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柱前衍生高效液相色谱法分析新疆桃胶的多糖组成



全 文 :  收稿日期:2011-04-28   修回日期:2011-05-24
 *通讯作者:刘 力,男,研究员,主要从事液相色谱和液质联用方法开发与研究.
第28卷第3期
Vol.28 No.3
分 析 科 学 学 报
JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE
2012年6月

Jun. 2012
文章编号:1006-6144(2012)03-0319-04
柱前衍生高效液相色谱法分析新疆桃胶的多糖组成
丁成丽1,2,刘 力*1,2,王 强3
(1.中国科学院新疆理化技术研究所,分析测试中心,新疆乌鲁木齐830011;
2.中国科学院新疆理化技术研究所,新疆植物资源化学重点实验室,新疆乌鲁木齐830011;
3.新疆大学理化测试中心,新疆乌鲁木齐830046)
摘 要:采用超声波辅助提取,乙醇沉淀,三氯乙酸去蛋白的方法提取新疆8种桃胶中
的多糖,将所得多糖用三氯乙酸进行水解并用1-苯基-3-甲基-5吡咯啉酮进行衍生化处
理,采用反相高效液相色谱-紫外检测法研究桃胶多糖的单糖组成。结果表明,8种桃
胶多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖和木糖组成,还含有少量的葡萄糖醛酸、鼠李糖及甘露
糖,不同品种的桃胶其多糖的单糖组成及含量存在一定差异。该方法简便,重现性良
好,适合进行桃胶多糖的成分分析研究。
关键词:桃胶;多糖;衍生化;单糖;高效液相色谱
中图分类号:O657.7+2   文献标识码:A
桃胶为桃树、李树、杏树等蔷薇科植物树皮分泌出来的黏性液体,经过风干或其它干燥方法而得到的
玻璃状透明物质,其主要成分为多糖[l]。桃胶多糖具有降低糖尿病血糖水平,调节血脂紊乱,改善机体胰
岛素敏感性的功能[2]。而对多糖的单糖组成进行分析是研究其性质、结构及构效关系的一项重要的内容,
也是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节[3]。多糖中单糖分析通常采用气相色谱法,但
容易出现色谱峰异构化分裂[4]。高效液相色谱法作为天然产物常用分离检测手段,因其具有简便高效等
显著优点而得到了广泛应用[5-6]。在进行糖类分析时,由于该类物质光活性较差,通常采用紫外或荧光试
剂对其进行衍生化处理,用以提高检测灵敏度[7]。1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮(PMP)作为还原性糖的常用
衍生化试剂之一,可在温和的条件下与还原性糖进行定量反应,且产物无立体异构现象,因而多用于多糖
化合物的单糖组成分析[8]。
本研究采用C18烷基键合柱及紫外检测器,建立了树胶多糖的单糖组分的高效液相色谱(HPLC)分
析方法,并对桃、巴旦杏、杏、李等新疆主要桃胶资源的单糖组成进行分析,希望为新疆桃胶资源的进一步
开发利用提供参考。
1 实验方法
1.1 仪器与材料
Aglient 1100型高效液相色谱仪,附 G1311A四元梯度泵,G1313A自动进样器,G1316A柱温箱,
G1314A紫外检测器(美国,Aglient公司);Phenomenex Gemini 110RCl8色谱柱(250×4.6mm,5μm)。
L-鼠李糖(Rha)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖醛酸(Glu-UA)、D-葡萄糖(Glu)、D-
半乳糖(Gal)、D-木糖(Xyl)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;所用试剂均为分析纯。实验所用8种桃胶由
中国科学院新疆生态与地理研究所提供。
1.2 树胶多糖的提取与分离[9-10]
将桃胶去杂,漂洗,冷冻干燥,粉碎后过80目筛得桃胶原粉末。
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1.2.1 超声波辅助提取 精确称取桃树胶原粉1g,加20mL 85%乙醇超声5min,重复两次,过滤,自然
挥发干燥。加100mL自来水,90℃搅拌提取4h后,在超声频率20kHz、超声功率70W 的条件下,超声
处理10min,重复两次。经离心并于60℃真空浓缩得浓缩液。
1.2.2 三氯乙酸脱蛋白 将浓缩液用10%三氯乙酸调节pH值至3,放置过夜,离心后取上清液得脱蛋白液。
1.2.3 醇沉干燥 加95%乙醇于脱蛋白液中至含醇量为85%,于室温下放置过夜,离心得桃胶多糖沉
淀,经真空干燥研磨得灰白色粉末状桃胶多糖。
1.3 树胶多糖的水解
称取桃胶多糖样品10mg于安瓿中,加入4mol·L-1三氟乙酸溶液1mL,封管后于90℃水解8h,得
水解样品溶液。转移至EP管中离心,取上清液用0.3mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至中性。
1.4 衍生化标记[11]
取配制好的5mmol·L-1单糖标准品及桃胶多糖水解液各100μL于EP管中,依次加入0.5mol·L
-1
PMP甲醇溶液100μL,0.3mol·L
-1 NaOH溶液100μL,混匀后置于70℃水浴中加热反应30min。冷
却后,再加入0.3mol·L-1 HCl中和至酸性,用0.5mL氯仿萃取,离心,加水至500μL混匀,待HPLC分析。
1.5 色谱条件
流动相:A,50mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(KH2PO4-NaOH,pH=6.9);B,乙腈;梯度模式:时间梯度
为0→10→25→40min,相应浓度梯度为15%→17.5%→20%→20%B;流速:1.0mL·min-1;检测波长:
250nm;进样体积10μL。
2 结果与讨论
2.1 桃胶多糖的提取与分离
采用超声波辅助提取、乙醇沉淀、三氯乙酸去蛋白方法对桃胶中多糖进行提取分离,所得桃胶多糖经
研磨粉碎后,状态为灰白色固体粉末,其得率见表1。
表1 多糖得率
Table 1 Yields of ploysaccharides
Breed  Yield(%) Breed  Yield(%) Breed  Yield(%) Breed  Yield(%)
Amygdalu
spersica var 74.35
Amygdalus
davidiana 76.13
Armeniaca
vulgaris Lam 75.62
Armeniaca
vulgaris Lam 72.53
Prunus
mongolica 71.41
Amygdalus
persica L 71.32
Amygdalus
communis L 74.26
Prunus
salicina Lindl 73.46
2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系考察 分别配制0.4、1、2、4、5mmol·L-1混合标准溶液,进行 HPLC分析,根据测定的
峰面积(Y)对相应单糖的进样浓度(X)进行线性回归。7种单糖经衍生化后线性回归方程见表2,各标准
单糖在浓度为0.4~5mmol·L-1的范围内呈良好线性关系。
表2 7种单糖的回归方程及线性范围
Table 2 The results of regression equation and detection limits for seven monosaccharides
Standard substance  Regression equation  Correlation coefficient(R2) Linear range(mmol·L-1)
Man  Y=4.8505 X+24.943  0.9997  0.4~5
Rha  Y=3.7804 X+23.844  0.9998  0.4~5
Glu-UA  Y=3.5382 X+3.8148  0.9998  0.4~5
Glu  Y=4.6874 X+8.9471  0.9997  0.4~5
Gal  Y=5.9331 X+22.262  0.9998  0.4~5
Xyl  Y=10.429 X+6.2125  0.9999  0.4~5
Ara  Y=8.2057 X+16.258  0.9999  0.4~5
2.2.2 精密度试验 取浓度为1mmol·L-1的7种单糖混合衍生化产物,重复进样5次,分别测量峰面积
值,计算出各单糖的相对标准偏差(RSD)分别为:甘露糖0.59%,鼠李糖0.56%,葡萄糖醛酸0.28%,葡
萄糖0.61%,半乳糖0.44%,木糖0.66%和阿拉伯糖0.34%。结果表明本法精密度良好。
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2.2.3 稳定性试验 取巴旦杏胶样品的衍生化产物溶液,分别在制备后0,2,4,8,12,24h进样,分别测
量峰面积值,计算样品中各单糖含量的RSD依次为:甘露糖0.61%,鼠李糖0.88%,葡萄糖醛酸0.94%,
葡萄糖0.58%,半乳糖0.58%,木糖0.60%和阿拉伯糖0.57%。表明室温下供试品溶液在24h内稳定。
2.2.4 重复性试验 取巴旦杏胶样品5份,按样品的制备方法制备溶液,衍生化产物连续进样3次,测量
峰面积值,计算各单糖的 RSD分别为:甘露糖1.42% ,鼠李糖2.59% ,葡萄糖醛酸2.07% ,葡萄糖
1.74% ,半乳糖1.23% ,木糖2.18%和阿拉伯糖1.81%。表明本法重复性良好。
2.2.5 回收率试验 精确称取已知含量的巴旦杏树胶多糖5份,分别精确加入各单糖标准溶液适量,按
样品的制备方法制备溶液。测量衍生化产物峰面积值,计算平均加样回收率分别为:甘露糖99.74% ,鼠
李糖103.55% ,葡萄糖醛酸99.17%,葡萄糖98.12% ,半乳糖103.12% ,木糖101.50%和阿拉伯糖
103.32%,相应的RSD分别为2.09%、1.00%、1.08%、1.98%、2.94%、2.17%和2.66% ,由结果可知回
收率较好。
2.3 样品分析
图1 单糖对照品PMP衍生物的色谱图
Fig.1 Chromatograms of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone
(PMP)derivatives of monosaccharide standards
0.PMP;1.Man;2.Rha;3.Glu-UA;4.Glu;5.Gal;6.Xyl;
7.Ara.
2.3.1 色谱条件优化 为实现桃胶多糖各组成单糖
的高效分离,对桃胶多糖可能包含的阿拉伯糖、半乳
糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、甘露糖和葡萄糖等7种
标准单糖的PMP衍生物的高效液相色谱分离条件进
行了优化。结果表明,磷酸盐缓冲溶液(KH2PO4-
NaOH)的pH=6.9,时间梯度为0→10→25→40min,
相应浓度梯度为15%→17.5%→20%→20%流动相B
的梯度洗脱模式为分离此7种单糖衍生物的较理想色
谱分离条件。如图1所示,色谱峰的各峰保留时间依
次为PMP、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳
糖、木糖和阿拉伯糖。其中,PMP衍生化试剂最先出
峰,不干扰单糖衍生物的分析。
2.3.2 单糖组成分析 采用标准曲线法计算得各种
桃胶多糖中各单糖的百分含量如表3。试样桃胶的多糖由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、
甘露糖和葡萄糖7种单糖组成,其中以阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸为主。通过对不同桃胶多糖
的比对,发现山桃树胶多糖中的阿拉伯糖含量特别高,而桃杏树胶多糖的葡萄糖醛酸含量明显高于其桃胶多
糖。不同品种的桃胶其多糖的组成及含量存在差异,在开发桃胶多糖时应考虑其组成不同,给予合理利用。
表3 桃胶多糖中各单糖的百分含量
Table 3 The monosaccharides content in gum polysaccharides
Breed  Ara(%) Gal(%) Rha(%) Glu-UA(%) Xyl(%) Man(%) Glu(%)
Amygdalus persica var  49.08  32.72  2.30  4.31  10.60  0.49  0.35
Prunus mongolica  45.73  21.45  3.70  5.71  10.73  0.36  0.47
Amygdalus davidiana  49.26  28.67  2.49  4.09  11.95  0.19  0.24
Amygdalus persica L  49.03  24.62  1.50  6.93  10.78  0.48  0.21
Armeniaca vulgaris Lam  45.13  34.86  2.44  6.17  7.66  0.84  0.40
Amygdalus communis L  42.08  34.81  1.48  6.34  8.50  0.51  0.44
Armeniaca vulgaris Lam  37.09  25.87  4.50  11.59  5.17  0.64  0.61
Prunus salicina Lindl  39.26  34.86  2.48  7.57  14.38  0.65  0.28
3 结论
本研究采用超声波辅助提取,乙醇沉淀,三氯乙酸去蛋白的方法,从新疆8种主要桃胶资源中提取得
到灰白色固体粉末状桃胶多糖,得率均在72%左右。其单糖组成主要为阿拉伯糖和半乳糖,此外还含有
少量的鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、甘露糖和葡萄糖,不同树种的桃胶其多糖的单糖组成及含量存在一定差
异。采用高效液相色谱法测定桃胶多糖的单糖组成,方法简单灵敏,操作方便快速,有利于深入分析桃胶
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第3期 丁成丽 等:柱前衍生高效液相色谱法分析新疆桃胶的多糖组成 第28卷
多糖样品,研究桃胶多糖性质,为合理开发和利用新疆桃胶资源提供科学依据。
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Analysis of Composition of Gum Shiraz Polysaccharide
Growing in Xinjiang by Precolumn Derivatization
High Performance Liquid Chromatography
DING Cheng-li 1,2,LIU Li*1,2,WANG Qiang3
(1.The Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry,CAS,Analysis and
Testing Center,Urumqi 830011;
2.The Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry,CAS,Plant Resources Chemistry
of Key Laboratory in Xinjiang,Urumqi 830011;
3.Physics and Chemistry Detect Center of Xinjiang University,Urumqi 830046)
Abstract:Gum shiraz polysaccharides were obtained from eight kinds of gum shiraz by ultrasonic
extraction,ethanol precipitation and protein removing with trichloroacetic acid.Then the polysaccharides
were hydrolyzed with trichloroacetic acid and then derived with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone.The
monosaccharide components of gum shiraz polysaccharides were determined by reverse phase high
performance liquid chromatography.The results showed that eight kinds of gum shiraz polysaccharides
mainly composed of arabinose,galactose and xylose,and also contained a smal amount of glucuronic
acid,rhamnose and mannose.It was found that the composition and content of monosaccharide were
different in eight kinds of gum shiraz.The method is simple,reproducible and suitable for the gum shiraz
polysaccharide composition analysis.
Keywords:Gum shiraz;Polysaccharide;Derivatization;Monosaccharide;High performance liquid chro-
matography
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