
压直到溴酚蓝恰好到达胶的底部。为便于比较，在
IS-PCR 聚类基础上，将同一个类群菌株集中在同一
块胶上进行 SDS-PAGE 蛋白图谱分析。
1.2.5 16S rRNA 基因序列分析 参照王华荣等［14］
方法，采用通用引物 25f ：5-AACTKAAGAGTTTGA-
TCCTGGCTC-3 和 1492r ：5-TACGG（C/T）TACCT-
TGTTACGACTT-3（K：G 或 T，Y：C 或 T）进行扩
增，反应条件同 IS-PCR。将 PCR 产物交由睿博兴
科生物技术有限公司，测序引物为 PCR 扩增引物。
将所得序列在 GenBank 数据库中进行比对（Blast），
获得相似性较高的公开发表的模式菌株，再用软件
GeneDoc 进行格式转换和人工比对，比对结果用软
件 TREECON 采用邻比法构建系统发育树。
1.2.6 nifH 基因扩增 参照 Zehr 等［15］方法，采用
正向引物 Zehrf1：5-TGYGAYCCNAARGCNGA-3，反
向引物 Zehrr2：5-NDGCCATCATYTCNCC-3（D：A，
G或 T；N：A，G，C或 T；Y：C或 T；R：A或 G）。
PCR反应条件：97℃预变性 3 min ；97℃变性 1 min，
55℃复性 50 s，72℃延伸 35 s，32 个循环；72℃延
伸 5 min。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.2.7 菌株生理生化鉴定 过氧化氢酶、吲哚产生、
甲基红测定、乙酰甲基甲醇实验、明胶液化、产氨
测定、铁载体检测、NO3
- 还原实验参照赵斌与何绍
江合著的《微生物学实验教程》［16］进行。
溶磷能力定性实验采用点接 PKO培养基［9］，计
算溶磷圈直径与菌株直径比值；定量实验采用钼锑
抗比色法［17］；生长素定量实验采用 Salkowski 比色
法［18］；ACC 脱氨酶活性测定［19］采用 2，4- 二硝基苯
肼比色法，ACC 脱氨酶活性（nmol/mg·h）= 生成
α-丁酮酸含量（nmol）/ 细菌蛋白含量（mg）× 培
养时间（h）。
2 结果
2.1 内生固氮菌的分离、固氮酶活性和部分菌株
nifH基因扩增
从供试材料中共分离到内生固氮菌 34 株，其中
根中分离到 28 株，茎中分离到 4 株，叶中分离到 2
株。各菌株的分离来源和固氮酶活性，见表 1。这
些菌株的固氮酶活性相差很大，从最低的 5.0 nmol/
（mL·h）（HU16）到最高的 1 036.7 nmol/（mL·h）
（HU31），说明其固氮能力存在差异。部分菌株的
nifH基因扩增结果见图 1。
2.2 IS-PCR指纹图谱和UPGMA聚类分析
PCR 扩增产物采用高分辨率 6% PAGE 电泳获
得的 IS-PCR 多态性指纹图谱聚类结果见图 2。利用
凝胶图像处理软件 GIS3.74 进行条带匹配得到同源
性分析表，再利用 TREECON 以 UPGMA 方法聚类，
34 株供试菌株在 81% 的水平上分为 5 个主要类群，
结果见图 3。
2.3 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱
在 IS-PCR 聚类基础上，对 34 株供试菌株进行
SDS-PAGE 全细胞蛋白电泳，电泳图谱见图 4，将得
到的电泳图谱采用同样的方法进行聚类分析，结果
见图 5。
2.4 16S rRNA基因序列分析
根据 IS-PCR DNA 指纹图谱和 SDS-PAGE 全细
胞蛋白电泳聚类结果，挑取每一个类群中固氮酶活
性最高菌株为代表菌株进行 16S rRNA 基因序列测
定，将测定的序列与 GenBank 数据库中的模式菌株
序列比较分析，并构建系统发育树（图 6）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6114
类 群 I 代 表 菌 株 HU33 与 无 乳 固 氮 螺 菌
（Azospirillum amazonense ATCC 35119T） 相 似 性 为
97.13% ；类群 II 代表菌株 HU31 与变栖克雷伯氏菌
（Klebsiella variicola DSM 15968T）相似性为 99.71% ；
类群III代表菌株HU17与蒙氏假单胞菌（Pseudomonas
monteilii ATCC 700476T） 相 似 性 为 99.86% ；类
群 IV 代表菌株 HU13 与黄黄色杆菌（Xanthobacter
flavus ATCC 35867T）相似性为 100%；类群 V 代
表菌株 CM05 与越南伯克霍尔德菌（Burkholderia
vietnamiensis LMG 10929T）相似性为 99.86%。
2.5 代表菌株生理生化鉴定
5 个代表菌株生理生化测定结果（表 2）显示，
所有供试菌株都有过氧化氢酶活性，表明这些内生
固氮菌能将有毒代谢产物过氧化氢分解保护自身；
除了菌株 HU13，其他都有硝酸盐还原和产氨能力，
说明这些菌株在 N循环中可以将硝酸盐还原为亚硝
酸盐和氨，再转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合
物；供试菌株将葡萄糖分解为丙酮酸后，不能再被
分解为有机酸，所以甲基红反应为阴性；除了菌株
HU13，其他菌株显 V.P 阳性反应，表明这些菌株
能使葡萄糖分解为丙酮酸后再通过缩合和脱羧转变
为乙酰甲基甲醇；供试菌株都不能使明胶液化；供
试菌株都能分解蛋白胨中色氨酸产生吲哚；HU17、
HU31、CMO5 能产生铁载体。
供试菌株在生长过程中都能分泌 IAA（3- 吲哚 -
乙酸），菌株分泌 IAA 浓度在 0.5-69.5 μg/mL 之间，
HU31 在有色氨酸存在的情况下产 IAA 远大于其他
菌株，这些生物活性物质可以促进和调节植物生长，
细菌合成 IAA 根据前体中是否包括色氨酸可以分为
色氨酸途径和非色氨酸途径。菌株 HU13、HU17、
HU31 合成 IAA 浓度比不加色氨酸高，说明这 3 株
菌合成 IAA 主要是色氨酸途径，菌株 CM05、HU33
主要是非色氨酸途径；菌株 CM05 和 HU31 能形成
非常明显的溶磷圈（图 7），说明这些菌株可以分泌
出有机酸使无效态的磷酸钙溶解转变为植物可以吸
收利用的有效态磷；供试菌株都有 ACC 脱氨酶活性，
表 1 内生固氮菌的分离部位及各菌株固氮酶活性
菌株 分离部位 固氮酶活性（C2H4）（Λ/nmol·mL
-1·h-1） 菌株 分离部位 固氮酶活性（C2H4）（Λ/nmol·mL
-1·h-1）
HU04 根 44.5 HU36 根 995.5
HUO5 根 32.5 FB01 茎 112.2
HUO6 根 46.4 FB02 叶 92.3
HUO7 根 73.1 FB03 根 109.8
HUO8 茎 73.8 FB04 根 105.9
HUO9 茎 43.2 FB05 根 108.2
HU10 根 84.6 CM01 根 37.4
HU13 根 101.7 CM02 叶 46.5
HU16 根 5.0 CM03 根 49.0
HU17 根 15.8 CM04 根 61.8
HU20 根 80.9 CM05 根 89.9
HU29 根 83.1 CM06 根 58.9
HU30 根 84.0 CM07 茎 59.0
HU31 根 1036.7 CM08 根 62.7
HU32 根 945.9 CM09 根 49.0
HU33 根 76.1 CM10 根 49.2
HU34 根 74.7 CM11 根 63.1
M HU13 HU31 HU33 CM05
bp
2000
1000
750
500
250
100
图 1 部分代表菌株 nifH 基因片段扩增产物电泳图
2016,32(6) 115胡文哲等：藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析
M HU04 HU05 HU06 HU07 HU08 HU09 HU33 HU34 M HU31 HU32 HU36 FB01 FB02 FB03 FB04 FB05
M HU16 HU17 HU10 HU13 HU20 HU29 HU30
bp
2000
1000
750
500
250
100
bp
2000
1000
750
500
250
100
bp
2000
1000
750
500
250
100
M CM01CM02CM03CM04CM05CM06CM07CM08CM09CM10CM11 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
A B
C D
A ：类群 I ；B：类群 II ；C：类群 III（HU16、HU17）和类群 IV（HU10、HU13、HU20、HU29、HU30）；D：类群 V
图 2 IS-PCR 指纹图谱
CM07
HU32
FB05
FB02
FB04
HU34
CM11
CM03
HU07
HU20
CM09
CM10
CM06
CM08
CM04
CM05
CM01
CM02
HU10
HU13
HU29
HU30
HU16
HU17
HU04
HU05
HU09
HU33
HU06
HU08
HU36
FB01
HU31
FB03
908070605040
Group č
Group Č
Group ċ
Group ĊGroup
ĉ
լᙗ r/%
图 3 IS-PCR 指纹图谱聚类树状图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6116
M HU04 HU05 HU06 HU07 HU08 HU09 HU33 HU34 M HU31 HU32 HU36 FB01 FB02 FB03 FB04 FB05
M HU16HU17HU10HU13 HU20HU29 HU30 M CM01 CM02 CM03 CM04 CM05 CM06 CM07 CM08 CM09 CM10 CM11 M
kD
200.0
116.0
97.2
66.4
44.3
kD
200.0
116.0
97.2
66.4
44.3
kD
200.0
116.0
97.2
66.4
44.3
kD
200.0
116.0
97.2
66.4
44.3
Groupĉ GroupĊ
Group ċ Group Č Group č
图 4 内生固氮菌全细胞蛋白电泳图谱
HU07
HU32
CM08
FB04
HU34
HU20
HU31
FB03
FB01
FB02
HU36
FB05
HU04
HU05
HU09
HU33
HU06
HU08
CM09
CM11
CM01
CM02
CM03
CM07
CM04
CM05
CM06
CM10
HU16
HU17
HU09
HU30
HU13
HU10
908070605040
լᙗ r/%
Group Ċ
Group ĉ
Group č
Group ċ
Group Č
图 5 全细胞蛋白电泳图谱聚类树状图
2016,32(6) 117胡文哲等：藤县药用野生稻内生固氮菌分离鉴定及系统发育分析
菌株活性为 23.4-205.3 nmol/（mg·h）。
3 讨论
插入序列（insertion sequence，IS）是最简单的
转座元件，它的两侧是短反向末端重复序列，不同
微生物的插入序列数量和位置存在差异［20］，采用
插入序列作为引物进行 PCR 扩增，扩增产物的大小
和数量也存在差异。微生物属种确定的标准是菌株
与模式菌株的 DNA 同源性≥ 70%［21］，蛋白质是基
因表达的产物，关系密切的细菌在相同生长期蛋白
质组成上会有一定的相似性［10，22］。阳洁等［23］采用
0.02
Azospirillum doebereinerae DSM 13131T AJ238567
Pseudomonas putida ATCC 12633T D84020
Azospirillum fermentarium LMG 27264T JX843282
Pseudomonas fulva ATCC 31418T AB060136
Xanthobacter tagetidis ATCC 700314T X99469
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883T X87276 Klebsiella variicola DSM 15968T AJ783916 HU31 KT354246
Klebsiella michiganensis DSM 25444T JQ070300
Klebsiella terrigena ATCC 33257T Y17658
Pseudomonas monteilii ATCC 700476T AF064458
HU17 KT354245
Burkholderia arboris LMG 24066T AM747630
Burkholderia metallica LMG 24068T AM747632 CM05 KT354247 Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T AF097534
Xanthobacter flavus ATCC 35867T X94199
HU13 KT354244
Xanthobacter autotrophicus ATCC 35674T X94201
Xanthobacter viscosus ATCC BAA-298T AF399970
HU33 KT354243
Azospirillum amazonense ATCC 35119T X79735 Azospirillum canadense LMG 23617T DQ393891 Azospirillum brasilense ATCC 29145T AY324110
100
100
78
100
100
100
73
90
100
86
63
77
100
84
95
100
100
100
100
100
100
81
括号内为菌株号
图 6 代表菌株的系统发育关系
表 2 各类代表菌株生理生化实验结果
性状 HU13 HU17 HU31 HU33 CM05
H2O2 酶 + + + + +
NO3
- 还原 - + + + +
产氨测定 - + + + +
甲基红反应 - - - - -
V.P 产生 - + + + +
明胶液化 - - - - -
吲哚产生 + + + + +
铁载体测定 - + + - +
ACC 脱氨酶活性 /（nmol·mg-1·h-1） 205.2 124.6 205.3 48.8 23.4
解磷能力 /（μg·mL-1） - - 105.4±6.9 - 71.8±9.0
IAA 产生 /（μg·mL-1） 有色氨酸 1.0±0.2 10.1±0.4 69.4±4.6 4.3±1.0 3.8±0.7
无色氨酸 0.5±0.2 2.9±0.4 4.5±0.4 5.1±1.5 4.0±1.0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6118
IS-PCR 指纹图谱和全细胞蛋白电泳图谱聚类方式相
结合，将从陈皮中分离得到的 23 株有益菌分为 4个
类群。本研究中采用的 IS-PCR 指纹图谱和全细胞蛋
白电泳图谱分别在 DNA水平和全细胞蛋白质水平将
所获菌株在 81%相似性以上聚为 5个类群，聚类结
果有较好的一致性，聚类结果可以相互验证。
内生菌生活在植物体内，不仅能为宿主植物提
供氮素营养，还能分泌生长素、铁载体和 ACC 脱氨
酶促进作物生长、提高作物抗性，并对某些病原菌
有拮抗作用，有着生物防治功能，是一类应用潜力
巨大的微生物资源［24］。本研究采用 3种不同的培养
基尽可能多的分离不同种属内生固氮菌，共获得 34
株内生固氮菌，其中菌株大部分来自于根，少数来
自于茎和叶，这与其它植物分离内生固氮菌结果基
本一致［9，10］。通过 16S rRNA 基因序列分析，所获
菌株主要归属为固氮螺菌属、克雷伯氏属、假单胞
菌属、黄杆菌属和伯克霍尔德属。原红娟［10］从澳
洲野生稻分离获得内生固氮菌有伯克霍尔德属、克
雷伯氏属、预研菌属、草螺菌属、枝动杆菌属等。
孙建国［25］从小麦、水稻等作物中分离获得内生固
氮菌有假单胞菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、黄杆
菌属、肠杆菌属、伯克霍尔德属和克雷伯氏属等。
这表明不同植物内生固氮菌具有生物多样性，以及
种群组成存在差异性，这可能与分离方法、分离季
节以及许多环境因子等多因素相关。
近年来国内外关于内生菌对农作物的应用研究
很多，许明双等［26］从水稻种子中分离得到一株柠
檬色短小杆菌对水稻种子的萌发和幼苗促生有明显
效果。尹坤等［27］从岑溪野生稻分离到一株变栖克
雷伯氏菌有效促进水稻的萌发和生长。Sang 等［28］
从韩国水稻分离的内生固氮菌有较好的产生长素、
产铁载体和溶磷能力，也能明显促进水稻生长，提
高水稻的高度和干重。王志刚等［29］分离到一株溶
磷菌对西瓜幼苗根系具有良好的促生作用。韩坤
等［30］从盐生植物海滨锦葵块根中分离得到 5 株具
有 ACC 脱氨酶活性的内生细菌均能提高小麦幼苗
的耐盐性。鲁红学等［31］从开花期茄子根茎中分离
得到一株内生枯草芽孢杆菌，不仅能促进茄子种子
萌发、幼苗根系生长，还能对茄子黄萎病有很好的
生防效果。本研究获得的固氮菌株都有 ACC 脱氨
酶活性和产生长素能力，有两个类群对无机磷酸钙
有良好的溶解作用，尤其是菌株 HU31 产生长素能
力最高达到（69.4±4.6）μg/mL，固氮酶活性最高
达到 1 036.7 nmol/（mL·h）、ACC 脱氨酶活性最
高达到 205.3 nmol/（mg·h）、溶磷能力最强达到
（105.4±6.9）μg/mL、具有产铁载体的能力等众多植
物促生菌的特性，该菌株在农业生产中具有一定的
应用前景。
4 结论
本研究从药用野生稻中获得的 5 个类群 34 株
内生固氮菌，结果表明野生稻内生固氮菌具有遗传
多样性，而且所获得的菌株都有良好的促生菌特性，
为微生物肥料生产提供了菌种资源。一般情况下，
16S rRNA 基因序列同源性低于 97%，则可认为属于
不同种，同源性低于 95%，则可认为属于不同属［32］。
本研究中，被测菌株类群Ⅰ的 16S rRNA 基因序列与
GenBank 中无乳固氮螺菌（Azospirillum amazonense
ATCC35119T）相似性为 97.13%，因此，类群Ⅰ很可
能代表一个新种或新属，有待进一步研究。
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HU 31 CM 05
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（责任编辑 马鑫）