全 文 ：山西农业科学 2015，43（1）：81- 84 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
酶液提取扁核木叶片总黄酮的工艺优化
张秀秀 1，2，魏学智 2，赵瑞芬 3，李 华 4，程芳琴 1
（1.山西大学资源与环境工程研究所，山西太原 030006；2.山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041000；
3.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原 030031；4.山西大学环境与资源学院，山西太原 030006）
摘 要：采用酶液提取法从扁核木叶片中提取总黄酮，研究酶种类、提取温度、提取时间、酶液浓度等因素对总黄
酮得率的影响，并利用响应面法确定酶液提取扁核木叶片总黄酮的最佳工艺参数。结果表明，在酶解温度 53℃、
酶液质量浓度 0.3 mg/mL和酶解时间 1.9 h条件下，从扁核木叶片提取的总黄酮可达 1.379 mg/g。
关键词：酶液提取；黄酮；扁核木；响应面法
中图分类号：TQ461 文献标识码：A 文章编号：1002- 2481（2015）01- 0081- 04
Extraction of Total Flavonoids from Prinsepia uniflora
Batal. Leaf by Using Enzymolysis Method
ZHANGXiu- xiu1，2，WEI Xue- zhi2，ZHAORui- fen3，LI Hua4，CHENG Fang- qin1
（1.Institute of Resource & Environment Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.College of Life Science，Shanxi
Normal University，Linfen 041000，China；3.Institute of Agricultural Environment & Resource，Shanxi Academy of Agricultural
Sciences，Taiyuan 030031，China；4.College of Environment & Resource Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）
Abstract：Total flavonoids were extracted from Prinsepia uniflora Batal. leaves by using enzymolysis method. Extraction
temperature, extraction time and enzyme concentration were selected as influencing factors during extraction, and the protocol of
extracting total flavoniods from Prinsepia uniflora Batal. leaves was optimized by response surface methodology. The results showed that
the optimum extraction conditions were extraction temperature 53 ℃ , enzyme concentration 0.3 mg/mL, and extraction time 1.9 h. The
extraction rate was 1.379 mg/g under these conditions.
Key words：enzymolysis extraction; flavonoids; Prinsepia uniflora Batal.; response surface methodology
收稿日期：2014- 10- 21
基金项目：国家“863”计划项目（2012AA061602）；山西省科技攻关项目（20090311072）
作者简介：张秀秀（1984-），女，山西临汾人，硕士，主要从事植物活性成分研究工作。程芳琴为通讯作者。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2015.01.23
扁核木（Prinsepia uniflora Batal.）属于蔷薇科扁
核木属（Prinsepia Royle），喜光、耐旱、耐寒，主要分
布于山西、陕西北部和内蒙古南部等地区[1- 5]。目前，
对扁核木的研究主要集中于引种栽培[6- 8]、生长发育
和生理生态特性[9]等方面，对其叶片的研究鲜见报
道。有研究发现，黄酮类化合物一般存在于植物、蔬
菜、水果中，特别是高等植物的花、叶、根中较多[10]。
该类物质具有抗氧化、抗炎、抗菌、降血脂、抗癌和
预防心血管病的功能[11- 13]，在食品工业中可以作天
然着色剂、抗氧化剂和功能性食品的原料[14]。前期
的研究表明，扁核木叶片中含有较为丰富的黄酮类
化合物[15]，因而，扁核木具有很好的开发利用前景。
在从植物中提取黄酮类物质时，采用酶液法效率
高、提取条件温和而且毒性小[16]，是一种相对有效
的方法。截至目前，采用酶液提取扁核木叶片中黄
酮类化合物的研究还未见报道。
本研究拟采用酶液对扁核木叶片中的黄酮类
物质进行提取，在单因素试验结果基础上采用响应
面法进行最佳提取工艺条件的优化，为扁核木叶片
的开发利用提供一定的理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
试验用扁核木叶片采自山西省临汾市。样品干
燥磨碎后保存备用。芦丁标准品由国药集团化学试
剂有限公司提供，试剂均为分析纯。
1.2 试验仪器和主要设备
分析天平（TG328A，上海精密科学仪器有限公
司）；旋转蒸发仪（RE- 52A型，上海亚荣生化仪器
厂）；FW177型中草药粉碎机；可见分光光度计（721
81· ·
山西农业科学 2015年第 43卷第 1期
表 1 响应面试验水平编码
编码值
- 1
0
1
酶解温度
（A）/℃
40
50
60
提取时间
（B）/h
1.5
2.0
2.5
酶液质量浓度
（C）/（mg/mL）
0.2
0.3
0.4
型，上海天普分析仪器有限公司）；SW- 420- 2S型恒
温水箱。
1.3 标准曲线的绘制
总黄酮测定时采用文献[17]中的方法，以质量
浓度 C（mg/L）为横坐标、吸光度值 A为纵坐标，得
到二者的线性关系，回归方程为：A＝0.011 3C＋
0.000 5（R2＝0.999 8）。
1.4 酶法提取扁核木叶片总黄酮的单因素试验[18]
称取 1.0 g经过预处理的扁核木叶片粉末，在
其他条件相同的情况下，选择酶种类（纤维素酶和
果胶酶）、提取时间（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）、提取温
度（40，45，50，55，60 ℃）、酶液质量浓度（0.1，0.2，
0.3，0.4，0.5 mg/mL）作为考察因素进行单因素试验，
研究各因素对黄酮得率的影响。
1.5 响应面优化试验
在单因素试验基础上，选取主要影响因素采用
Box- Benhnken试验[19]设计法进行响应面分析试验。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酶种类的影响 取 1 g扁核木叶片粉末，分
别选用纤维素酶和果胶酶进行酶液提取。结果表
明，利用纤维素酶（得率为 1.32 mg/g）提取比果胶酶
（得率为 0.95 mg/g）的效果好，所以，选用纤维素酶
作酶液提取。
2.1.2 酶解温度的影响 从图 1可以看出，随着温
度的升高，黄酮得率逐渐增加，这是因为随着温度
的升高反应加快。当酶解温度为 50℃时，黄酮得率
最高（1.33 mg/g），随后开始减小。因为纤维素酶对温
度较为敏感。一方面，温度的升高使得酶活性增强，
酶解反应速度加快；另一方面，酶在过高温度的环
境中活性会迅速减弱，稳定性降低，进而会影响提
取效果。
2.1.3 酶解时间的影响 从图 2可以看出，当酶解
时间小于 2 h时，随着酶解时间的延长，黄酮得率逐
渐增大；在酶解时间为 2 h时，黄酮得率达最高，说
明此时酶解已基本完成，继续延长酶解时间黄酮得
率反而降低。
2.1.4 酶液质量浓度的影响 从图 3可以看出，在
酶液质量浓度小于 0.3 mg/mL时，黄酮类化合物的
得率随着酶液质量浓度的增大而增加；当酶液质量
浓度为 0.3 mg/mL时，黄酮类化合物得率最高；此后
继续增大酶液质量浓度黄酮得率并没有升高，说明
质量浓度为 0.3 mg/mL的纤维素酶已能将扁核木叶
片的细胞壁纤维素完全降解。
2.2 响应面法优化试验
在单因素试验的基础上，对酶解温度、提取时
间和酶液浓度进行响应面优化试验，结果如表 1，2
所示。
82· ·
张秀秀等：酶液提取扁核木叶片总黄酮的工艺优化
表 2 Box-Behnken 分析方案及响应值
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
A
0
0
1
- 1
0
0
1
0
1
1
- 1
0
0
0
0
- 1
- 1
B
0
0
- 1
0
0
0
0
- 1
0
1
- 1
- 1
1
1
0
1
0
总黄酮得率 /（mg/g）
1.369
1.350
1.253
1.207
1.387
1.333
1.150
1.102
1.284
1.102
1.138
1.293
1.234
1.076
1.369
1.125
1.133
C
0
0
0
1
0
0
1
1
- 1
0
0
- 1
1
- 1
0
0
- 1
表 3 回归方程方差分析
F值
34.560
6.823
12.450
1.712
7.572
17.154
48.057
65.288
90.185
39.699
0.336 0
显著性
＜0.000 1
0.034 8
0.009 6
0.232 0
0.028 4
0.004 3
0.000 2
＜0.000 1
＜0.000 1
0.000 4
0.801 7
均方
0.022
0.004
0.008
0.001
0.005
0.011
0.030
0.041
0.057
0.025
0.000 6
0.000 3
0.000 9
来源
模型
A
B
C
AB
AC
BC
A2
B2
C2
残差
失拟项
纯误差
总变异
自由度
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
平方和
0.196
0.004
0.008
0.001
0.005
0.011
0.030
0.041
0.057
0.025
0.004
0.000 9
0.004
0.200
从表 3可以看出，失拟性检验 P＞0.05，不显
著。因此，二次回归模型能较好地拟合响应面分析；
模型的显著性 P＜0.001，响应面回归模型达到极显
著水平，表明该试验方法可靠。经回归拟合求得方
程：Y＝1.37＋0.023A－0.031B－0.012C－0.035AB－
0.052AC＋0.087BC－0.099A2－0.12B2－0.077C2。
方差分析结果显示，各因素对总黄酮得率影响
从大到小排序为：A（酶解温度）＞C（酶液质量浓
度）＞B（酶解时间）。
从图 4～6可以看出，酶解温度（A）的升高和酶
解时间（B）的延长使得总黄酮的提取率呈现先上升
后下降的趋势，因此，偏低或偏高的酶解温度和过
长或过短的酶解时间都不利于总黄酮的提取。随着
酶解温度的升高和酶液质量浓度（C）的增大，总黄
酮提取率逐渐增大，到一定程度时，提取率的增加
幅度减小。在零水平以下时，提取率随着酶解时间
的延长与酶液质量浓度的增加而明显增加；但过度
延长酶解时间和增大酶液质量浓度反而使提取率
开始呈下降趋势，由此可以得出，提取时间过长不
利于总黄酮的提取。
83· ·
（上接第 74 页）
［13］ Rost B，Casadio R，Fariselli P，et al. Prediction of helical trans-
membrane segments at 95% accuracy [J]. Protein Science，1995，4
（3）：521- 533.
［14］ Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X
windows interface：flexible strategies for multiple sequence align-
ment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Res，
1997，25（24）：4876- 4882.
［15］ Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evo-
lutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary
distance，and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol，
2011，28（10）：2731- 2739.
［16］ Korotkov K V，Krumm B，Bagdasarian M，et al. Structural and
functional studies of EpsC，a crucial component of the type 2 se-
cretion system from Vibrio cholerae[J]. J Mol Biol，2006，363（2）：
311- 321.
［17］ Lee M S，Chen L Y，Leu W M，et al. Associations of the major
pseudopilin XpsG with XpsN（GspC）and secretin XpsD of Xan－
thomonas campestris pv. campestris type II secretion apparatus
revealed by cross- linking analysis[J]. J Biol Chem，2005，280（6）：
4585- 4591．
［18］Gérard- Vincent M，Robert V，Ball G，et al. Identification of XcpP
domains that confer functionality and specificity to the Pseu－
domonas aeruginosa type II secretion apparatus[J]. Mol Microbiol，
2002，44（6）：1651- 1665.
［19］Abendroth J，Rice A E，McLuskey K，et al. The crystal structure of
the periplasmic domain of the type II secretion system protein
EpsM from Vibrio cholerae: the simplest version of the ferredoxin
fold[J]. J Mol Biol，2004，338（3）：585- 596.
［20］ Bouley J，Condemine G，Shevchik V E. The PDZ domain of OutC
and the N- terminal region of OutD determine the secretion speci-
ficity of the type II out pathway of Erwinia chrysanthemi [J]. J Mol
Biol，2001，308（2）：205- 219.
［21］Opulente D A，Morales C M，Carey L B，et al. Coevolution trumps
pleiotropy：carbon assimilation traits are independent of metabolic
network structure in budding yeast [J]. PLoS One，2013，8（1）：
e54403.
据试验模型可得到，扁核木叶片酶液提取总黄
酮的最佳提取参数为酶解温度 53℃，酶解时间 1.9 h，
酶液质量浓度 0.3 mg/mL。按优选的提取工艺进行
3 次验证试验，得到的总黄酮得率为 1.381 mg/g，与
理论值（1.379 mg/g）相差不大，说明该模型可以用
于扁核木叶片总黄酮提取优化工艺研究。
3 结论
本试验结果表明，各种因素对总黄酮得率的影
响从大到小的顺序为酶解温度＞酶液质量浓度＞
酶解时间。本研究采用响应面法筛选出了酶液提取
扁核木叶片中总黄酮的最佳工艺参数：酶解温度
53 ℃，酶解时间 1.9 h，酶液质量浓度 0.3mg/mL。在此
条件下，模型预测总黄酮得率可以达到 1.379 mg/g。
参考文献：
［1］俞德浚.中国植物志[M].北京：科学出版社，1986.
［2］朱亚民.内蒙古植物志 [M].呼和浩特：内蒙古人民出版社，
2000：560- 562.
［3］中国科学院兰州沙漠研究所.中国沙漠植物志[M].北京：科学
出版社，1987：155.
［4］孙宇光.内蒙古果树品种及野生资源[M].呼和浩特：内蒙古人
民出版社，1989：256.
［5］熊文愈，汪计珠.中国木本药用植物[M].上海：上海科技教育出
版社，1993：646.
［6］李鸿杰. 扁核木的繁殖及利用 [J]. 林业实用技术，2002（4）：
26- 27.
［7］杨福红，赵晓明，张旺军，等.扁核木的研究进展[J].山西农业科
学，2008，36（9）：94- 96.
［8］朱元龙.优良乡土野生灌木扁核木种子的催芽试验 [J].种子，
2010，29（1）：96- 98.
［9］杨晓盆，张超，王文梅，等.扁核木光合特性的研究[J].中国生态
农业学报，2008，16（4）：909- 913．
［10］孟衡玲，张生超，苏一兰，等.药用植物通关藤中总黄酮提取工
艺研究[J].河南农业科学，2013，42（9）：157- 160.
［11］王芳，高瑜珑，石建雯.菠萝皮黄酮的提取及其稳定性、抗氧化
性研究[J].山西农业科学，2014，42（7）：672- 677，685.
［12］李铭芳，李淑芳，汪小强，等.枸杞中总黄酮的分析方法及提取
工艺研究[J].天津农业科学，2011，17（1）：46- 50.
［13］严鹤峰.枇杷叶总黄酮的超声波提取及体外抗氧化研究[J].山
西农业科学，2013，41（5）：449- 452，455.
［14］母智森，白英.荞麦籽壳中黄酮类化合物提取方法研究[J].内
蒙古农业科技，2002（6）：23- 25.
［15］张秀秀，魏学智，张强，等.响应面法优化蕤核叶片总黄酮提取
工艺[J].中国野生植物资源，2011，30（2）：27- 31.
［16］陈源，潘东明，郭金鹏，等.酶法辅助提取金柑皮总黄酮的工艺
研究[J].中国农学通报，2011，27（7）：442- 446.
［17］梁晓华，徐成东，王陆琴.云南 13种蕨类植物中总黄酮的测定
[J].安徽农业科学，2008，36（19）：7965- 7966.
［18］付明，向萍，李胜华，等.酶法提取华紫珠黄酮类化合物的工艺
探讨[J].怀化学院学报，2008，8（8）：45- 48.
［19］Santosa Wagna Piler Carvalho，Castro Jacira Teixeira，Bezerra Mar-
cos Almeida. Application of multivariate optimization in the devel-
opment of an ultrasound- assisted extraction procedure for multi-
elemental determination in bean seeds samples using ICP OES[J].
Microchemical Journal，2008，91（2）：153- 158.
山西农业科学 2015年第 43卷第 1期
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