全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(6)：865— 868 2Olo 午 l1月
药用野生稻抗褐飞虱基因的 RAPD标记研究
梁肖仍1，金 科 ，龙章德0，申佩 弘 ，蒋承建 ，武 波1，2
(1．广西大学 生命科学与技术学院 微生物及植物遗传工程教育部重点实验室 广西亚热带生物资源
保护利用重点实验室，南宁 530005；2．广西民族大学 化学与生态工程学院，南宁
530007；3．广西中烟工业有限责任公司技术 中心 ，南宁 530005)
摘 要 ：以药用野生稻 1665(o．officinals)和栽培稻桂 99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系 B3F4分离群体为
材料 ，利用随机引物对其抗褐飞虱基因进行了 RAPD标记研究 ，获得 3个与抗褐飞虱基因表现连锁的 RAPD
分子标记($229 7o3、$403 783和 Sl1591 408)。采用 MAPMAKER／EXP．Version 3．0分析 ，结果表明 3个 RAPD
分子标记与抗褐飞虱基因属于同一连锁群，覆盖大小为 18．1 cm，标记 问平均距离为 4．53 em，为下一步水稻
抗褐飞虱基因的精确定位和克隆奠定坚实的基础。
关键词 ：药 用野 生稻 ；褐 飞虱 ；抗 褐 飞虱基 因 ；RAPD标记
中图分类号 ：Q75 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2010)06-0865—04
RAPD mapping of a brown planthopper(Nilaparvata
lugens)resistance gene from Oryza officinalis
LIANG Xiao-Reng1，JIN Ke ，LONG Zhang-De。，
SHEN Pei—Hong ，JIANG Cheng-Jian ，WU 13o ，
(1 College of Li Science and Technology，Guangxi University，Key Laboratory of Ministry of Education for Microbial
and Plant Genetic Engineering，Ouangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation and Utilization，Nanning
530005，China；2．Colege of Chemistry and Ecology Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning
530007，China；3．Technology Center，China Tobacco Guangxi Industrial Co．，Ltd．，Nanning 530005，China)
Abstract：B3 F4，a near-isogenic line(NIL)with Bph，was screened by distant hybridization of Oryza officinals 1665
and Oryza sativa Gui99，three molecular markers，$2297o8，$403783 and S1l591408，linked to Bph，were obtained
through RAPD analysis of B3 F4 with random primers．The result of MAPMAKER／EXP．Version 3．0 analysis
showed that these three molecular markers were belonged to the same linkage group with Bph，the covered range was
18．1cM and the average distance between markers was 4．53cM．This result will faeillitate the luther accurate locali—
zation and cloning the Bph gene．
Key words：Oryza officinalis；Nilaparvata lugens；Bph；RAPD marker
水稻是世界上最重要 的粮食作物 ，随着全球人
口的急剧增加，解决粮食 问题 已迫在眉睫。褐飞虱
(Nilaparvata lugens，简称 BPH)是一种 以水稻为
寄主的单食性害虫 ，是亚洲稻 区最严重 的病虫害之
一 (苏昌潮等，2003)，而且近年褐飞虱危害越来越严
重(祝莉莉等，2004)。目前，利用寄主抗性被认为是
防止褐飞虱最经济而有效的方法(刘字锋等，2007)。
野生稻含丰富的抗性资源，从野生稻品种 中发掘新
的抗褐飞虱基因，已引起水稻育种学家的广泛关注。
近年来从野生稻和栽培稻中已陆续发现了许多
收 稿 日期 ：2009—11 26 修 回 日期 ：2010—04-13
基金项目：国家“863”高新技术计划课题(2007AA10Z191)[Supported by the High-tech Plan Funding Isues of State”863”(2。。7AA10zl91)]
作者简介：梁肖仍(1 985一)，女，广西玉林人，硕士研究生，生物化学与分子生物学专业，(E-mail)liangxiaoren8：@163．corn。
通讯作者(Authorfor c0rresp。ndence)：武波，男 ，博士，博士生导师，教授，从事农业微生物学和环境微生物学研究，(E-mail)wubogxu@gxu．edu．cn。
866 广 西 植 物 3O卷
抗虫基因。迄今为止 ，已报道了 25个抗稻飞虱主效
基因(包括 4对重复命名的基因)，其 中 14个为显性
基因(Bph)，11个为隐性基因(Bph)，21个 已定位。
B西^ 1，Bph2，Bph9，Bph10，Bphl8(t)，Bphl9(t)
和 Bph21(t)定位在 12染 色体上；Bph3和 Bph4定
位 在 6染 色 体 上；Bphl1(t)，Bphl3，Bphl4，
Bphl7和 Bph19(t)定 位 在 3染 色体 上；Bphl2，
Bphl2，Bph15，Bph16，Bph18(t)和 Bph20(t)定位
在 4染色体上；Bph13(t)定位在 2染色体上(Alam
& Cohen，1998；Chen等，2006；Huang等，2001；Je—
na等，2006；Xu等 ，2002；Yang等 ，2004；Rahman
等，2009；李容柏等 ，2006；Tishi等，1994；Hiraba—
yashi等，1999；刘国庆等 ，2001)。本研究 以广西农
业科学院获得的近等基因系 F4分离群体为材
料 ，应用 RAPD标记技术 ，对来 自药用野生稻 1665
的抗褐飞虱基因进行分子标记研究，筛选与抗褐飞
虱基因紧密连锁的分子标记 ，构建分子标记与水稻
抗褐飞虱基因的连锁遗传 图谱 ，从而为下一步精确
定位和克隆该抗褐飞虱基因打下坚实的基础。
1 材料与方法
1．1实验材料
实验材料为药用野生稻 1665与栽培稻桂 99通
过远缘杂交，连续 回交、自交获得的 B。F 抗感分离
群体，共 122株(秦学毅等，2002)，其中不抗植株 47
株(分别编号 卜47#)，抗性植株 75株(分别编号 48—
122#)。
1．2近等基因系(NIL)混合抗感 DNA池的构建
采用 CTAB法提取该群体各水稻单株基因组
DNA，分别溶于 1×TE中，一2O℃保存备用 (武波
等，2001)。根据 B。F 单株的抗性鉴定结果 ，分别选
取 lo株抗性级别最高和最低的植株，分别混合其基
因组 DNA构建近等基 因系的抗性 DNA混合池和
不抗 DNA混合 池 。
1．3与抗褐飞虱基因连锁的 RAPD标记筛选
选用 282个 1O bp随机 引物 ，分别以抗 DNA混
合池和不抗 DNA混合池为模板 ，进行 RAPD引物
的筛选。PCR反应所需的 TaqDNA 聚合酶和随机
引物购 自宝生物工程 (大连)有 限公司，dNTP购 自
Promega公 司，PCR仪 为 PE公 司 9600型。PCR
扩增反应 体 系为 10×buffer 2 L，2．5 mmol／L
dNTP 2 L，10 pmol／L RAPD primer 1／xL，基 因组
DNA(2o～50 ng／p．L)1 L，Ex Taq(0．5 u／gL)2
L，加 ddH2O补足至 20 L。反应程序为 95℃，5
min；94℃，30 S，36℃，30 S，72℃，l min，40个循
环 ；72℃ ，l0 rain。
PCR扩增产物用 1．5 琼脂糖凝胶电泳，EB染
色检测，并记录每条扩增带谱在琼脂糖凝胶上的位
置 ，筛选具有抗褐飞虱基因多态性的随机引物，然后
利用具有多态性的引物对 F 分离群体进行
RAPD标记分析 ，电泳图谱 中存在 RAPD标记的记
为 a，不存在的则为 b。
1．4 RAPD标记与抗褐飞虱基因的局部连锁遗传图
谱构建
结合近等基因系 B F 单株表型抗性鉴定结果
和RAPD标记实验数据，应用连锁遗传图绘制软件
MapDraw 2．1，根 据 MAPMAKER／EXP．Version
3．0分析结呆，绘制 RAPD标记与抗褐飞虱基因的
局部连锁遗传图谱 。
2 纬果与分楫
2．1筛选与抗褐飞虱基因连锁的 RAPD标记
选用 282个 随机 引物 ，分别 以抗性 DNA混合
池和不抗 DNA混合池作为模板，进行 RAPD引物
的筛选。通过 4轮筛选 ，发现随机引物 $229、$403
和 S1159在抗性 DNA混合池和不抗 DNA混合池中
具有多态性，并且条带清晰，重复性好。筛选的随机
引物序列如表 l所示。从电泳凝胶中，分别回收具有
RAPD标记片段 $229、S403和 Sl159。回收片段连接
到 pPGEM-T Easy载体上，送测序，标记 $229、$4O3
和 S1159大小分别为 703、783、1 408 bp。
表 1 具有多态性的随机引物
Table 1 Arbitrary primers of product polymorphism
引物编号 引物序列(5 一3 ) 多态性条带数
No of primer Sequence of primer No．of polymorphorsm band
随后以 3个具有多态性引物，分别对 122株个
体进行 RAPD标记分析，部分个体的RAPD标记分
析图谱见图 1、图 2和图 3。RAPD标记的分析结果
(表 2)表明，这 3个 RAPD标记在近等基 因系群体
中与抗褐飞虱基因有比较好的连锁关系，分别命名
为 $229 7。3、$4O3 783和 Sll5914o8。
6期 梁 肖仍等：药用野生稻抗褐飞虱基因的 RAPD标记研究 867
800bD一
700bD一
图 1 引物 $229对部分抗、感个体的 RAPD标记电泳图谱
Fig．1 E1ectr。p}1。resis profiles of PCR amplification by RAPD prim er 5229
among some resistant and susceptible individuals
M ：100bp DNA maker；S：Susceptible individuals；R：Resistant individuals；Arrow：Polymorphle bands
900bo_-—
800bD——～
图 2 引物 $403对部分抗、感个体的 RAPD标记电泳图谱
Fig．2 Electrophoresis profiles of PCR amplification by RAPD primer$4O3
among some resistant and susceptible individuals
M ：1 00 bp DNA maker；S：Susceptible individuals；R：Resistant individuals；Arrow：Polymorphic bands
2000bD
1 500b0
图 3 引物 s1159对部分抗 、感个体的 RAPD标记电泳图谱
Fig．3 Electrophoresis profiles of PCR amplification by RAPD primer S1 159
am ong som e resistant
1M：1 kb DNA maker；S：Susceptible individuals
2．2 RAPD标记与抗褐飞虱基因的局部连锁遗传图
谱 构建
将 3个 RAPD 标 记 ($229 7 $403 8。和
S1159 。)在近等基 因系 B。F 122个单株 的分析数
据 ，结合近等基因系 B。F 单株表型抗性鉴定结果 ，
采用 MAPMAKER／EXP．Version 3．0软件 ，与抗
and susceptible individuals
R：Resistant individuals；Arrow：Polymorphic bands
褐飞虱基因进行连锁分析。结果表明 3个分子标记
和抗褐飞虱基 因覆 盖大小为 18．1cM，标记间平均
距离为 4．53cM。
根据 MAPMAKER／EXP．Version 3．0的分析
结果 ，应用遗传连锁图绘制软件 MapDraw2．1，绘制
RAPD标记与抗褐 飞虱基 因的局部连锁遗传图谱。
868 广 西 植 物 30卷
分析表明 3个分子标记和抗褐飞虱基因属于同一连
锁群(图 4)，并位于抗褐 飞虱基 因的两端。其中标
记 $403 。与抗褐 飞虱基 因的遗传距离最近，为 4．9
表 2 近等基因系群体的 RAPD标记分析结果
Table 2 Results of RAPD marker analysis of NIL
不抗 个体 存
标记
No
编
．
号 在
N
标
o ,
记
of
编 抗
NO
性
, o
个
f r
体
es
缺
ist
失
an
标
ce
记
ha
编
sn
号
t k。
has marker
3 讨论
RAPD标记是以 PCR为基础的分子标记技术，
它是以短的随机寡核苷酸序列作 为引物进行 PCR
扩增，产生不连续 的片段 ，以揭示生 物的遗传多态
性，其不依赖种属特异性和基因组结构，合成的随机
引物可用 于不 同生物 的基 因组分 析。此外 ，一次
RAPD标记的 PCR扩增可检测多个基因位点 ，检测
的范围可覆盖整个基因组 区域。与传统经典的形态
学标记、细胞学标记以及生化标记相比，具有极大的
优越性 。与 RFLP标记相 比，RAPD标记对 DNA
需要量和质量要求不高，操作简单易行，且不需要接
触放射性物质 ，实验周 期短，甚 至可 以检测 RFLP
标记所不能检 出的重复序列 区，因此可以作为
RFLP标记图谱 的补充 ，也 可以作为单独 的分子标
记方法作连锁遗传图谱(方宣钧等，2000)。
8．0
4．9
5．2
S11 5914o8
Bph
$403 783
$229703
图 4 抗褐飞虱基因与 RAPD标记的局部连锁遗传图
Fig．4 Regional linkmap among Bph
and RAPD markers
Left：genetic distance；Right：marker site．
到目前为止，RAPD标记已广泛应用于稻属的
研究。Cha等 (2008)应用 RAPD标记技术从籼稻
品种 cheongcheongbyeozhong中获 得 3个 RAPD
标记 ，进一步精确定位 Bphl。韦东等(2005)选用
282个随机引物从药用野生稻 1665中筛选到 2个
与抗 褐 飞 虱基 因表 现连 锁 的 RAPD标 记，其 中
BS303与抗褐飞虱基 因的遗传距离为 0．8 crn。在
此基础上 ，本研究利用 RAPD标记技术对来源于药
用野生稻 1665的抗褐飞虱基因进行研究 ，获得另外
3个具有多态性的 RAPD引物，3个分子标记和抗
褐飞虱基因属于同一连锁群，覆盖大小为 18．1 cm，
标记间平均距离为 4．53 CITI。对来源于药用野生稻
1665的抗褐飞虱基因进行了进一步的精细定位，从
而为下一步水稻褐飞虱基因的精确定位和克隆分离
打下了坚实的基础。
参考文献：
方宣钧，吴为人，唐纪 良．2000．作物 DNA标记辅助育种[M]．
北京 ：科学出版社 ：25—27
刘国庆，彦辉煌，傅强，等．2001．栽培稻的紧穗野生稻抗褐飞虱主
效基因的遗传定位_J]．科学通报，46(9)：738—742
Alam SN，Cohen MB．1998．Durability of brown planthopper，Ni—
laparvata lugens，resistance in rice variety IR64 in greenhouse
selection studies[J]．Entomologia Experimentalis et Applica一
缸 ，89：71— 78
Cha YS，Ji H，Yun DW ，et a1．2008．Fine mapping of the rice
Bph1 gene，which confers resistance to the brown planthopper
(Nilaparvata lugens)，and development of STS markers for
marke assisted selection[J]．Mol Cell，26：146—151
Chen JW ，Wang L，Pang XF，et a1．2006．Genetic analysis and fine
mapping of a rice brown planthopper(Nilaparvata lugens)re—
sistance gene Bphl9(￡)EJ]．MolGen Genomi~J，275：321—329
I-Iuang Z，He G，Shu L，et a1．2001．Identification and mapping of
tⅥrO brown planthopper resistance genes in rice[J]．Theor Appl
Genet，102：929——934
Hirabayashi H，Ogawa T． 1999． Identification and utilization of
DNA markers linked tO genes for resistance tO brown planthop—
per(BPH)in rice(in Japannese)EJ]．RecentAdv Breed Sci，41：
71— 74
Jena KK，Jeung JU，Lee JH，et a1．2006．High-resolution mapping
of a new brown planthopper(BPH)resistance gene，Bph18(￡)，
and markerassisted selection for BPH resistance in rice(Oryza
sativa)EJ]．TheorAppl Genet，112：288—297
Liu YF(刘宇锋)，Li RB(李容柏)，Yang L(杨 朗)，et a1．2007．
Advances in resistance gene of brown planthopper in rice(水稻
褐飞虱抗性基因研究进展)EJ]．Guangxi Agric Sci(广西农业
科学)，38(1)：11—15
Li RB(李容柏)，Li LS(李丽淑)，Wei SM(韦素美)，et“z．2006．
The evaluation and utilization of new genes for brown planthop—
per resistance in collllOn wild rice(Oryza rufipogon)(普通野
生稻抗稻褐飞虱新基因的鉴定与利用)厂J]．]Viol Plant Breed-
ing(分子植物育种)，4(3)：365—371
(下转第 824页 Continue On page 824)
824 广 西 植 物 3O卷
References：
Chen PC．1963．Genera Muscorum Sinicorum(1)[M]
ence Press：1—304
Chen PC．1978．Genera Muscorum Sinicorum(2)[M]
ence Press：1—331
Beijing：Sci
Beijing：Sci—
Dixon HN．1933．Mosses of Hong Kong：with other Chinese mos—
sesEJ]．Hong Kong Nat，Suppl 2：1—31
Evans AW．1919．A taxonomic study of Dumortiera[J]．Bull Tor—
rey Bot a 曲 。46：167— 182
Goebel K．1910．Archegoniaten-Studien XII[J]．Monosolenium
teneruln Grif m Flora，101：43-97
He ZX，Zhang L，Xie GZ，et nf．2004．A prelimnary j／st of mosses
from Shimentai Nature Reserve，Guangdon4~[J]．J Trop Subtrop
Bot，12(6)：541—551
j|a Y，Wu PC，Wang M乙 2001．Bryoflora of Mt．Wutong，Shenahen
aty，South China[J]．Guizhou& ，19(4)：16～zz
Li ZH．1987．A checklist of bryophytes of Heishiding Nature Re—
serve，Fengkai County[J]．[col5矗，l～2：184—190
Li ZH，Liao WB，Huang WJ．1998．Bryophytes of National Nanling
Nature Reserve，Guangdong Province，South ChinaCJ]．Chenia，5：
147——159
Li ZH，Pippo S．1 994．Preliminary list of bryophytes of He—
ishiding Nature Reserve，Guangdong Province，China[J]．
Trop Bryol，9：35— 41
Lin PJ，Yang YY，Li ZH．1982．A study of the bryophytes of
Drag-Hu-Shan[J]．Trop Subtrop R Ecosys，1：58—76
I iu WQ，Lei CY，Dai XH．2007．Bryophyte communities in the
forest of Heishiding Nature Reserve，Guangdong，CNna[J]．J
Trop Subtrop Bot，15(6)：538～544
Liu WQ，Zan QJ，Liao WB，et a1．1999．Study on the bryophytes
of Neilingding Island Nature Reserve，Guangdong Province，Chi—
na[J]．Guihaia，19(4)：3o3—307
Mitten W．】89 1．An enumeration of al】species of Musei and He—
paticae recorded from Japan[J]．Trans Proc Linn Soc London
5gr 2，3：153— 206
Paris EG．1901．Muscinees de Quang Tcheou Wan[J]．Rev Bry一
0Z，28：37— 38
Paris EG．1909．Musein~es de 1’Asie Orientale．1O[J]．Rev Bry—
o￡，36：88— 91
Paris EG．1911．Mousses de l’Asie Orientale，12[J]．RevBryol，
38：53— 6O
Redfeam Jr PL，Tan BC，He S 1996．A newly updated and annotated
checklist of Chinese mosses[J]．J Hattori Bot Lab，79：163—357
Reimers H．1931．Beitrage zur moosflora Chinas I[J]．Hedwi—
gia，71：1— 77
Renauld F，Cardot J．1905．MUSCi exotici novi vel minus cogniti．X
FJ]．MemSoc Roy Bot Belgique，41：7—122
Salmon ES．1900．On some mosses from China and Japan[J]．J
Linn Soc B0t，34：449—474
Wu H，Lin PJ，Zhang L．et a1．1 992．Bryophytes of Nationa1 Che—
baling Nature Reserve，Guangdong Provinee[M]／／Xu YQ(eds)．
C0lkcted papers for investigation in National Chebaling Nature
Preserve． Guangdong：Science and Technology Publishing
House：187— 198
Zeng GQ，Lin BJ．2001．Mosses in limestone area in Northern
Guangdong[J]．J Trop Subtrop Bot，9(2)：113—122
Zeng ZX，Huang W_F．2001．Natural geography of Guangdong
[M7．Guangdong：Guangdong People Publisher，1—385
Zhao ZT，Cao 1998，Flora Bryophytorum Shandongicomm[M]．
Shandong：Shangdong Science and Technology Press，1—339
Zhu RL．Hu RL，Guo XH．1992a． A study on epiphyllous liver—
worts from Babao Shah，Guangdong[J]．Acta Bot gunnanica，14
(3)：264—268
Zhu RL．W ang YF． 1992b． A prelimary revision of epiphylous
liverworts from Dinghushan[J]．J East China Normal Univ
(NatSci Edi)，(2)：90—97
0 ·<> ●o ·<> ．()．。<>·< >●<> ●<> ●< >●<> ●< >●o ·<> ●o ·< >●(> ●0 ●<> ●<> ·< >●o ●< >●<> ●o ●‘> ●o -( )．o ·< >●<> ●0 ●< >●( >．() ．0 ．( )．0 ●( >●<> ●c ●o ‘0 ●< >●<)●o ·<>●o ·<> ●
(上接第 868页 Continue from page 865)
Qin XY(秦学毅)，Wei SM(韦素美)，Wu B(武波)，et a1．2002．
Inheritance of resistance to brown planthopper in Oryza offici—
naliz and its utilization(药用野生稻抗源对褐稻虱的抗性遗传
及利用研究)[J]．Southwest China J Agric Sci(iN南农业学
报)，15(4)：62—65
Rahman ML，Jiang W ，Chu SH，eta1．2009．High-resolution map—
ping of two rice brown planthopper resistance genes，Bph2o(f)
and Bph21(￡)，originating from Oryza minuta[J]．Theor Appl
Genet，119：l 237— 1 246
Su CO(苏昌潮)，Cheng XN(程遐年)，Zhai HQ(翟虎渠 )，et a1．
2003．Progress in studies on genetics of resistance to rice brown
planthopper(Nilaparvata lugens)of resistant cuhivars(水稻抗
褐飞虱遗传和育种 研究)[J]．HybridRice(杂交水 稻)，l8
(4)：1— 6
Tishi T，Brar DS，M uhani DS．1994． Molecular tagging of genes
for brown planthoppe resistanceand earliness introgressed from
Oryza australiensis into eutivated rice，Q sati~xz[J]．Genome，
37：217— 221
Wu B(武波)，Wei D(韦东)，an XY(秦学毅)，eta1．2001．Ran—
dora amplified polymorphie DNA(RAPD)analysis of wild rice
and cultivated rice(野生稻和栽培稻的随机多态 DI、『A(RAj)D)
分析)[J]．Guihaia(广西植物)，21(4)：339—343
Wei D(韦 东 )，Qin XY(秦学 毅)，Ou Q(欧 倩)，et a1．2005．
Studies on RAPD marker of rice Bph(水稻抗褐飞虱基 因的
RAPD标记研究)[J]．Southwest China J Agric Sci(西南农业
学报)，18(6)：764—766
Xu XF，Mei HW，Luo LJ，et a1．2002．RFLP-facilitated investiga—
tion of the quantitative resistance of rice to brown planthopper
(Nilaparvata lugens)口]．TheorApp[Genet，104：248-253
Yang HY，You AQ，Yang ZF，eta1．2004．High-resolution genetic
mapping at the Bph1 6 locus for brown planthopper resistance in
rice(Oryza sativa)[J]．TheorAppl Genet，110：182—191
Zhu LL(祝莉莉)，Zhu CL(祝彩磊)，Weng QM(翁清妹)，et n ．
2004．Research progress on brown planthopper resistance genes
in rice(水稻抗褐飞虱基因的研究)[J]．HubeiAgric Sci(湖北
农业科学)，1：19～24