全 文 ：西府海棠（Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）总黄酮提取及
微乳液薄层分析
钱柯成１　刘连芬２
（１．北京师范大学 生命科学学院，北京 １００８７５；２．聊城大学 生命科学学院，聊城 ２５２０５９）
摘　要　为研究西府海棠的黄酮类成分及含量，采用硝酸铝－亚硝酸钠－氢氧化钠法显色，采用分
光光度法测定了西府海棠叶总黄酮的含量，优选出西府海棠总黄酮的最佳提取条件．利用乙酸乙
酯和石油醚分别对样品进行萃取纯化，以层析比较其黄酮种类．结果表明：西府海棠叶总黄酮最
佳提取工艺为固液比１：２０，乙醇浓度７０％，提取时间４ｈ，提取温度８０℃．微乳膜薄层层析显示，
西府海棠叶中含有多种黄酮类，其中有芦丁、槲皮素、葛根素．
关键词　西府海棠，黄酮，萃取，微乳液薄层层析
中图分类号　Ｑ９４６　文献标识码　Ａ　　文章编号　１６７２－６６３４（２０１５）０２－００４６－０４
西府海棠（Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ　Ｍａｋｉｎｏ）属蔷薇科 （Ｒｏｓａｃｅａｅ）苹果属（Ｍａｌｕｓ　Ｍｉｌ．）苹果亚属（Ｓｕｂ－
ｇｅｎ．Ｍａｌｕｓ）苹果组（Ｓｅｃｔ．Ｍａｌｕｓ）植物［１］，广泛栽培于我国各地，是著名的园林观赏树种，也是重要的苹
果砧木树种［２］．
像三叶海棠（Ｍ．ｔｏｒｉｎｇｏ　Ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ）、湖北海棠（Ｍ．ｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ（Ｐａｍｐ．）Ｒｅｈｄ．）和台湾林檎（Ｍ．
ｄｏｕｍｅｒｉ　Ｃｈｅｖ．）［３－６］一样，西府海棠干叶可以作为茶叶饮用，口味清甜，具有抗菌消炎、抗缺氧、降血糖等作
用［４，５］，但对其中的化学成分的研究至今未有报道．
黄酮类化合物是西府海棠中非常重要的成分，它具有多方面的生物活性．如① 保护心脏的作用，可以
降低血管通透性、降低血压，对防治血管老化和脑血管供血不足等疾病有益［７］；② 抗癌活性，能有效抑制
癌细胞的生长；具有保肝活性，对肝炎、肝硬化等肝胆疾病有辅助治疗作用［８］；③ 有抗炎、镇痛、抗菌、抗病
毒及抗氧化活性，可作为抗流感病毒药物中的活性成分之一，能抑制流感病毒唾液酸酶的活性及抑制膜融
合的作用［９］．因此，西府海棠叶茶具有很高的保健价值．
低浓度的黄酮类化合物口感清甜，但浓度较高时则味道发苦，因此，西府海棠叶茶用时浓度不宜过高．
此外低浓度黄酮类化合物还可做甜味剂和天然染料［１０］．
西府海棠是我国特有植物，有上千年的栽培历史，但它仅以其观赏价值闻名古今，而其药用等其他重
要的价值尚未得到开发利用．本文对其黄酮类化合物进行研究，为开发利用和分类研究提供资料．
１　材料与方法
１．１　材料与仪器
材料：西府海棠叶，４月下旬采于聊城大学校园．芦丁标准品：生化试剂，上海试剂二厂．聚酰胺薄膜：
１０×２０，购自浙江台州路桥四青生化材料厂．旋转蒸发仪：ＲＶ０５－Ｓｔ，江苏省金坛市教育玻塑厂．紫外可见
第２８卷　第２期
２０１５年６月
　　　聊城大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．）
Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．２
Ｊｕｎ．２０１５
收稿日期：２０１４－０９－０３
基金项目：国家自然基金（３１０７０６１９，３１１７０１７８）；山东省自然基金（ＺＲ２０１１ＣＭ０４５）
通讯作者：钱柯成，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉａｎｇｕａｎｚｅ＠ｌｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
分光光度计：ＵＶ－２１００，上海仪器有限公司．电子分析天平：ＡＥ－２４０型，梅特勒托利多集团．微乳液展开剂：
用ＳＤＳ：正丁醇：正庚烷：水＝１１．７：１５．６：２．７：７０配成微乳液，在９３份微乳液中加７份甲酸配成展开剂．
１．２　西府海棠叶总黄酮的提取
　表１　Ｌ９（３４）正交实验设计的因素与水平表
编号 Ａ固液比 Ｂ乙醇浓度／％ Ｃ提取时间／ｈ　Ｄ提取温度／℃
１　 １：１０　 ５０　 ２　 ５０
２　 １：２０　 ７０　 ３　 ７０
３　 １：３０　 ８０　 ４　 ８０
　　 将西府海棠叶片用流水冲洗 ３０
ｍｉｎ，６０℃快速烘干后磨碎，８０目过筛，除
去粗渣．称取干粉２ｇ，以固液比、乙醇浓
度、提取时间和提取温度建立四因素、三
个水平（见表１）的Ｌ９（３４）正交实验，用回
流提取抽滤，收集滤液，经沉淀再次抽提．
合并两次抽提的滤液，精滤，７０℃旋转蒸发，干粉用６０％的乙醇溶解后定容至２５０ｍＬ，得到样品原液．取２
ｍＬ原液测定提取率，以确定提取的最佳条件．
１．３　微乳薄层色谱分离鉴定　
用１μＬ的毛细点样管吸取样品原液，在聚酰胺薄膜（１０×２０）上点样，样斑扩散直径不能超过２ｍｍ，
加入微乳液为展开剂，在室温下层析展开．层析结束后用吹风机冷风吹干，均匀喷１％的 ＡｌＣｌ３ 溶液，吹
干，在ＳＢ－２型薄层色谱仪３６５ｎｍ紫外灯下观察，用Ｎｉｋｋｏｎ　Ｄ－７０００数码相机拍照（见图１），进行色谱分
析．
１．４　西府海棠叶片总黄酮含量的测定
１．４．１　标准液的制备．准确称取芦丁标准品（１２０℃干燥恒重）０．２ｇ，用６０％的乙醇溶液溶解后定容至
１　０００ｍＬ，得浓度为０．２ｍｇ·ｍＬ－１的标准液．
１．４．２　测定波长的选择．取０．２ｍｇ·ｍＬ－１的芦丁标准液配成适当浓度，加入显色剂，在４８０－５４０ｎｍ波
长范围内进行扫描．结果显示在５００ｎｍ处出现最大吸光值，故选择５００ｎｍ为测定波长．
１．４．３　标准曲线的建立．采用 ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＯＨ 体系络合显色法，分别取标准液（０．２ｍｇ·
ｍＬ－１）０、１、２、３、４、５、６、７ｍＬ，然后分别加入６０％的乙醇溶液至１０ｍＬ，加入０．５ｍＬ　５％的ＮａＮＯ２ 溶液，
摇匀，静置６ｍｉｎ，然后加入０．５ｍＬ　１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３，摇匀，静置６ｍｉｎ，再加入５ｍＬ　４％的ＮａＯＨ溶液，
最后用６０％乙醇溶液定容到２５ｍＬ，混匀，静置１５－２０ｍｉｎ，于５００ｎｍ处测吸光值，以最小二乘法作线性
回归，得到芦丁吸光度Ｙ 与浓度Ｘ 的线性回归方程式
Ｙ＝０．００２６＋９．９５５４　Ｘ （Ｒ２＝０．９９９１）． （１）
吸光度线性范围：０．００８－０．０５６．
表２　芦丁标准曲线
取量／ｍＬ　 ０　 １　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７
浓度／ｍｇＷｍＬ－１　 ０　 ０．００８　 ０．０１６　 ０．０２４　 ０．０３２　 ０．０４　 ０．０４８　 ０．０５６
吸光值Ａ　 ０　 ０．０８２　 ０．１６６　 ０．２３３　 ０．３２７　 ０．３９７　 ０．４８５　 ０．５５８
２　结果与分析
２．１　正交实验结果与分析
在单因素试验的基础上，以固液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度设计四因素、三个水平Ｌ９（３４）正
交试验，各因素水平见表２，正交试验结果见表３，方差分析见表４
　　误差　　　　　０．０１
２０．０１Ｆ０．０１（２，２）＝９９，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．
由方差分析表中可知，乙醇浓度、提取温度对西府海棠叶中总黄酮的提取具有极显著性影响，四因素
中影响程度由大到小分别为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞固液比；得出最佳提取条件为：固液比＝
１：２０，乙醇浓度为７０％，提取时间为４ｈ，提取温度为８０℃，即Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ３．
７４第２期 钱柯成等：西府海棠（Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）总黄酮提取及微乳液薄层分析 　
因为得到的实验结果不在正交实验中，于是对Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ３ 进行了三组验证实验，结果得到提取率分别
为为７．７８％、７．８４％、７．８２％，平均值为７．８１％，即为西府海棠叶中总黄酮的最大提取率．
表３　正交实验结果
实验 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ 吸光值Ａ 总黄酮含量／％
１ Ａ１ Ｂ１ Ｃ１ Ｄ１ ０．３４４　 ５．３５８
２ Ａ１ Ｂ２ Ｃ２ Ｄ２ ０．４７７　 ７．４４６
３ Ａ１ Ｂ３ Ｃ３ Ｄ３ ０．４２６　 ６．６４５
４ Ａ２ Ｂ１ Ｃ２ Ｄ３ ０．４１３　 ６．４４１
５ Ａ２ Ｂ２ Ｃ３ Ｄ１ ０．４６５　 ７．２５７
６ Ａ２ Ｂ３ Ｃ１ Ｄ２ ０．３７０　 ５．７６６
７ Ａ３ Ｂ１ Ｃ３ Ｄ２ ０．４０４　 ６．３００
８ Ａ３ Ｂ２ Ｃ１ Ｄ３ ０．４８５　 ７．５７１
９ Ａ３ Ｂ３ Ｃ２ Ｄ１ ０．３４６　 ５．３９０
Ｋ１ １９．４６　 １８．１０　 １８．７０　 １８．０１ Ｔ＝５８．１９　
Ｋ２ １９．４７　 ２２．２８　 １９．２８　 １９．５２ Ｔ２＝３３８６．０８
Ｋ３ １９．２６　 １７．８１　 ２０．２１　 ２０．６６ Ｐ＝３７６．２３
Ｋ２１ ３７８．６９　 ３２７．６１　 ３４９．６９　 ３２４．３６
Ｋ２２ ３７９．０８　 ４９６．４０　 ３７１．７２　 ３８１．０３
Ｋ２３ ３７０．９５　 ３１７．２０　 ４０８．４４　 ４２６．８４
Ｑ　 ３７６．２４　 ３８０．４０　 ３７６．６２　 ３７７．４１
Ｓ 　０．０１ 　４．１７ 　０．３９ 　１．１８
表４　方差分析表
方差来源 ＳＳ　 Ｖ　 ＭＳ　 Ｆ 显著性
Ａ　 ０．０１　 ２　 ０．００５　 １
Ｂ　 ４．１７　 ２　 ２．０８５　 ４１７＊＊ Ｐ＜０．０１
Ｃ　 ０．３９　 ２　 ０．１９５　 ３９＊ Ｐ＜０．０５
Ｄ　 １．１８　 ２　 ０．５９　 １１８＊＊ Ｐ＜０．０１
２．２　西府海棠叶中黄酮的薄层色谱分析
在黄酮粗提液中加入石油醚萃取除去色
素，再以乙酸乙酯萃取提取其中的黄酮苷元，
收集萃取液，在６０℃下旋转蒸发，得到干粉
用６０％的乙醇溶液溶解，得样品液，用微乳
膜薄层色谱分析．结果如图１为３６５ｎｍ下荧
光显色模拟图，为图２中黄酮斑点的简化图，
由图可见，微乳液薄层能较好地分离西府海棠叶中的黄酮苷元成分［１１］．西府海棠中含有的黄酮种类较多，
其中有三种成分分别与芦丁、槲皮素、葛根素对照品的Ｒｆ值相同，且显色相同，表明西府海棠叶中含有芦
丁、槲皮素、葛根素．
３　结论
苹果属植物叶中黄酮类物质含量较高，因此，当海棠茶中加样过多时，茶水有较明显的苦味，实验结果表
明，西府海棠中黄酮类化合物含量也较高．西府海棠中黄酮类化合物的最佳提取条件为：以７０％乙醇为溶剂，
固液比１：２０，在８０℃条件下重复提取２次，每次提取４ｈ．在此条件下，黄酮类化合物的提取率可达７．８１％．
在提取过程中，石油醚能较彻底地去除色素，而乙酸乙酯可以较好地将西府海棠中的黄酮进行初步分
离出来，用微乳薄层色谱可定性地分离和检测黄酮苷元的种类．经微乳薄层色谱分离得到约十多个黄酮斑
点，说明西府海棠叶片中黄酮种类较多．
综合实验结果，西府海棠叶片中黄酮类化合物种类多，含量高，易于提取，是一种潜在的保健饮品，可
以通过提取纯化开发系列保健产品，有广阔的应用前景，今后有必要进一步对其进行更加精确的成分鉴定
和开发利用研究．
８４ 　 聊 城 大 学 学 报（自 然 科 学 版） 第２８卷
图１　西府海棠中的黄酮微乳薄层色谱模拟图　　　　　图２　西府海棠中的黄酮微乳薄层色谱　
注：图１－２中由左至右依次为：①槲皮素、②葛根素、③异鼠李素、④芦丁、⑤⑥样品
参 考 文 献
［１］　钱关泽．苹果属植物分类学研究［Ｄ］．南京：南京林业大学，２００５．
［２］　陆秋农，贾定贤．中国果树志（苹果卷）［Ｍ］．北京：中国农业科技出版社，１９９９．
［３］　赵良忠，段林东．三叶海棠饮料生产工艺 ［Ｊ］．食品工业科技，１９９８（１）：４２－４５．
［４］　张欣，费永俊，魏伟，等．湖北海棠叶中黄酮类化合物抗氧化作用的研究［Ｊ］．农产品加工学刊，２００８，１３３：３８－３９＋５４．
［５］　张宏岐，汪鏊植，邹坤，等．湖北海棠提取物的体外抗氧化活性研究［Ｊ］．食品科技，２００８，３３（１１）：１８３－１８５．
［６］　谢达平，赵肃清，曾晓雄．林檎叶黄酮含量的测定和提取方法的研究［Ｊ］．湖南林业科技，１９９７，２４（１）：５０－５２．
［７］　吴英，王秉文，王毅，等．沙棘总黄酮对大鼠心肌再灌注损伤的保护作用［Ｊ］．中国药理学通报，１９９７，１３（１）：５３－５５．
［８］　刘洪峰．豹皮樟总黄酮对酒精性脂肪肝大鼠脂质过氧化及ＴＮＦ２ａ生成的影响［Ｊ］．安徽医科大学学报，２００９，４４（２）：２３６－２４０．
［９］　彭勇，梁少伟，李文魁，等．国外抗流感病毒研究近况［Ｊ］．国外医学·植物药分册，１９９９，１４（１）：７－９．
［１０］　韩公羽，沈企华．植物药有效成分的研究与开发［Ｍ］．杭州：杭州大学出版社，１９９１．
［１１］　康纯．微乳薄层色谱用于黄酮类成分分离鉴定的研究［Ｊ］．药物分析杂志，２０００，２０（２）：１２１－１２３．
Ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＴＬＣ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ
Ｍａｌｕｓ　Ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）
ＱＩＡＮ　Ｋｅ－ｃｈｅｎｇ１　ＬＩＵ　Ｌｉａｎ－ｆｅｎ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８７５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ　２５２０５９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ　Ｍａｋｉｎｏ，ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｗａｓ　ｃｏｌｏｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｎｉｔｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｎｉｔｒｉｔｅ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｍ．
ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ　ｗａｓ　ｔｈｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ，ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｏｒ　ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　ｅｔｈｅｒ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ　ＴＬＣ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｐｒｏｐｅｒ　ｆａｔｏｒｓ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ　ｗｅｒｅ：７０％ｅｔｈａｎｏｌ
ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｆｏｒ　４ｈ，ａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　８０℃，ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ　ｓｏｌｉｄ：ｌｉｑｕｉｄ＝１：
３０．Ａｓ　ＴＬＣ　ｓｈｏｗｎ，ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｍａｎｙ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，３ｏｆ　ｔｈｅｍ　ａｒｅ
ｒｕｔｉｎｕｍ，ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ　ａｎｄ　ｐｕｅｒａｒｉｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ，ｆｌａｖｎｏｎｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＴＬＣ
９４第２期 钱柯成等：西府海棠（Ｍａｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）总黄酮提取及微乳液薄层分析