全 文 ：China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 19 中国药房 2015年第26卷第19期
Δ基金项目：国家中医药管理局“药用植物学”重点学科资助项目
（No.国中医药发〔2009〕30号）；湖南省教育厅项目（No.10C1029）；湖南
中医药大学优秀教师培养项目（2013）；湖南省“中药学”重点学科建设
项目（No.湘教通〔2011〕76号）
＊讲师，博士。研究方向：中药资源与质量。电话：0731-
88458233。E-mail：paeonia_dd@126.com
# 通信作者：教授，硕士生导师。研究方向：中药资源与质量。
E-mail：qztong88@126.com
蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke种质资源极其丰富，
且适应性强、分布广泛。国内外现代化学研究表明，蛇莓全草
中含有三萜类、黄酮类、酚酸与香豆素类[1-2]等化学成分，临床
用于抑菌、抗肿瘤及促进免疫功能[3-4]，其抗肿瘤活性也引起了
广大学者的关注[5]；同时，蛇莓为观赏价值较高的园艺植物，因
此进行蛇莓种质资源的开发、筛选培育优良品种具有十分广
随机扩增多态性DNA技术对湘产蛇莓种质资源的遗传多样性分
析Δ
刘湘丹＊，高 昱，张亚利，蔡嘉洛，童巧珍#，张聪子（湖南中医药大学药学院，长沙 410208）
中图分类号 S567.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2015）19-2628-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2015.19.11
摘 要 目的：研究湘产蛇莓种质资源的遗传多样性。方法：建立不同地理分布的蛇莓种质资源随机扩增多态性DNA（RAPD）反
应体系，RAPD-聚合酶链反应（PCR）法检测湘产24组蛇莓样本（21个野生品，3个栽培品），琼脂糖凝胶电泳分析结果，计算等位基
因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、多态性位点百分比（PPB）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s信息指数（I）。结果：筛选出多态性
引物14条，共扩增出90条电泳谱带，其中多态带为81条，Na为1.900 0，Ne为1.540 1，PPB为90.0％，H为0.312 8，I为0.467 5。结论：
湘产蛇莓各区域样本间遗传多样性丰富，人工栽培品与野生品之间存在遗传背景上的差异，聚类结果与地理分布表现出明显相关性。
关键词 蛇莓；种质资源；随机扩增多态性脱氧核糖核酸；遗传多样性；聚类分析；聚合酶链反应
Analysis of the Genetic Diversity of Germplasm Resources of Duchesnea indica from Hunan by Random
Amplified Polymorphic DNA
LIU Xiang-dan，GAO Yu，ZHANG Ya-li，CAI Jia-luo，TONG Qiao-zhen，ZHANG Cong-zi（School of Pharmacy，
Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the genetic diversity of germplasm resources of Duchesnea indica from Hunan. METHODS：
The random amplified polymorphic DNA（RAPD）reaction system of germplasm resources was established and RAPD-PCR was ad-
opted to detect the expressions of 24 groups of D. indica from Hunan（including 21 wild and 3 cultivated varietos in different geo-
graphical distribution）. Agarose gel electrophoresis was used to analyze the results and calculate allele number（Na），effective al-
lele number（Ne）the polymorphism points percentage（PPB），Nei’s gene diversity index（H）and Shannon’s information index
（I）. RESULTS：Totally 14 polymorphic primers were screened and 90 electrophoresis bands were amplified，including 81 polymor-
phic bands with Na of 1.900 0，Ne of 1.540 1，PPB of 90.0％，H of 0.312 8 and I of 0.467 5. CONCLUSIONS：The genetic diver-
sity of D. indica from Hunan is rich，and there were differences in genetic background between the cultivated species and wild spe-
cies；clustering results show significant correlation with geographic distribution.
KEYWORDS Duchesnea indica；Germplasm resources；Random amplified polymorphic DNA；Genetic diversity；Clustering
analysis；Polymerase chain reaction
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（收稿日期：2015-01-08 修回日期：2015-03-06）
（编辑：邹丽娟）
􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈􀤈
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中国药房 2015年第26卷第19期 China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 19
阔的前景和意义。
随机扩增多态性 DNA（Random amplified polymorphic
DNA，RAPD）具有技术简单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、
检测容易、DNA模板用量少的特点[6-7]。本研究应用RAPD技
术对湖南省不同产地的 24组蛇莓样本进行分析，鉴别了不同
产地间样本的亲缘关系，结合课题组前期对湖南省不同产地
蛇莓有效成分熊果酸含量差异的分析结果[8]，提示蛇莓种质亲
缘关系与其内在化学成分含量存在相关性。本研究可为蛇莓
种质资源的保护、开发和利用提供理论依据。
1 材料
1.1 仪器
TGL-18M型台式离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限
公司）；MGL96G型聚合酶链反应（PCR）仪（杭州朗基科学仪
器有限公司）；GIS-1000B型核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf
公司）；1600R型全自动数码凝胶成像分析系统、EPS300型电
泳仪、VE-180型电泳槽（上海天能科技有限公司）；Fuhe501型
数显恒温水浴箱（江苏金坛医疗仪器有限公司）。
1.2 药材
试验所用材料为湖南省不同产地蛇莓新鲜叶片（见表1），
采样后洗净，剪下叶片吸干表面水分，置封口袋中于－70℃贮
藏，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为真品。
表1 蛇莓样本
Tab 1 List of D. indica samples
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
编号
隆回1号
隆回2号
隆回3号
隆回4号
邵东
常德1号
常德2号
常德3号
大围山1号
大围山2号
平江1号
平江2号
平江3号
平江4号
衡山
湘西
浏阳
株洲
娄底
植物园
含浦1号
含浦2号
望城
长沙县
采集地
邵阳市隆回县小沙江镇金竹山
邵阳市隆回县小沙江镇岩背
邵阳市隆回县金石桥镇
邵阳市隆回县司门前镇
邵阳市邵东县南冲水库
常德市安乡
常德市柳叶湖
常德市澧县
湖南省浏阳市大围山森林公园五指石
湖南省浏阳市大围山森林公园船底窝
岳阳市平江县冬塔乡黄桥
岳阳市平江县石浆乡
岳阳市平江县幕阜山
岳阳市平江县冬塔乡江背
衡阳市南岳区
湖南省永顺县西岐乡
浏阳市
株洲市
娄底市新化县
长沙市植物园
长沙市含浦街道湖南中医药大学药植园
长沙市含浦街道湖南中医药大学实验楼
长沙市望城县
长沙市长沙县白山镇
来源
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
C
C
C
W
W
注：W为野生种，C为栽培品种。12号样本植株叶深裂，与其他样
本存在差异
Note：W was wild species；C was cultivated varieties. The leaves of
sample No.12 were deeply lobed，and was different from other samples
1.3 试剂
植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公
司）；dNTPs、Taq DNA酶、10×PCR缓冲液（含Mg2+）、RAPD随
机引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；λDNA/Hind
Ⅲ、DL2000蛋白标准品均购自北京鼎国生物技术有限公司；
无水乙醇、氯仿均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 基因组DNA的提取
蛇莓植物基因组DNA采用试剂盒法提取。通过核酸蛋白测
定仪测得各样本DNA纯度：1.534＜光密度（OD）260/OD280＜2.040，
琼脂糖凝胶电泳检测呈完整谱带，符合RAPD-PCR要求[8-9]。
2.2 蛇莓种质资源RAPD-PCR反应体系的确定
2.2.1 RAPD-PCR反应体系的建立 结合前期正交试验与单
因素试验对影响 RAPD-PCR体系的 5个因素水平（Mg2 +、
dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物及DNA模板）进行优化，蛇莓种
质资源RAPD-PCR最优体系（20 μl）：Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTPs
250 μmol/L，Taq DNA酶 1 u，引物 0.2 μmol，DNA模板 60 ng，
双蒸水补齐至20 μl[10]。
2.2.2 引物筛选与退火温度确定 采取快速筛选方式，选出
两个产地来源有较大差异的样本，对 50个随机引物进行 2次
重复筛选，从中选出14条带型清晰、多态性高的引物。在30～
45 ℃之间设置 12个退火温度梯度，对其进行筛选。通过研
究，筛选出 14条清晰、条带稳定的多态性引物，最优退火温度
为 37 ℃。14条多态性引物序列及扩增结果见表 2。以引物
P25、P33为代表对24组蛇莓样本进行扩增，见图1、图2。
表2 14条多态性引物序列及扩增结果
Tab 2 Primer sequences and amplification results of 14
polymorphic primers
引物
P3
P8
P9
P19
P25
P27
P32
P33
P42
P57
P73
P86
P88
P99
序列5′-3′
GGGGGTCTTT
GAACGGACTC
GTGTGCCCCA
AGGGCGTAAG
CCCGGCATAA
GTGCCTAACC
AGGGCCGTCT
TGTAGCTGGG
ACGCAGGCAC
GTGACAGGCT
CTCCAGCGGA
GGCTGCAATG
TCCGAGAGGG
GTCCTGGGTT
扩增带数
6
6
6
6
7
6
8
11
6
5
5
7
6
5
多态带数
6
6
5
6
5
5
8
10
4
3
5
7
6
5
多态带的百分比，％
100
100
83.3
100
71.4
83.3
100
90.9
66.7
60.0
100
100
100
100
图1 引物P25对24组蛇莓样本的扩增电泳图
M. Marker；1～24. 24组蛇莓样本
Fig 1 Electrophoretogram of primer P25 to 24 groups of D.
indica samples
M. Marker；1-24. 24 groups of D. indica samples
2 000
1 000750500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
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China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 19 中国药房 2015年第26卷第19期
2.2.3 RAPD-PCR扩增程序 优化的RAPD-PCR扩增程序：
94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，37℃退火 1 min，72℃延
伸1 min，40个循环；72℃再延伸5 min。4℃贮藏。扩增产物
以1％琼脂糖凝胶分离，在恒压下电泳30 min，凝胶成像。
2.3 数据统计分析
对 24组蛇莓样本RAPD-PCR产物检测结果进行数据统
计；同一引物在迁移位点相同的位置，有条带记为1，无带则记
为0，模糊不清晰的条带不计入。以0、1格式输入Excel表格建
立数据库。利用POPGEN32软件计算下列遗传参数：等位基
因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、
Shannon’s信息指数（I）、多态性位点百分比（PPB）。采用NTSYS
生物多态性分析软件，进行各来源间非加权组平均法（UPG-
MA）聚类分析，构建24组蛇莓样本的系统聚类分析树状图。
2.3.1 蛇莓种质遗传多样性分析 14条RAPD-PCR引物共扩
增出90个位点，其中多态性位点有81个，PPB为90.0％。平均
每条引物扩增出6.43条带，其中P33号引物扩增最多，为11条
带，扩增片段范围在100～2 000 bp，并且不同引物显示的多态
性不一样，遗传多样性较丰富。24组蛇莓样本遗传多样性参
数见表3。
表3 24组蛇莓样本遗传多样性参数
Tab 3 Genetic diversity indexes of 24 groups of D.indica
样本数
24
Na
1.900 0
Ne
1.540 1
H
0.312 8
I
0.467 5
2.3.2 遗传相似性 利用 POPGEN32软件计算遗传参数
（Na、Ne、H、I）。结果表明，不同地区间蛇莓种质遗传相似性变
化范围为0.411 1～0.944 4，其中常德1号与常德2号遗传相似
性最大为 0.944 4，常德 2号与植物园的遗传相似度最小为
0.411 1。遗传相似性越大，说明亲缘关系越近；反之则亲缘关
系越远，差异也越大。24组蛇莓样本的遗传相似性见表4。
2.3.3 聚类结果分析 依据Nei’s遗传相似度，利用NTSYS
软件对24组蛇莓样本进行聚类分析，构建遗传聚类图，结果进
一步明确了样本的遗传分化程度及相互之间遗传关系的大
小。在阈值为0.52的条件下，将样本划分为两大类：常德1号、
常德2号、平江2号、常德3号为一大类，其余为第二大类，说明
不同产地样本的遗传背景存在很大差异。常德 1号与 2号遗
传相似性最大，为0.944 4，因此聚为一类，二者与常德3号都属
同一产地，亲缘关系较近。基于蛇莓RAPD的聚类分析树状图
见图3。
由图3可知，第二大类可以进一步在不同相似系数水平上
划分出几个小组。如在阈值为 0.70处又被分为两类，湘西单
独归为一类，但与其他组的遗传相似度也在 0.63～0.75之间。
图2 引物P33对24组蛇莓样本的扩增电泳图
M. Marker；1～24. 24组蛇莓样本
Fig 2 Electrophoretogram of primer P33 to 24 groups of D.
indica samples
M. Marker；1-24. 24 groups of D. indica samples
2 000
1 000750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
表4 24组蛇莓样本的遗传相似性
Tab 4 Genetic similarities of 24 groups of D. indica
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
1
1.000 0
0.822 2
0.888 9
0.866 7
0.811 1
0.500 0
0.488 9
0.477 8
0.711 1
0.733 3
0.755 6
0.544 4
0.755 6
0.766 7
0.811 1
0.677 8
0.800 0
0.766 7
0.755 6
0.700 0
0.788 9
0.788 9
0.755 6
0.755 6
2
1.000 0
0.888 9
0.866 7
0.811 1
0.522 2
0.466 7
0.455 6
0.777 8
0.800 0
0.800 0
0.544 4
0.777 8
0.833 3
0.788 9
0.700 0
0.777 8
0.833 3
0.733 3
0.700 0
0.811 1
0.833 3
0.844 4
0.777 8
3
1.000 0
0.911 1
0.900 0
0.544 4
0.488 9
0.477 8
0.822 2
0.822 2
0.844 4
0.566 7
0.777 8
0.855 6
0.833 3
0.722 2
0.822 2
0.833 3
0.777 8
0.766 7
0.877 8
0.833 3
0.822 2
0.822 2
4
1.000 0
0.877 8
0.611 1
0.555 6
0.522 2
0.822 2
0.800 0
0.822 2
0.655 6
0.777 8
0.833 3
0.811 1
0.700 0
0.822 2
0.855 6
0.777 8
0.722 2
0.855 6
0.855 6
0.800 0
0.777 8
5
1.000 0
0.555 6
0.500 0
0.488 9
0.855 6
0.811 1
0.855 6
0.577 8
0.788 9
0.822 2
0.822 2
0.755 6
0.788 9
0.800 0
0.744 4
0.777 8
0.844 4
0.822 2
0.833 3
0.833 3
6
1.000 0
0.944 4
0.822 2
0.544 4
0.522 2
0.544 4
0.911 1
0.500 0
0.577 8
0.533 3
0.488 9
0.566 7
0.600 0
0.522 2
0.466 7
0.622 2
0.577 8
0.500 0
0.477 8
7
1.000 0
0.877 8
0.511 1
0.488 9
0.511 1
0.900 0
0.466 7
0.522 2
0.477 8
0.455 6
0.511 1
0.544 4
0.466 7
0.411 1
0.566 7
0.522 2
0.444 4
0.422 2
8
1.0000
0.5000
0.4778
0.5000
0.8444
0.4556
0.5111
0.4889
0.4444
0.5222
0.5111
0.4778
0.4222
0.5556
0.5111
0.4111
0.4333
9
1.000 0
0.844 4
0.866 7
0.588 9
0.822 2
0.8556
0.811 1
0.700 0
0.822 2
0.833 3
0.777 8
0.811 1
0.833 3
0.766 7
0.822 2
0.777 8
10
1.000 0
0.866 7
0.588 9
0.777 8
0.900 0
0.811 1
0.677 8
0.800 0
0.811 1
0.800 0
0.788 9
0.788 9
0.788 9
0.777 8
0.733 3
11
1.000 0
0.588 9
0.844 4
0.922 2
0.900 0
0.722 2
0.844 4
0.855 6
0.800 0
0.833 3
0.855 6
0.855 6
0.822 2
0.777 8
12
1.000 0
0.544 4
0.622 2
0.577 8
0.533 3
0.611 1
0.644 4
0.566 7
0.511 1
0.644 4
0.622 2
0.522 2
0.500 0
13
1.000 0
0.833 3
0.877 8
0.633 3
0.800 0
0.811 1
0.777 8
0.766 7
0.788 9
0.877 8
0.800 0
0.733 3
14
1.000 0
0.888 9
0.711 1
0.877 8
0.888 9
0.833 3
0.822 2
0.866 7
0.844 4
0.811 1
0.766 7
15
1.000 0
0.688 9
0.877 8
0.844 4
0.811 1
0.822 2
0.866 7
0.844 4
0.811 1
0.811 1
16
1.000 0
0.677 8
0.733 3
0.611 1
0.711 1
0.777 8
0.711 1
0.722 2
0.722 2
17
1.000 0
0.877 8
0.866 7
0.811 1
0.877 8
0.833 3
0.800 0
0.800 0
18
1.000 0
0.788 9
0.777 8
0.866 7
0.844 4
0.811 1
0.766 7
19
1.000 0
0.766 7
0.811 1
0.788 9
0.755 6
0.711 1
20
1.000 0
0.777 8
0.777 8
0.811 1
0.811 1
21
1.000 0
0.866 7
0.811 1
0.833 3
22
1.000 0
0.811 1
0.766 7
23
1.000 0
0.888 9
24
1.000 0
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中国药房 2015年第26卷第19期 China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 19
其他组可在阈值 0.81处分为两小类，植物园、望城、长沙县分
为一小类，剩下的 16组则出现交叉聚类关系，单独成一小类。
分析结果可知，湘产蛇莓种质资源存在遗传多样性。根据
RAPD遗传距离系数划分类群结果分析，大部分供试样本与地
理位置分布有一定相关性，体现出明显地域差异。来自相同
种源地的样本大部分聚在一类，亲缘关系较近，如邵东组和隆
回各组间、常德各组间、大围山各组间等；人工栽培品种与野
生种之间存在遗传背景上较大的差异，如植物园组蛇莓为人
工栽培品种，其与常德2号遗传相似度为0.411 1，在所有供试
样本中遗传相似度最小，提示以上两样本间亲缘关系最远。
3 讨论
蛇莓喜生于阴湿环境，常生于沟边潮湿草地，在湖南各地
均有分布。从聚类分析结果可知，蛇莓种质资源间具有明显
的地域差异；如同位于湘北地区的常德、岳阳，其平均海拔在
300米以下，同属中亚热带湿润季风气候向北亚热带湿润季风
气候过渡地带，两地来源的样本表现出很大的遗传差异；同
时，湘产蛇莓种质亲缘关系与其分布地域的海拔存在相关性，
如来自中高海拔地区（包括邵阳、湘西等地）的样本间、处于平
原及丘陵地区（包括常德、岳阳、长沙等地）的样本间，具有较
小遗传相似度系数，遗传关系较远。这种环境差异导致的遗
传差异，体现了湘产蛇莓对不同环境适应及繁殖衍化的结果。
在同一种源地内蛇莓种质间的亲缘关系近、遗传相似度
高、差异小，如常德、岳阳、邵阳、长沙等地区内采集的样本在
阈值 0.80处均可单独聚成一类，说明来自同一个种源地内的
样本亲缘关系近，植物的遗传特征相对稳定。聚类结果揭示
了蛇莓种质地理分布区的规律，地理区域相近的样本常聚为
一类，表明在蛇莓种质资源收集、保护时要尽可能考虑不同地
理来源及不同的生态型。
同为人工栽培品种的植物园、含浦 1号、含浦 2号可在阈
值为 0.85处分别聚类在不同组别，反映其各自的亲缘关系与
遗传分化历史；常德 2号与植物园的遗传相似度系数最小，亲
缘关系最远，提示野生种与人工栽培品种之间存在遗传背景
差异。该研究结果为湖南省蛇莓种质资源的育种、科研和生
产开发提供了分子水平上的实验和理论依据。
在采集样本过程中，发现有的蛇莓植株叶形发生变异，如
平江 2号为野生种，其叶深裂，与其他植株存在差异。从聚类
分析的结果亦可看出，其与同样来自平江的其他样本遗传多
样性存在较大差异，却与常德 1号、常德 2号的遗传相似度很
大，具体原因还有待考察。
本课题组前期对湖南省不同产地蛇莓有效成分熊果酸含
量差异分析结果显示，平江 2号样本熊果酸含量最高，常德 1
号和常德2号样本含量次之[8]；结合本试验研究结果，提示蛇莓
种质亲缘关系与其内在化学成分含量存在相关性。结合项目
组前期蛇莓有效成分分析结果和本试验遗传多样性试验结
果，拟选取平江 2号蛇莓进行人工栽培，以培育出有效成分含
量高、产量高的“双高”蛇莓栽培品种。而且可通过杂交育种，
选常德1号或植物园组任一样本为母本材料，杂交培育出性状
优异和有效成分含量高的新品种。
结合蛇莓的地域差异对化学成分的影响，从表现型和基
因型数据两方面进行阐明，可以考虑对特异性的条带DNA进
行回收测序，寻找出调控有效成分累积的特定基因片断；亦可
应用RAPD-PCR技术建立的蛇莓DNA指纹图谱，结合化学成
分指纹图谱建立蛇莓的种质多元鉴别体系，以快速筛选蛇莓
优良种质资源。
参考文献
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（收稿日期：2015-02-07 修回日期：2015-04-07）
（编辑：张 静）
图3 基于蛇莓RAPD的聚类分析树状图
Fig 3 Clustering analysis tree diagram based on the D. indi-
ca RAPD
隆回1号
隆回2号
隆回3号
隆回4号
邵东
大围山1号
大围山2号
平江1号
平江4号
衡山
浏阳
株洲
含浦1号
平江3号
含浦2号
娄底
植物园
望城
长沙县
湘西
常德1号
常德2号
平江2号
常德3号
0.52 0.63 0.73 0.84 0.94
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