全 文 ：中 国 酿 造
2014年 第 33卷 第 2期
总第 264期
响应面法优化超声波提取山荆子总黄酮工艺
吕 娜1，2，刘 阳1，崔艳艳1，夏海洋1，赵丽丹1，陈俊霞1
（1.吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春130118；2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100）
摘 要：采用超声波法对山荆子总黄酮的提取工艺进行了研究。考察乙醇体积分数、超声功率、提取时间对超声波法提取山荆子中总
黄酮的影响。在单因素试验的基础上，采用3因素3水平的响应面分析法对山荆子中总黄酮的提取工艺进行了优化，依据回归分析确
定最优提取条件。结果表明，最佳提取工艺条件为乙醇体积分数57%，提取时间45min，超声功率473W，此时的总黄酮提取率最高，
为12.86%。
关键词：响应面法；山荆子；总黄酮；提取工艺
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2014）02-0071-04
doi：10.3969/j.issn.0254-5071.2014.02.017
OptimizationofultrasonicwaveextractionoftotalflavonoidsfromMalusb cataby
responsesurfacemethodology
L譈Na1,2,LIUYang1,CUIYanyan1,XIAHaiyang1,ZHAOLidan1,CHENJunxia1
(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,130118,China;
2.CollegeofBiologicalandEnvironmentalSciences,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo,315100,China)
Abstract：UltrasonicwavewasappliedforextractionoftotalflavonoidsfromMalusbacca a.Effe tsofethanol concent ation, ultrasonic power and
extractiontimeontheextractionyieldoftotalflavonoidswereinvestigated.Onthebasisofsinglefactorinvestigation,responsesurfacemethodology
with three factorsat three levelswas adopted to optimize the extraction technologyof total flavonoids fromM. baccata. The optimal extraction pa-
rametersweredeterminedbytheregressionanalysis.Resultsshowedthattheoptimumconditionsofextractionwereasfollows:ethanolconcentration
57%,extractiontime45min,ultrasonicpower473W.Undertheoptimizedconditions,theextractionyieldoftotalflavonoidswas12.86%.
Keywords:responsesurfacemethodology;Malusbaccata;totalflavonoids;extractiontechnology
收稿日期：2013-12-15
基金项目：浙江省科技厅公益项目（2010C32066）；吉林农业大学博士启动基金（201308）
作者简介：吕 娜（1980-），女，副教授，博士，研究方向为天然产物化学。
山荆子（Malusbaccata）又名山丁子，是一种耐寒性极
强的蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物的果实[1-2]，多
生长于海拔800~2550m的山区，是苹果属植物中分布范围
最广的一个种，但集中分布于我国境内[3]。在食品工业中，
山荆子是酿酒和调制纯绿色饮品的良好原料，也用于加工
果脯、蜜饯和清凉饮料[4-5]。研究表明，山荆子富含微量元
素锰、锌、硒及多酚、黄酮等物质，其营养价值高于苹果，具
有抗氧化、抗肿瘤、抗微生物、抗炎、增强记忆力、保护神经
细胞、提高学习能力等功能[6-9]。由于山荆子资源分布范围
受限，因此，目前国内外对山荆子总黄酮提取工艺及生理
活性的研究几乎没有[10]。超声波提取技术是近年来快速发
展的一种提取活性物质的方法，具有快速、安全、高效等优
点，被广泛应用于多种植物成分的提取[11]。响应面分析法
（responsesurfacemethodology，RSM）[12]是一种优化工艺条
件的高效方法，可确定各因素及其交互作用在工艺过程中
对响应值的影响，准确地反映因素与响应值之间的关系。本
研究采用响应面法优化了超声波提取山荆子总黄酮的工
艺，为更好地开发利用山荆子资源提供一定的参考依据，也
为进一步研究山荆子总黄酮的生理活性提供前期的研究
基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
山荆子由吉林农业大学果园提供；芦丁标准品：国药
集团化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、Al（NO3）3、NaNO2
均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
JY92-型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份
有限公司；CHA-S型恒温振荡器：常州国华电器有限公司；
DHG-9140A型干燥箱：南京恒裕电子仪器厂；DELTA320
型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；SP-722E可见分光
光度计：上海光谱仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1芦丁标准曲线的绘制
准确称取芦丁标准品10mg，用20mL甲醇溶解，定容
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至50mL容量瓶中。分别取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、
5.0mL于10mL试管中，用体积分数30%乙醇补充各管体积
至5mL。每管分别加入0.3mL质量分数5% NaNO2溶液，
摇匀放置6min，再加入0.3mL质量分数10%Al（NO3）3溶液，
6min后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，蒸馏水补足体积至
10mL，放置15min。测定A510nm，并绘制标准曲线。得到芦丁
质量浓度C（mg/mL）与溶液吸光度值A之间的回归方程：
A=6.705C+0.1659，R2=0.998。
1.3.2提取液总黄酮含量的测定
成熟的山荆子果实烘干、粉碎。称取1g粉末，根据单
因素和响应面试验设计确定每组的提取条件，加入10mL
一定体积分数的乙醇，放入超声波细胞粉碎机进行提取，
设置提取时间和超声功率。将得到的提取液离心后取上清，
静置，定容至10mL。精密量取0.05mL测量液于10mL比色管
中，按1.3.1方法平行测定3次，按下式计算总黄酮提取率：
总黄酮提取率=
C×V1×V2
V2×m
×100%
式中：C为经吸光度值计算出的总黄酮质量浓度，mg/mL；V1
为测量液的定容体积，10mL；V2为测量时量取的试样
体积，0.05mL；V3为提取液的定容体积，10mL；m为山
荆子干粉的质量，1000mg。
1.3.3单因素试验
以总黄酮提取率为衡量指标，分别研究乙醇体积分数、
提取时间和超声功率3个因素的对山荆子总黄酮提取率
的影响。
1.3.4响应面试验方案
根据单因素试验结果设计因素水平，以乙醇体积分数、
超声功率、提取时间3个因素为自变量，以总黄酮提取率为
响应值，采用DesignExpert8.05b软件设计响应面试验方案
[12]，确定最佳提取条件的因素和水平，建立数学回归模型，
对工艺参数进行最优化分析，因素水平见表1。
2 结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
设定超声功率为400W，提取时间30min，研究不同体积
分数乙醇对山荆子总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。
由图1可知，当乙醇体积分数在0~60%范围内，提取率
随乙醇体积分数的增加而增加。但当乙醇体积分数＞60%
时，提取率随乙醇体积分数的增加而减小。这可能是由于
当乙醇体积分数增加到一定值时，提取溶剂与黄酮类化合
物极性差别增大，同时山荆子中一些醇溶性、亲脂性强的
成分溶解量增大，与黄酮类化合物竞争同乙醇-水分子结
合，减小了活性物质的溶解。因此，选取提取剂乙醇体积
分数在60%左右为宜。
2.1.2提取时间对总黄酮提取率的影响
在超声功率400W，提取剂为体积分数50%乙醇的提取
条件下，研究不同提取时间对山荆子中总黄酮提取率的影
响，结果如图2所示。
由图2可知，当提取时间在10~40min范围内，提取率
随提取时间的增加而增加，表明超声波能快速促进植物
细胞破壁，加速提取溶剂对细胞内黄酮类化合物的渗透。
40min时提取率达到最大，之后随提取时间增加提取率减
小，这可能与山荆子较长时间暴露于超声波条件下，黄酮
类物质发生了分解有关。
2.1.3超声功率对总黄酮提取率的影响
设定提取剂为体积分数50%乙醇，提取时间30min，研
究不同超声功率对山荆子中总黄酮提取率的影响，结果如
表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码
Table 1 Factors and coded levels of the Box-Behnken experimental
design
因素
A乙醇体积分数/%
B超声功率/W
C提取时间/min
80
600
50
60
500
40
40
400
30
+1
水平
0 -1
图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total
flavonoids
图2 提取时间对总黄酮提取率的影响
Fig. 2 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids
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图3所示。
由图3可知，在超声功率为500W时，提取率达到最大，
而继续增加超声波功率，提取率反而减小。这可能是由于
过强的超声波功率导致山荆子中黄酮类物质的破坏；同
时，较高功率条件下的超声波可能导致一部分极性较强的
黄酮类物质发生高频运动而热降解[13]。
2.2响应面分析法优化山荆子黄酮的提取工艺
2.21响应面分析方案及结果
根据2.1单因素试验结果设计因素水平，运用Design
Expert8.05b软件的试验设计原理[14-15]，以表1的因素水平
设计17组试验，试验分析方案及结果见表2。
2.2.2回归模型的建立及显著性分析
利用Design-Expert8.05b软件，对表2中的数据进行多
元回归拟合，获得黄酮提取率对乙醇体积分数、超声功率
和提取时间的二次多项回归方程：
Y=12.20-1.44A-1.55B+1.64C-1.11AB+0.075AC-0.31BC-
3.73A2-2.91B2- .59C2
方差分析结果如表3所示，用F检验判定回归方程中各
变量对响应值影响的显著性，概率越小，表示相应变量的
显著程度越高。
从表3可知，回归方程模型的P＜0.0001，即用该回归
方程描述各因子与响应值之间的关系时，因变量与全体自
变量之间的关系是极其显著的，说明了该方法是可靠的。
失拟项P=0.0658＞0.05，差异不显著，表明无失拟因素存
在，因此可以用该数学模型推测试验结果。相关系数R2=
0.9775，说明该模型能解释97.75%的响应面变化，只有2.25%
的变异，即该模型拟合优度较好。变异系数（coefficientof
variation，CV）为9.2%，说明其置信度较高，模型方程能够
较好地反映真实的试验值，可用此模型分析响应值的变化。
综合以上分析可以说明该模型可以用来分析和预测山荆
子黄酮的最佳提取条件。由回归方程及表3可见，各试验因
素对响应值的影响不是呈简单的线性关系，因素A、B、C、
A2、B2、C2的影响差异极显著，AB的影响差异显著，表明以
上因素对山荆子抗氧化活性物质的提取有显著影响。由3
因素的P值可见，各因素对山荆子总黄酮提取率影响大小顺
序为：提取时间＞超声功率＞乙醇体积分数。
2.2.3响应面分析与优化
两因素交互作用的响应曲面及其等高线见图4，表示
了乙醇体积分数、超声功率及提取时间3个因素中任意一
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型
A
B
C
AB
AC
BC
A2
B2
C2
残差
失拟项
纯误差
总离差
178.38
16.66
19.25
21.63
4.94
0.02
0.37
58.43
35.71
10.68
4.10
3.31
0.80
182.48
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
19.82
16.66
19.25
21.63
4.94
0.02
0.37
58.43
35.71
10.68
0.59
1.10
0.20
33.82
28.42
32.84
6.91
8.43
0.04
0.64
99.71
60.94
18.22
5.54
<0.0001
0.0011
0.0007
0.0005
0.0229
0.8511
0.4507
<0.0001
0.0001
0.0037
0.0658
**
**
**
**
*
**
**
**
不显著
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface model
注：“**”表示极显著水平（P<0.01）；“*”表示显著水平（P<0.05）；R2=
0.9775
图3 提取功率对总黄酮提取率的影响
Fig. 3 Effect of extraction power on extraction yield of total flavonoids
试验号 A乙醇体积分数/%B超声功率/WC提取时间/minY提取率/%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
60
60
60
80
40
40
60
80
80
60
60
60
60
80
40
60
40
600
500
500
500
500
400
400
400
600
500
500
400
500
500
500
600
600
50
40
40
30
50
40
50
40
40
40
40
30
40
50
30
30
40
7.34
12.75
12.07
3.08
10.53
6.68
11.31
7.28
2.21
11.66
11.95
7.43
12.55
6.54
7.37
4.69
6.06
表2 响应面法设计与试验结果
Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test
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个变量为零水平时，其余2个变量对山荆子总黄酮提取率
的影响。
由图4可知，总黄酮提取率3个因素的增大呈先增后降
的趋势，说明3个因素在所选范围内能产生最佳的响应值。
在响应面分析中，响应曲面的陡峭程度反映了响应值对于
处理条件改变的敏感程度。可见，乙醇体积分数和超声功
率交互作用的曲面较陡峭，表明其对总黄酮提取率的交互
作用明显。
2.2.3山荆子总黄酮提取工艺条件的确定
利用Design-Expert软件对工艺条件进行优化分析，结
合二次回归模型的数学分析结果，得出超声波提取山荆
子总黄酮的最佳工艺参数为乙醇体积分数57%、超声功率
473W、提取时间45min，在此条件下预测的提取率为12.95%。
验证试验结果表明，在此最佳条件下，3次重复试验的实际
提取率为12.86%，与响应面优化结果差异不显著，置信区间
（confidenceinterval，CI）＜95%，表明该模型具有一定的可
靠性。
3 结论
本研究在单因素试验的基础上将响应面法应用到山
荆子黄酮类化合物的提取，最终获得山荆子总黄酮的最佳
提取工艺参数为：乙醇体积分数57%，超声功率473W、提
取时间45min。在此条件下，总黄酮提取率为12.86%，与模
型预测值（12.95%）接近。本研究为今后更好的开发利用
山荆子资源提供了依据，具有重要的现实意义。
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图 4 各两因素交互作用对总黄酮提取率的响应曲面和等高线
Fig. 4 Response surfaces plot and contour plot of interaction among
each two factors of ethanol concentration, ultrasonic power
and extraction time on extraction yield of total flavonoids
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