全 文 ：天 津 中 医 药
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine
2014年 5月第 31卷第 5期
May 2014,Vol．31 No．5
摘要：[目的]确立齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳水解工艺，并对水解后的苷元进行含量测定。[方法]通过正
交实验设计确定齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳酸水解条件，利用此酸水解条件，对齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物
进行酸水解，并采用高效液相色谱法对水解产物中的 3种苷元进行含量测定。[结果]确定齿叶白鹃梅叶总黄酮提取
物的最佳酸水解条件为：盐酸-甲醇浓度为 4.0 mol/L，水解温度为 78 ℃，水解时间为 4 h，经过 HPLC法测定，水解产
物算得到酸法水解后总黄酮苷元的平均含量为 58.38%±1.34%，其中木犀草素为 12.06%±1.43%，槲皮素为 9.66%±
0.32%，芹菜素为 36.66%±2.34%。[结论]该水解方法可有效水解齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物，HPLC测定方法准确、可
靠，可作为控制齿叶白鹃梅叶总黄酮水解产物质量的定量依据。
关键词：齿叶白鹃梅；总黄酮；酸水解；含量测定
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1519（2014）05-03 6-0
齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物酸水解工艺及
水解后苷元含量测定 *
李古月 1，2，刘佳鑫 1，2，才 谦 3
（1.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110000；2.中国医科大学药学院，沈阳 110000；
3.辽宁中医药大学药学院，大连 116600）
*基金项目：国家自然科学基金项目（81202919）。
作者简介：李古月（1984－），女，药师，从事临床制剂指导工作。
齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S. Moore.），
是蔷薇科绣线菊亚科白鹃梅属植物 [1]，主要生长在
辽宁凌源、喀左及河北一带，其花蕾和幼叶可食用。
民间多用其预防和治疗糖尿病。本课题组对其化学
成分进行了分离，从中得到芦丁、木犀草素-7-O-
β-D-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲
皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙
皮糖苷等十几种黄酮类化合物[2-3]。同时本课题组对
齿叶白鹃梅叶进行了药理活性研究，证明其确有改
善小鼠耐糖量和降血糖的作用[4]。
前期采用大孔树脂法对齿叶白鹃梅中的总黄
酮进行富集和纯化，得到总黄酮提取物，采用分光
光度法测得提取物中总黄酮的含量达到 60％左右。
由于总黄酮提取物中含有较多的分别以芹菜素、木
犀草素和槲皮素为苷元形成的多种苷，本实验对这
些黄酮苷的水解条件进行研究，通过水解使黄酮苷
转化成木犀草素、槲皮素、芹菜素 3种黄酮苷元，并
用高效液相色谱法测定这 3种苷元含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（包
括真空脱气机、四元泵、柱温箱、VWD、HP1100化学
工作站）（美国安捷伦科技有限公司），CP225D型电
子天平（Sartorius，十万分之一）。
1.2 试药 木犀草素、槲皮素、芹菜素对照品（批号
分别为 20120206, 20120213, 20120314，上海源叶生
物科技有限公司），齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物（总
黄酮含量为 60.51%），水为超纯水，甲醇、乙腈为色
谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物水解工艺考察
2.1.1 供试品溶液的制备和色谱条件 供试品溶
液的制备，称取 100 mg齿叶白鹃梅叶总黄酮提取
物，加入一定浓度的盐酸-甲醇溶液，于一定温度的
水浴中反应一定时间，冷却后过滤，用甲醇定容至
50 mL，过 0.45 μm滤膜后用 HPLC检测，通过正交
试验确定最佳酸水解条件。
色谱条件如下，色谱柱 Promosil C18 色谱柱
（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-2%冰乙酸
梯度洗脱（梯度洗脱程序见表 1），柱温 25 ℃，进样
量 10 μL，流速 1.0 mL/min，检测波长 267 nm。
2.1.2 水解工艺考察 水解时间的确定，固定水解
温度为 78 ℃，盐酸浓度为 5.0 mol/L，分别水解 1、2、
3、4、6 h，用 HPLC 检测，计算水解率，结果见图 1。
由图 1可知，水解时间为 2~4 h水解效果较好[5-7]。
水解率=（水解后总苷元-水解前总苷元）/水解
后总苷元
DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.18
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表 1 流动相梯度洗脱程序
Tab.1 Gradient elution program for mobile phase
时间（min） 流速（mL/min） 乙腈（%） 2.0%冰乙酸（%）
0 1.0 8 92
5 1.0 12 88
31 1.0 18.5 81.5
40 1.0 18.5 81.5
40.01 1.0 20 80
90 1.0 90 10
100
98
96
94
92
90
88
86
84
水
解
率
（
%）
1 2 3 4 5
水解时间（h）
图 1 水解时间的影响
Fig.1 Effect of hydrolysis time
水解温度（℃）
95
94
93
92
91
90
89
88
水
解
率
（
%）
48 58 68 78 88
图 3 水解温度的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature
表 2 正交实验因素水平
Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment
因素
水平
1 2 3
A水解时间（h） 2.0 3.0 4.0
B盐酸浓度（mol/L） 3.0 4.0 5.0
C温度（℃） 58 68 78
表 3 齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物水解正交实验及结果
Tab.3 The result of hydrolysis flavonoid aglycones from
Exochorda serratifolia S. Moore. leaves orthogonal
experiment
实验号 A水解时间 B盐酸浓度 C水解温度 水解率（%）
1 1 1 1 71.46±3.25
2 1 2 2 87.23±1.37
3 1 3 3 90.12±2.48
4 2 1 2 74.89±3.98
5 2 2 3 96.91±2.76
6 2 3 1 90.23±3.78
7 3 1 3 85.23±2.45
8 3 2 1 92.13±2.65
9 3 3 2 90.78±2.98
K1 82.94 77.19 84.61
K2 87.34 92.09 84.30
K3 89.38 90.38 90.75
优水平 3 2 3
R 6.44 14.9 6.45
表 4 正交实验方差分析表（F0.05=34.402）
Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment
（F0.05=34.402）
SS df Mean Square F Sig.
A水解时间 65.083 2 32.542 12.364 0.075
B盐酸浓度 398.646 2 199.323 75.734 0.013
C水解温度 79.521 2 39.761 15.107 0.062
Error 5.264 2 2.632
盐酸浓度的确定方法如下，固定水解温度 78℃，
盐酸浓度分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mol/L，水解 2 h，
用 HPLC检测，计算水解率，结果见图 2。由图 2可
知，盐酸浓度为 3.0~5.0 mol/L水解效果较好。
水解温度的确定如下，固定盐酸浓度为 5.0 mol/L，
温度分别为 48、58、68、78、88 ℃，水解 2 h，用 HPLC
检测，计算水解率，结果见图 3。由图 3可知，水解温
度为 58~78℃水解效果较好。
2.1.3 正交实验 考察多因素的综合效果，以 L9
（33）正交实验表安排实验（见表 2），实验结果及方
差分析分别见表 3、表 4。
由表 3可以看出，R2＞R3＞R1，即在影响水解率
的因素中，盐酸-甲醇浓度的影响程度最大，水解时
96
94
92
90
88
86
84
82
80
78
水
解
率
（
%）
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
盐酸-甲醇溶液浓度（mol/L）
图 2 盐酸浓度的影响
Fig.2 Effect of the concentration of hydrochloric acid
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间其次，水解温度最次。从表 4 也可以看出，PB＜
0.05，PA，PC＞0.05，说明盐酸-甲醇浓度是影响水解程
度的主要因素，且具有统计学意义。将 K值进行比
较，KA3＞KA2＞KA1，KB2＞KB3＞KB1，KC3＞KC1＞KC2，由此可得
三因素的最佳水平组合为 A3B2C3，即酸法水解最佳
工艺条件为：盐酸-甲醇溶液的浓度为 4.0 mol/L，水
解时间为 4 h，水解温度为 78 ℃。
2.2 水解产物中 3种黄酮苷元的含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱 PromosilC18色谱柱（4.6mm×
250 mm，5 μm），流动相：乙腈-2%冰乙酸（27 ∶73）；
柱温 25 ℃，进样量 10 μL，流速 1.0 mL/min，检测波
长 267 nm[6，8-9]。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取木犀草素、槲皮
素、芹菜素 11.85、10.92、11.70 mg，甲醇定容至 25 mL，
摇匀，即得 3种对照品溶液，浓度分别为 0.474 0、
0.436 8、0.468 0 g/L，备用。
2.2.3 供试品溶液制备 精密称取齿叶白鹃梅叶
总黄酮提取物 100 mg，加入 4.0 mol/L盐酸-甲醇溶
液 50 mL，于 78 ℃的水浴中反应 4 h，冷却后过滤，
用甲醇定容至 50 mL，过 0.45 μm滤膜，即得。
2.2.4 线性范围的考察 取上述 3种对照品溶液，
分别进样 2、4、6、8、10、20 μL，经 HPLC检测后，分
别以进样量为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，得回
归方程，见表 5。
2.2.5 精密度实验 取各对照品溶液，分别连续进
样 6次，以峰面积计算 RSD值。结果，木犀草素、槲
皮素、芹菜素的 RSD值均小于 2.0%。
2.2.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于
0、2、4、6、8、16、24 h进样，测定峰面积，计算 RSD值
均小于 2.0%。
2.2.7 重复性实验 取同一批样品 5份，分别测定
木犀草素、槲皮素、芹菜素含量，计算 RSD值均小于
2.0%。
2.2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样
品 6份，分别精密加入 3种对照品溶液，测定含量，
并计算回收率。结果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的
平均加样回收率分别为 95.2%±0.76%，94.7%±0.54%，
97.5%±0.54%，RSD值均小于 2.0%。
2.2.9 样品含量测定 取 3批供试品溶液，利用上
述确定的水解条件进行酸水解。采用 HPLC法检测
水解产物中槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量，计
算得到酸法水解后总黄酮苷元的平均含量为
58.38%±1.34%，其中木犀草素为 12.06%±1.43%，槲
皮素为 9.66%±0.32%，芹菜素为 36.66%±2.34%。
3 讨论
本实验通过正交实验设计，确立了齿叶白鹃梅
叶总黄酮提取物的最佳酸水解条件。利用该水解工
表 5 标准曲线表
Tab.5 Table of standard curve
苷元 标准曲线 相关系数 线性范围（μg/mL）
木犀草素 Y赞 =16 984X+74.964 0.999 0 0.094 8~0.948 0
槲皮素 Y赞 =27 510X+207.35 0.998 9 0.087 4~0.873 6
芹菜素 Y赞 =30 676X+457.91 0.999 3 0.093 6~0.936 0
注：a.总黄酮提取物水解前色谱图；b.总黄酮提取物水解后色谱
图；c.木犀草素对照品色谱图；d.槲皮素对照品色谱图；e.芹菜素对照
品色谱图
图 4 水解前后样品色谱图及各对照品色谱图
Fig.4 Chromatogram of the sample before and after
hydrolysis and reference substance solution
时间（min）
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艺对总黄酮提取物进行酸水解，使提取物中多种由
木犀草素、槲皮素和芹菜素与糖组成的黄酮苷转化
为相应的苷元。同时，建立 3种苷元的 HPLC测定
方法，对 3种苷元进行含量测定。
实验结果表明，该水解工艺可以有效的水解齿
叶白鹃梅叶总黄酮提取物，HPLC法分析样品中木
犀草素、槲皮素和芹菜素 3种苷元，方法简便、重复
性好，回收率高，可作为控制齿叶白鹃梅叶总黄酮
水解产物质量的定量依据。
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色谱峰的归属研究[J].天津中医药，2009,26(6):497-499.
（收稿日期：2013-12-25）
（本文编辑：高 杉，张震之）
Study on acid hydrolytic conditions of total flavonoids and the determination of flavonoid aglycones from Exochorda
serratifolia S. Moore. leaves
LI Gu-yue1, 2，LIU Jia-xin1, 2，CAI Qian3
（1.The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110000, China; 2. Pharmacy College of China Medical University,
Shenyang 110000, China; 3. Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China）
Abstract: [Objective] To establish the acid hydrolytic conditions of total flavonoids and to determine the flavonoid aglycones from Exo-
chorda serratifolia S. Moore. leaves. [Methods] The acid hydrolytic conditions were optimized by the means of orthogonal test and the
contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC. [Results] The optimum conditions of acid hydrolysis were: concentration
of hydrochloric acid 4.0 mol/L, temperature 78 ℃, time 4 h. The contents of luteolin, quercetin and apigenin were 12.06%±0.32%, 9.66%
±1.43% and 36.66%±2.34% respectively. [Conclusion] This method is accurate and reliable and can be used in the determination of the
flavonoid aglycones in Exochorda serratifolia S. Moore. leaves.
Key words：Exochorda serratifolia S. Moore; flavonoids; acid hydrolysis; content determination
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