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欧李红色素的提取及抑菌作用的研究



全 文 :欧李红色素的提取及抑菌作用的研究
 收稿日期:2011-04-23
 基金项目:山西师范大学科研课题组资助(873041)。
 作者简介:贾蕊(1965-),女,山西临汾,讲师,硕士,研究方向:微生物。
 通讯作者:肖春玲(1966-),女,山西临汾,教授,硕士,研究方向:食品科学。
贾 蕊1,肖春玲2,李 瑞2
(1.山西师范大学 生命科学学院,山西 临汾 041000;2.山西师范大学 工程学院,山西 临汾 041000)
摘 要:实验采用欧李果实为原料提取红色素,并用欧李红色素对食品中常见的微生物做抑菌实验研究了欧
李红色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌、黑曲霉这些微生物有无抑菌作用及最低
抑菌浓度。实验用浸提法得到的欧李红色素粗提液,并经过AB-8树脂吸附后得到精制的欧李红色素,而后
对其精制浓缩,测定了欧李红色素含量;采用滤纸片法测定了欧李红色素对不同菌种的抑菌作用;用稀释法测
定了欧李红色素最低抑菌浓度。结果表明:欧李红色素对大肠杆菌的抑菌作用最强,对金黄色葡萄球菌和枯
草芽孢杆菌的抑菌作用较弱,而对黑曲霉和啤酒酵母菌几乎没有抑菌作用。用大肠杆菌做最低抑菌浓度实验
表明欧李红色素对大肠杆菌的最低抑菌浓度为21.446mg/l,通过对欧李红色素抑菌作用的研究,实现其兼
作色素和抑菌剂的可能性。这将为欧李红色素用于生产实践提供可靠的理论依据并加速欧李红色素的开发
利用。
关键词:欧李红色素;AB-8树脂;抑菌;最低抑菌浓度
  欧李(Prunus humilis Bunge)为蔷薇科樱桃
属落叶小灌木果药兼用野生树种。由于其果实中
含钙量很高,所以商业上称之为钙果。成熟欧李
果实的颜色有红、黄,色泽鲜艳而香气浓郁,不仅
为鲜食之佳品,也可用于提取天然食用色素。近
年来,对欧李研究主要集中在选种、育种、栽培技
术这些方面的研究;还有以欧李为原料进行果酒、
果酱、饮料、低糖果脯、蜜饯等加工工艺方面的研
究;毕红霞等人对河北野生欧李红色素的提取工
艺、精制方法及其性质与应用有了初步的研究[1];
但对欧李红色素的抑菌作用确很少有报道。
随着现代医学、食品卫生学等学科以及检测
技术的飞速发展,人们发现合成色素存在着严重
的毒理学方面的问题,有些对人体健康不益,甚至
诱发癌症等[2],因此,寻求无毒副作用而且具有营
养保健功能的天然色素资源具有重要的理论和实
践意义。卢奎等人的研究发现,欧李红色素具有
较强的抗氧化性能,对光、热、食品中常见食品添
加剂及某些金属离子如Ca2+、Mg2+、Al 3+、Cu2+
等均有较强的稳定性,Fe3+、Sn2+对其有破坏作
用,而苯甲酸钠、氧化剂及还原剂对其有较大的破
坏作用[3],因此欧李红色素可以作为制备食用色
素的天然原料。
欧李红色素经初步研究为花青素[4],无毒无
味,并且具有抗氧化和保健功能,其常规的提取工
艺主要是利用AB-8大孔树脂吸附并对其进行
精制[6]。由于欧李红色素分子结构中含有较多的
酚羟基,这些基团可与蛋白质以氢键方式结合而
破坏蛋白质的结构从而使蛋白质变性或失去活
性,最终将导致菌体解体或死亡。为加速欧李红
色素的开发利用,笔者旨在研究欧李红色素的抑
菌作用,实现其兼作色素和抑菌剂的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
欧李果:9月初采收于山西农业大学实验田,
洗净后放在冰箱中保藏备用。
试剂:浓盐酸,氯化钾,醋酸钠均为分析纯。
菌种:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄
球菌、酵母菌、青霉、黑曲霉均由山西师范大学生
命学院微生物实验室提供。
1.2 主要仪器
FA-04电子天平,上海天达仪器有限公司;
UV-1100型紫外可见分光光度计,上海美谱达
仪器有限公司;LSY 电热恒温水浴锅,北京医疗
设备厂;RE-52A旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪
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器厂;RJ-TDL-40低速大容量离心机,无锡瑞
江分析仪器有限公司;HH·BII500-BS-Ⅱ电
热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;GZX-
9246MBE数显鼓风干燥箱,上海博迅实业医疗设
备厂;SB-IS-IA 超净工作台,上海博讯实业有
限公司医疗设备厂;DS-1高速组织捣碎机,上海
精科实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 欧李红色素的提取 欧李果实去核后在
45℃下干燥36h后粉碎成粉末。精确称取粉末
30g,采用陈玮[5]等研究的溶剂浸提法提取。其
提取工艺参数[6]为:浸提液85%乙醇(含0.5%浓
盐酸)、浸提温度65℃、浸提时间1.5h、液固比
5∶1(V/W),在此条件下浸提2次。经过浸提得
到的粗提物在3 000r/min的条件下离心20
min。吸取上清液,弃去沉淀,合并上清液得到欧
李红色素粗提液。
把得到的粗提液放在45℃的旋转蒸发仪上
蒸发浓缩3h,挥发掉其中的乙醇得到浓度较高的
欧李红色素粗提液。
1.3.2 欧李红色素的纯化-AB-8大孔树脂吸
附[6-7]
1.3.2.1 大孔吸附树脂的活化
精确称取70.0gAB-8大孔树脂。首先用
95%的乙醇浸泡AB-8大孔树脂,24h后装柱;
再用3倍体积的95%乙醇淋洗并浸泡4h至流出
液澄清透明不呈白色浑浊,并用蒸馏水洗净乙醇;
再用3倍体积的5%HCl淋洗并浸泡4h,并用蒸
馏水洗至中性;再用3倍体积的2%NaOH 溶液
淋洗并浸泡4h,并用蒸馏水洗至中性(用pH 试
纸测定)。
1.3.2.2 AB-8树脂吸附
70.0g上述经活化的AB-8树脂装柱后,分
次并缓慢的加入已获得的浓度较高的欧李红色素
粗提液并调节流速为2.5ml/min。当流出液用
紫外可见分光光度计在510nm处测得其吸光度
恒定时,树脂吸附饱和,共用去欧李红色素粗提液
80ml。
1.3.2.3 AB-8树脂洗脱
AB-8树脂对欧李红色素吸附饱和后,先用
蒸馏水淋洗至流出液为中性时,再用80%乙醇溶
液(含 0.5% 浓盐酸)洗脱,调节流速为 2.0
ml/min。当流出液为无色时洗脱完成。
1.3.2.4 欧李红色素的精制浓缩
合并洗脱得到的欧李红色素流出液放在旋转
蒸发仪上旋转蒸发6h,挥发掉其中的乙醇和大
部分水分,得到精制的欧李红色素浓缩液。把精
制的欧李红色素浓缩液放在干净的玻璃瓶中密封
保存,备用,防止其中的水分挥发影响最终的实验
结果。
1.3.2.5 欧李红色素含量测定
由于欧李红色素中主要为黄酮类花色苷[4],
所以可以用pH示差法测定花色苷含量[8-10]。操
作方法如下:首先分别用pH 为1.0的氯化钾缓
冲液和pH为4.5的醋酸钠缓冲液将精制的欧李
红色素浓缩液稀释6倍,放在避光处平衡15
min;再以蒸馏水为空白对照,用1cm比色杯装
上稀释液和对照液放入紫外可见分光光度计中分
别于510nm和700nm下测得稀释液的吸光值;
最后根据Fuleki的公式就可以计算出花色苷含
量。
1.3.3 欧李红色素的抑菌作用[11]
1.3.3.1 菌种的活化
采用斜面接种法分别把保存的5种供试菌种
接种于固体培养基上,细菌接种在牛肉膏蛋白胨
培养基上,酵母菌和霉菌接种在马铃薯葡萄糖琼
脂培养基上,该步骤在超净工作台上完成。然后
细菌放在37℃恒温培养箱中培养24h,酵母菌和
霉菌放在28℃恒温培养箱中分别培养48h和72
h,使菌种充分恢复其生理活性。
1.3.3.2 菌悬液的制备
在超净工作台上进行以下操作,将接种环在
酒精灯上灭菌并冷却后轻轻刮下经活化的菌种表
面的菌苔两环放入装有5ml无菌生理盐水的小
烧杯中,充分摇匀使菌种在无菌生理盐水中尽量
分布均匀,制成菌悬液或孢子悬浮液。
1.3.3.3 滤纸片法[11-14]测定欧李红色素对不同
菌种的抑菌作用
用打孔器将2mm厚的吸水性强的滤纸打成
直径为8mm的小圆片,并将其放在130℃鼓风
干燥箱中灭菌2h,灭菌后将小圆片分别放在无
菌生理盐水和精制的欧李红色素浓缩液中浸泡
24h,使其充分吸收欧李红色素,备用。在已灭菌
的培养皿内倒入已冷却至50℃左右的营养琼脂
培养基15ml,不同菌种所用的培养基不同[9]。
待培养基凝固后,用微量注射器吸取200ul的菌
悬液于平皿中(细菌菌悬液置于牛肉膏蛋白胨培
养基上,酵母菌和霉菌菌悬液置于马铃薯葡萄糖
琼脂培养基上),然后用无菌涂布棒将菌悬液涂布
均匀,水平放置。用无菌镊子分别将浸泡在欧李
红色素溶液液和无菌生理盐水中的滤纸片取出,
沥干,贴在涂布有不同菌悬液的平皿中,每个平皿
·22· 陕 西 农 业 科 学 2012(1)
等距离放4片(欧李红色素溶液和无菌生理盐水
浸泡过的滤纸片各两片)。每个处理重复3次。
以上操作均在超净工作台上进行。然后将处理过
的培养皿分别放在恒温培养箱中倒置培养一定时
间(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
37℃,18h;啤酒酵母菌和黑曲霉27℃,48h)。到
时取出测定抑菌圈直径的大小,并记录数据。
1.3.3.4 稀释法测定欧李红色素最低抑菌浓度
根据上述实验的测定结果,选取抑菌效果最
好的大肠杆菌做最低抑菌浓度实验。分别吸取实
验1.3.2.4中得到的精制欧李红色素浓缩液4
ml于6个已灭菌的小烧杯中并标记为 C1、C2、
C3、C4、C5、C6,然后依次加入0,1,2,3,4,5ml无
菌蒸馏水使欧李红色素溶液稀释。再把已灭菌的
直径为8mm的滤纸片放入上述六个小烧杯中浸
泡24h,每个烧杯放6片,另取一部分滤纸片放在
无菌生理盐水中浸泡24h,使滤纸片充分吸收欧
李红色素。然后按1.3.3.3的方法测定抑菌圈的
直径。每组浓度的欧李红色素实验重复3次。把
经过处理的培养皿倒置培养在37℃恒温培养箱
中培养18h后,取出测其抑菌圈直径大小并记录
实验数据。
2 结果分析
2.1 精制欧李红色素溶液浓度测定结果
用浸提法得到的欧李红色素粗提液经过 AB
-8大孔树脂吸附和洗脱后得到精制欧李红色素
溶液,将此溶液浓缩后分别用pH 为1.0的氯化
钾缓冲液和pH为4.5的醋酸钠缓冲液将精制的
欧李红色素浓缩液稀释6倍后放入紫外可见分光
光度计于510nm和700nm测得其吸光度值如
表1所示:
表1 不同缓冲液稀释后欧李红色素的吸光度值
缓冲液 510nm  700nm
pH1.0氯化钾缓冲液 2.865  1.02
pH4.5醋酸钠缓冲液 2.854  1.421
  由表1可知,用pH 为1.0的氯化钾缓冲液
稀释的欧李红色素溶液在最大吸收波长510
nm[4]和 700nm 处的吸光度分别为 2.865,
1.020;用pH为4.5的醋酸钠缓冲液稀释的欧李
红色素溶液在最大吸收波长510nm[4]和700nm
处的吸光度分别为2.854,1.421。则根据公式A
=(A'- A700)pH1.0-(A'- A700)pH4.5可以计算吸
光值A=0.412(其中 A'-最大吸收波长下的吸
光值)。
根据Fuleki[15]的公式可计算出花色苷浓度
C=37.531mg/l。
Fuleki公式为:总花色苷浓度C(mg/l)=A
×MV×DF×1000/(E×L)(其中 A-吸光值;
MV-分子量,以矢车菊素-3葡萄糖苷为标准,
449.4;DF-稀释倍数;E-消光系数,29 600
L/(cm·mg);L-光径,1.0)。
使用pH 示差法的原理为:依据花色苷发色
团的结构随pH 转变而转换,但超干扰作用的褐
色降解物的特性却不会随pH 的改变而变化,通
过实验确定两个对花色苷吸光度差别最大但对花
色苷稳定的pH值,根据Fuleki的公式可以计算
出花色苷总量[10]。
2.2 滤纸片法测定结果
精制的欧李红色素用1.3.3.3的方法测得精
制的欧李红色素溶液对食品中常见菌种的抑菌圈
的大小如表2所示:
表2 欧李红色素对不同菌种的抑菌作用
供试菌种 抑菌圈的大小 无菌生理盐水对照
大肠杆菌 +++ -
金黄色葡萄球菌 ++ -
枯草芽孢杆菌 + -
啤酒酵母菌 - -
黑曲霉 - -
  注:- 表示无抑菌圈出现;+- 表示抑菌圈不明显;
+ 表示抑菌圈直径9-10mm;++表示抑菌圈直径11-
13mm;+++表示抑菌圈直径14mm以上。
由表2可知,在37℃恒温培养箱中培养18h
的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的滤
纸片周围均有抑菌圈出现且抑菌圈直径依次减
小。在27℃的恒温培养箱中培养48h的啤酒酵
母菌和黑曲霉滤纸片周围菌落虽然有所减少,但
没有明显的抑菌圈出现。测其抑菌圈直径发现,
大肠杆菌的抑菌圈直径为16mm,金黄色葡萄球
菌的抑菌圈直径为13mm,枯草芽孢杆菌的抑菌
圈直径为10mm。由此可知欧李红色素对大肠
杆菌的抑菌作用最强,对金黄色葡萄球菌和枯草
芽孢杆菌的抑菌作用次之,对啤酒酵母菌和黑曲
霉几乎没有抑菌作用。
2.3 最低抑菌浓度的测定结果
用1.3.3.4的方法测得不同浓度的欧李红色
素溶液对大肠杆菌做最低抑菌浓度实验,测得大
肠杆菌培养皿中滤纸片周围的抑菌圈的大小如表
3所示:
·32·贾 蕊等:欧李红色素的提取及抑菌作用的研究
表3 对大肠杆菌的最低抑菌浓度的测定
欧李红色素浓度 抑菌圈直径大小 无菌生理盐水对照
C1 +++ -
C2 ++ -
C3 + -
C4 +- -
C5 - -
C6 - -
  注:- 表示无抑菌圈出现;+- 表示抑菌圈不明显;
+ 表示抑菌圈直径9-10mm;++表示抑菌圈直径
11-13mm;+++表示抑菌圈直径14mm以上。
由表3可以看出,随着欧李欧李红色素溶液
的逐渐被稀释,即欧李红色素浓度的逐渐降低,大
肠杆菌平皿中滤纸片周围的抑菌圈直径逐渐减
小,即抑菌作用逐渐减弱。
根据2.1的结果可知,精制欧李红色素溶液
的浓度C=C1=37.531mg/l。由1.3.3.4的实验
方法可计算得到经稀释得到的6种欧李红色素溶
液的浓度依次为C1=37.531mg/l,C2=30.025
mg/l,C3=25.021mg/l,C4=21.446mg/l,C5=
18.766mg/l,C6=16.680mg/l。经1.3.3.4的实
验方法培养的将大肠杆菌在恒温箱中培养18h
后取出,测其滤纸片周围的抑菌圈直径发现,浸泡
在浓度为C1、C2、C3 的欧李红色素溶液中的滤纸
片周围的抑菌圈直径依次为16mm、12mm、10
mm,而浸泡在浓度为C4 的欧李红色素溶液中的
滤纸片周围没有明显的抑菌圈出现,浸泡在浓度
为C5、C6 的欧李红色素溶液中的滤纸片上有大
肠杆菌出现,说明没有抑菌作用。由以上结果可
知,欧李红色素溶液的最低抑菌浓度为21.446
mg/l。
2.4 欧李红色素的抑菌机理[12]
欧李红色素经初步研究为花青素,即黄酮类
花色苷化合物[4],观察其花青素母核的化学结
构[4]可发现其分子结构中有较多的酚羟基,这些
酚羟基可与细菌种体内的蛋白质或酶通过氢键方
式结合从而破坏细菌蛋白质的结构,这样会使蛋
白质变性或失活,最终将导致微生物细胞中细胞
质的固缩和解体[16]。
3 结论
3.1 欧李红色素对不同菌种的抑菌作用的大小
用精制的欧李红色素溶液对5种菌种做抑菌
作用实验发现:欧李红色素对大肠杆菌的抑菌作
用最强,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑
菌作用次之,对啤酒酵母菌和黑曲霉几乎没有抑
菌作用。
3.2 欧李红色素对大肠杆菌的最低抑菌浓度
  用不同浓度的欧李红色素溶液对大肠杆菌做
最低抑菌浓度实验发现:欧李红色素对大肠杆菌
的最低抑菌浓度为21.446mg/l。
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