全 文 ：收稿日期:2007-06-30;　修订日期:2007-12-18
基金项目:科技部国家科技基础条件平台建设项目(No.2005DKA21006);
湖南省普通高校学科带头人培养费资助项目
作者简介:李胜华(1978-),男(汉族),湖南株洲人 ,现为怀化学院生物工程系
讲师,硕士学位 ,主要从事药用植物资源活性成分的检测与分离研究工作.
＊通讯作者简介:伍贤进(1965-),男(汉族),湖南新宁人 ,现任怀化学院生物
工程系教授 ,博士学位,主要从事药用植物资源及其持续利用研究工作.
大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮优化工艺研究
李胜华 , 伍贤进＊ , 刘惠君
(怀化学院 ,湖南 怀化　418008)
摘要:目的 研究大孔吸附树脂分离纯化翻白草中总黄酮的工艺条件。方法 比较 AB-8, NKA, NKA-9, D-152, D-
101, ADS-17等 6种大孔吸附树脂对翻白草总黄酮的静态解吸率。结果 D-101型树脂对翻白草中总黄酮有最好的吸
附分离性能。 D-101型大孔树脂分离纯化翻白草黄酮的最佳工艺条件为:柱体积为 160 ml, 翻白草提取物上样量为
62.5 mg/ml(以湿树脂体积计), 先用 pH4的蒸馏水淋洗 , 再用 30%的乙醇洗脱 , 洗脱剂用量为 2.5 ～ 3倍湿树脂体积。
结论 D-101型树脂是分离纯化翻白草黄酮的适宜大孔树脂 ,纯度超过 60%, 此工艺可行。
关键词:翻白草;　总黄酮;　大孔吸附树脂;　分离;　纯化
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2008)06-1301-02
　　大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂 ,近年来被广泛应用
于天然产物的分离 [ 1] 。根据其孔径 , 比表面积构成类型分为许
多类型。翻白草为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物 [ 2] , 主要成
分为乌苏酸和大量的黄酮类化合物。近年来 ,翻白草更多的药用
价值被发现 , 民间流行用翻白草治疗糖尿病并取得不错的疗效。
翻白草醋酸乙酯萃取物有较强的降血糖作用 , 能调血脂 、清除自
由基 、抑菌等 ,且毒性极小。翻白草的主要药理活性成分为黄酮
类物质 [ 3～ 5] 。近年来有关翻白草中黄酮类的测定与分析时有报
道 [ 6～ 7] ,但是尚未见采用大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮的系
统报道 , 故本实验对 AB-8, NKA, NKA-9, D-152, D-101, ADS
-17等 6种树脂进行筛选 , 旨在探索适合分离纯化翻白草中总
黄酮类物质的最佳大孔树脂及纯化的最佳工艺。最终筛选得到
对翻白草中总黄酮有最好的吸附分离性能树脂 ,且分离和纯化翻
白草中黄酮类成分(以翻白草总黄酮为主)纯度达到 62.48%,为
纯化翻白草提取物奠定了基础。
1　仪器与试药
752p紫外分光光度仪(上海光谱仪器有限公司);AL104电
子天平(Mettler-Toledo仪器公司);KQ-500DE型医用超声波
清洗机(昆山超声仪器有限公司);DF-101B集热恒温磁力搅拌
器(浙江乐清市乐成电器厂);TDZ5—WSD多管架自动平衡离心
机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);超声波提取仪(北京宏详隆
仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。树脂(天
津市海光化工有限公司);乙醇 、硝酸铝 、亚硝酸钠 、氢氧化钠 ,均
为分析纯。
材料采集于湖南怀化市溆浦县 ,经鉴定为蔷薇科委陵菜属多
年生草本植物翻白草 。
2　方法
2.1　翻白草供试液的制备 翻白草粉以 4倍量的 70%乙醇在超
声波功率为 610 W超声波循环提取 45 min, 过滤 , 减压浓缩回收
乙醇 , 静置冰箱过夜 ,过滤除去叶绿素备用。
2.2　标准曲线的制备 精密称取在 120℃减压干燥至恒重的芦
丁对照品 10.00 mg, 置于 50 ml的容量瓶中 , 加 95%的乙醇 30
ml, 置于水浴上微热溶解 ,放冷 , 加乙醇稀释至刻度 ,摇匀 , 即为浓
度为 0.2 mg/ml的芦丁标准品溶液。精密量取已制备的对照品
溶液 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 ml,分别置于 10 ml具塞试管中 ,加
1.0 ml亚硝酸钠(1:20)溶液 , 混匀 ,放置 6 min, 加 0.5 ml硝酸铝
(1:10)溶液 ,混匀 , 放置 6min,加 1 mol/L的氢氧化钠 4 ml,再加
水至刻度 ,摇匀 , 放置 15min,用分光光度法在 λ=500nm处测定
吸光度 ,用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度(Y)与吸光度(X)
的关系曲线的回归方程式:Y=0.8577X-0.0005 , R2 =0.999 2。
2.3　大孔树脂的处理 将 AB-8, NKA, NKA-9, D-152, D-
101, ADS-17大孔树脂依次用 2倍体积 5%NaOH水溶液浸泡
24h, 1倍体积蒸馏水 , 2倍体积 10%盐酸洗涤 , 最后用蒸馏水洗
至中性 。以乙醇湿法装柱 ,用 93%乙醇在柱上流动淋洗 , 不时检
查流出的乙醇液 ,至乙醇液与水混合(1∶5)无白色浑浊为止 , 然
后以大量蒸馏水洗去乙醇。
2.4　大孔树脂的筛选 将浓度为 50mg/ml的翻白草提取物水溶
液分别通过 6种不同型号的已预处理好的树脂柱 , 进行动态吸
附。用 1%FeCl3检查流出液 ,待反应呈阳性(检测显色)时 ,表明
已有黄酮流出 , 树脂吸附达饱和 , 停止上样 ,记录上柱量 , 计算总
黄酮吸附量 , 单位为 mg/ml。上样后的树脂柱先用水洗至无色并
用浓硫酸检测至无糖反应 ,再用 93%乙醇洗脱至洗脱液无色止。
将乙醇洗脱液蒸干 、称重 、测定总黄酮含量 、计算总黄酮回收率。
总黄酮吸附量及总黄酮回收率分别按公式(1)和(2)计算:
A=BV (1)
R=(ET)×100 (2)
式中 A:总黄酮吸附量(mg/ml);B:被树脂吸附的黄酮总量
(mg);V:湿柱体积(ml);R:总黄酮回收率(%);E:93%乙醇洗
脱液中黄酮总量(mg);T:上柱总黄酮量(mg)。
2.5　D-101大孔树脂柱纯化翻白草黄酮类化合物工艺的确定
2.5.1　上柱条件的确定 分别称取 5.07, 10.01, 15.17, 20.53 g
粗提物 ,溶于 50 ml水中 , 上柱(柱体积为 160 ml), 吸附 30 min
后 , 先用大量水淋洗 , 直到洗脱液无色并用浓硫酸检测不出糖为
止 , 然后用 93%的酒精洗脱至 AlCl3检测呈阴性(不显色), 收集
洗脱液 ,测总黄酮含量和回收率。
2.5.2　淋洗 pH值的确定 称取 10 g粗提物 , 溶于 50ml水中 , 上
柱后 , 分别用不同 pH值的水充分淋洗 , 直到用浓硫酸检测无糖
反应为止 , 再用 93%的酒精洗脱 , 直到用 1%FeCl3检测不显色为
止 , 收集洗脱液 , 测总黄酮含量和回收率。
2.5.3　洗脱条件的确定
洗脱剂的确定:称取 10 g粗提物 ,溶于 50 ml水中 , 上柱后先
用大量水淋洗至淋洗液无色并用浓硫酸检测不出糖 ,然后分别用
30%, 50%, 70%, 93%的乙醇洗脱 , 将乙醇洗脱液分别蒸干 、称
重 、测定总黄酮含量 、计算总黄酮回收率。
洗脱剂 pH值对翻白草黄酮纯化效果的影响:称取 10 g粗提
物 , 溶于 50 ml水中 ,上柱后 , 先用水充分淋洗 , 至淋洗液无色并
用浓硫酸检测不出糖为止 ,然后用 pH值分别为 2, 3, 4, 5和 6的
93%的乙醇洗脱 , 至 5%FeCl3检测不显色为止 , 将乙醇洗脱液分
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别蒸干 、称重 、测定总黄酮含量 、计算总黄酮回收率。
洗脱曲线的考察:按前面所确定的吸附 、洗脱条件 ,取翻白草
提取液上柱 、吸附 、洗脱(柱体积为 160 ml), 每 100ml收集一次 ,
共收集 7份 , 分别测吸光度值 ,据此绘制洗脱曲线 。
3　结果
3.1　大孔树脂的筛选 大孔树脂由于其理化性质不同对吸附分
离的影响很大。由于树脂极性 、孔径 、比表面积 、孔容等不同 ,故
性质不同。在所选择的 6种大孔树脂中 , NKA和 NKA-9为极
性 , AB-8为弱极性 , ADS-17为中等极性 , D-101和 D-152为
弱酸性阳离子交换树脂。
表 1　6种大孔树脂对翻白草黄酮的吸附分离性能比较
树脂型号 纯化前总黄酮含量 C/mg· g-1
纯化后总黄酮
含量(%)
总黄酮吸附量
C/mg· ml-1
总黄酮
回收率(%)
NKA 12 33.16 2.99 63.23
NKA-9 12 31.64 3.46 74.23
AB-8 12 39.23 3.65 72.35
D-101 12 46.45 4.78 76.56
D-152 12 32.42 3.21 68.23
ADS-17 12 20.36 2.89 59.86
　　由表 1可知 , D-101型大孔树脂分离纯化翻白草总黄酮效
果较好 , 总黄酮吸附量最高 , 这是因为翻白草黄酮是一种弱极性
物质 , 在弱极性柱上更容易吸附 , 同时可能是因为比表面积较大
的原因 , 也较容易洗脱 ,纯化后总黄酮含量最高 ,总黄酮回收率也
较高 , 故确定 D-101树脂为分离纯化翻白草黄酮的最佳树脂。
3.2　D-101树脂纯化翻白草黄酮的工艺
3.2.1　上柱量的确定 结果见表 2。
　　由表 2可知 , 当柱体积为 160 ml,粗提物上柱量为 10.01 g,
纯化后虽然纯化后总黄酮含量略低于上柱量为 5.07 g,但总黄酮
回收率最高。继续增加上柱量 , 由于吸附不完全 ,纯化后总黄酮
含量和回收率都明显降低。考虑到纯化效率 ,粗提物上样浓度以
62.5mg/ml湿树脂为宜。
表 2　不同上柱量对 D-101大孔树脂分离纯化翻白草黄酮的影响
上柱量 m/g洗脱液体积 V/ml 总黄酮含量(%) 总黄酮含量(%)
5.07 400 17.85 69.96
10.01 495 17.22 72.16
15.17 560 11.50 51.75
20.53 950 13.77 48.17
3.2.2　淋洗 pH值的确定 翻白草提取物中含有大量的水溶杂
质如色素 , 可溶性糖等 ,因此样品上柱后先用水淋洗可除去极性
较大的色素和糖等。
图 1　淋洗液 pH值对翻白草黄酮纯化效果的影响
　　由图 1可知 , 淋洗液的 pH值对翻白草黄酮纯化效果有一定
的影响。当 pH值从 2增大到 4时 , 总黄酮回收率增大 , 当 pH值
大于 4时总黄酮回收率减小 , 以 pH4效果最理想。 实验中还发
现 , 酸性水溶液能加快去杂和脱糖 , 这可能与提取物中糖的种类
和性质有关。
3.2.3　洗脱条件的确定 乙醇浓度对 D-101大孔树脂纯化翻白
草黄酮的影响结果见表 3。
表 3　乙醇浓度对 D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响
乙醇浓度
(%)
上样量
m/mg
洗脱液体积
V/ml
总黄酮含量
(%)
总黄酮回收率
(%)
30 10.00 495 39.56 64.56
50 10.00 396 28.56 62.35
70 10.00 289 23.65 59.68
90 10.00 192 23.36 70.32
　　由表 3可知乙醇浓度对 D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮有
较大的影响 ,用 93%乙醇洗脱总黄酮回收率最大 ,达 72.60%, 但
由于 93%的乙醇也能将其它杂质一起洗脱下来 , 致使醇洗物中
黄酮含量仅为 17.22%。用 30%乙醇洗脱可能由于解吸不完全
的原因 ,虽然总黄酮回收率较低 , 但醇洗物中总黄酮的含量最大 ,
达到 39.67%。综合考虑以 30%乙醇作洗脱剂较为适宜。
洗脱液 pH值对 D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响:
结果见表 4。
表 4　洗脱液pH值对 D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响
洗脱液
pH值
洗脱液体积
V/ml
纯化后总黄酮含量
(%)
总黄酮回收率
(%)
2 420 18.64 72.36
4 360 18.23 73.26
6 280 18.76 69.87
8 220 17.98 71.04
　　从表 4可以看出 , 洗脱液 pH值对 D-101树脂纯化翻白草
黄酮的影响不大 ,对纯化后总黄酮含量及回收率影响甚微 , 经统
计分析无显著差异 ,因此 , 洗脱剂无须调 pH值。
洗脱曲线的考察:由图 2可见 , 第 5份洗脱液吸光度显著减
小 , 表明此部分洗脱液中黄酮含量很低 , 绝大多数黄酮在前 4份
已被洗脱下来 ,从经济和效率考虑 , 第 5份后可不予收集 ,只收集
前 4份 , 即收集 400 ml, 故洗脱剂用量定为 2.5 ～ 3倍湿树脂
体积。
图 2　D-101大孔树脂洗脱曲线(30%乙醇为洗脱剂)
4　讨论
D-101大孔树脂对翻白草具有良好的吸附性能 , 用来纯化
翻白草黄酮是可行的。
D-101分离纯化翻白草总黄酮的最佳条件为:柱体积为 160
ml, 翻白草提取物上样量为 62.5 mg/ml(以湿树脂体积计), 先用
pH4的水淋洗 ,再用 30%的乙醇洗脱 , 洗脱剂用量为 2.5 ～ 3倍
湿树脂体积。D-101大孔树脂按上述确定的吸附洗脱条件可重
复使用 3次。翻白草黄酮经上述工艺纯化后总黄酮纯度达到
52.43%。大孔树脂色谱是吸附原理和分子筛原理相结合的新的
色谱方法 , 其吸附力以分子间范德华力为主;其分子筛作用是由
于其多孔性结构所决定。与传统的除杂方法和工艺相比 ,大孔树
脂吸附分离技术具有可使提取的有效成分高度富集 , 杂质少 , 缩
小剂量 。大孔树脂吸附分离技术作为一项新的技术 ,在国外已广
泛被使用 ,在我国也日益引起高度重视。与传统的提取技术和分
离技术相比 ,大孔树脂吸附分离技术以其独特的优势(所得提取
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.6　
物体积小 、不吸潮 、容易制成外形美观的各种剂型)在生产研究
中越来越被广泛地使用 ,它是对提取工艺影响最大 、带动面最广
的技术之一 [ 8] 。
参考文献:
[ 1] 　马振山.大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用 [ J] .中成药 ,
1997, 19(12):40.
[ 2] 　国家药典委员会.中国药典 [ S] .北京:化学工业出版社 ,
1986:2705.
[ 3] 　黄　芸 , 秦民坚 ,余国奠.异黄酮类化合物在植物界的分布及药理
作用 [ J] .中国野生植物资源 , 2001, 20(1):5.
[ 4 ] 　SanchezI, Gomez-GaribayF, Taboada1 J, etal.Antivralefectoffla-
vonoidsonthedenguevirus[ J] .PhytotheapyResearch, 2000 , 4:89.
[ 5 ] 　王　琦 ,周玲仙 ,罗晓东 ,等.翻白草不同方法提取物对小鼠降血糖
作用 [ J] .中国公共卫生, 2007, 23(2):225.
[ 6 ] 　张　俭 ,伍贤进 ,谭运兰 ,等.翻白草营养成分及部分药用成分的测
定与分析 [ J] .食品科技, 2006, 9:238.
[ 7 ] 　孟令云 ,杨　玲 ,王佳祥 ,等.翻白草中黄酮类化合物的液相色谱分
析 [ J] .中草药 , 2005, 36(3):445.
[ 8 ] 　宫健伟 ,叶　蕾.大孔树脂在中草药及复方提取分离中的应用进展
[ J] .甘肃中医 , 2007, 20(4):55.
收稿日期:2007-06-18;　修订日期:2007-10-20
基金项目:国家重点科学项目—维吾尔医内科学心血管学科的建设项目
(No.国中医药发 [ 2004] 14号);
江西中医学院科研基金课题(No.200605号)
作者简介:木合塔尔·奴尔买买提(1970-),男(维吾尔族),新疆策勒人,现任
新疆维吾尔医学高等专科学校副教授 ,学士学位,主要从事维吾尔药质量控制
工作.
＊通讯作者简介:杨武亮(1965-), 男(汉族),江西南昌人 , 现任江西中医
学院中药学教授 ,学士学位 ,主要从事中药质量控制工作.
维吾尔药牛舌草中总黄酮提取工艺的研究
木合塔尔·奴尔买买提1 , 杨武亮 2＊ , 吐尔洪·艾买尔 1 ,
温倩·纳斯尔 1 , 余宝金2 , 买买提·奴尔艾合买提 1
(1.新疆维吾尔医学高等专科学校 ,新疆 和田　848000;
2.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 ,江西 南昌　330004)
摘要:目的 研究维吾尔药牛舌草中总黄酮的最佳提取工艺。 方法 采用正交实验确定各因素的影响大小 ,确定维吾尔
药牛舌草中总黄酮的最佳提取条件 ,通过紫外分光光度法测定总黄酮含量。 结果 乙醇浓度对维吾尔药牛舌草中总黄酮
的提取影响作用最大 , 牛舌草中总黄酮的最佳提取工艺为:乙醇 75%;料液比 1∶6;温度 90℃ ;提取 2次 , 1.5 h/次 。结
论 该研究可为牛舌草总黄酮工业化提取提供理论依据。
关键词:牛舌草;　总黄酮;　正交实验;　提取工艺
中图分类号:R291.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)06-1303-02
StudyonExtractionProcessofTotalFlavonoidsinAnchusaitalicaRetiz
MUHTARNurma-mmat1 ,YANGWu-liang2＊ , TURGUNAmar1 , GUNQAMNa-sir1 ,YUBao-jin2 ,MAMATNurah-mat1
(1.XinjiangWeiwuerMedicalColege, Hetian, Xinjiang848000, China;2.TheKeyLabforModernTraditional
ChineseMedicalPreparationofMinistryofEducationinJiangxiColegeofTCM, Nanchang, Jiangxi330004,
China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheextractionprocessoftotalflavonoidsinAnchusaitalicaRetiz.MethodsThecontentofto-talflavonoidswasdeterminedbyUVspectrophotometer.Theinfluenceofeachfactorwasmeasuredbyorthogonalexperiments.Re-
sultsTheconcentrationofethanolhadthegreatestefectontheextractionoftotalflavonoids.Theoptimalconditionwasasfol-
lows:75% ethano1, 90℃, 1∶6(W/V)andextracting2times(1.5heachtime).ConclusionThisstudyprovidesthetheorybasis
fortheindustrialproduction.
Keywords:AnchusaitalicaRetiz;　Totalflavonoids;　Orthogonalexperiment;　Extractionprocess
　　维吾尔药材牛舌草为紫草科植物意大利牛舌草 Anchusaital-
icaRetiz.或琉璃苣 BorageofficinalesL.的地上部分 , 维吾尔医治
疗心脑血管疾病的常用药材之一 ,具有生湿生热 、调节异常黑胆
质 、生湿补脑 、祛寒补心 、爽心悦智 、润燥消炎 、止咳平喘等功
效 [ 1] 。意大利牛舌草经预试内含有黄酮等多种化合物 , 但目前
未见深入研究的报道。黄酮类化合物许多研究已表明生物类黄
酮具有多种生物活性 [ 2] , 除有抗菌 、消炎 、抗突变 、降压 、清热解
毒 、镇静 、利尿等作用外 ,在抗氧化 、抗癌 、防癌 、抑制脂肪酶等方
面也有显著效果 [ 3] 。由于黄酮类化合物的这些生物活性使得对
它的研究进入了一个新的阶段 , 掀起了黄酮类化合物的研究 、开
发及利用热潮。
黄酮类化合物的提取方法一般有水煎法 [ 4] 、碱提酸沉法和
有机溶剂提取法。水煎法和碱提酸沉法会带入大量水溶性杂质 ,
对以后的纯化和分离工作带来诸多不便。由于有机溶剂的提取
方法具有工艺简单 、效率高和较经济等优点 [ 5] , 本文对用有机溶
剂提取意大利牛舌草中黄酮类化合物的工艺进行了研究 ,旨在为
其工业化提取提供理论依据。
1　器材
1.1　仪器 111-型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安环球药械
厂);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公
司);旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);U-3000紫外分光
光度计(日本 HITACHI公司)。
1.2　试药 意大利牛舌草 , 购自新疆和田地区维吾尔药材市场 ,
经新疆维吾尔自治区药物研究所标本室张彦福研究员鉴定为意
大利牛舌草 (AnchusaitalicaRetiz.), 粉碎后过 20 目筛备用。
95%医用乙醇;芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所 , 含量测
定用 , 批号 0080-9705);亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、乙醇均为
分析纯 。
2　方法与结果
2.1　标准曲线的制备 准确称取芦丁标准品 10 mg, 置 50 ml容
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.6 时珍国医国药 2008年第 19卷第 6期