全 文 ：72　 西南民族大学学报 自然科学版 第 32卷
文章编号:1003— 2843(2006)01— 0072— 06
青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究
吴启勋 ,安燕 ,高锦红 ,卢永昌 ,包锦渊 ,胡树青 ,于军
(青海民族学院化学系 , 西宁 810007)
摘　要:利用高效液相色谱法建立了青藏高原红景天的色谱指纹图谱. 色谱条件:K rom asil C18柱 (250 mm ×4. 6mm,
5μm), 甲醇:0. 04%磷酸水梯度洗脱 ,流速为 1 mL /m in, 检测波长 278nm.通过比较发现红景天样品的 13个主要共有峰 ,
可作为鉴别红景天药材的主要依据.对 16批红景天药材进行了相似度计算和聚类分析 , 结果表明 , 所建立的红景天指纹
图谱可用于红景天药材品种鉴别和质量评价.
关键词:高效液相色谱;红景天;指纹图谱;相似度;聚类分析
中图分类号:Q946. 91　　　　　　　　文献标识码:A
收稿日期:2005 - 10 - 27
作者简介:吴启勋(1947 -), 男 ,湖南人 , 青海民族学院化学系教授 ,硕士生导师.
基金项目:青海省重点科技攻关项目(2004 -N - 149).
　　中药质量控制关系到国家中药的产业化 、现代化和国际化进程.作为其质量控制的关键指纹图谱技术越来越
受到人们的重视 [ 1, 2] .中药材或中成药经适当预处理后 ,利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现
中药材或中成药特性的图像 、图谱及其数据 ,称为中药指纹图谱[ 3] . 这样得到的指纹图谱经过数据处理分析后 ,可
以较全面地反映中药材或中成药所含的化学成分的种类和数量 ,进而反映中药材或中成药的质量和中医用药所
体现的整体疗效 ,较之传统的仅靠一 、二种有效成分或指标的质量控制方法 ,更具有科学性和全面性 [ 4] .我们利用
高效液相色谱法 ,首次建立了青藏高原红景天 (Rhodiola rosea)药材色谱指纹图谱 ,以计算机作为指纹图谱解析工
具 ,采用相似度分析 、聚类分析等综合数据处理分析方法 [ 5] ,得到了与传统的经验鉴别方法相一致的结果 ,实现了
对青藏高原红景天药材的质量鉴别.
1　仪器 、试剂和材料
仪器:A gilen t 1100高效液相色谱仪(大连伊利特 K romasil C18 5μm分析拄 ,规格:250mm ×4. 6mm ,二元梯度
泵 , DAD检测器 , Ag ilent色谱工作站 ), SZ - 97自动三重纯水蒸馏器 (上海亚荣生化仪器厂 ), KQ3200B型超声波
清洗器 (昆山市超声仪器有限公司), HH -4数显恒温水浴锅 (国华电器有限公司 ), SHB -B95型循环水式多用真
空泵 , AG204型万分之一电子天平 (瑞士梅特勒).
试剂:色谱纯甲醇 (山东禹王实业有限公司禹城化工厂 ),分析纯磷酸 (上海联合化工厂 ),分析纯无水乙醇 、
95 %乙醇(天津化学试剂有限公司),分析纯异丙醇(龙口市黄城化龙试剂分装厂),自制三重蒸馏水.对照品红景
天苷购自中国药品生物制品检定所(批号 818 - 200103).
材料:实验用大部红景天样品药材由青海省藏医药研究所提供 ,余满堂研究员鉴定.另有部分样品购自西宁
市药材公司 ,由青海师范大学生命与地理科学学院陈志教授鉴定.具体来源见表 1.其中 18、19号样品留作待鉴别
之用.
2　方法和结果
第 1期 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究 73　
2. 1　供试品溶液的制备
将经干燥过的红景天样品粉碎 ,过 40目筛后 ,精密称取其粉末约 1. 0g,加 20m l 50%甲醇溶液 , 30℃超声提取
1h,滤过 ,滤液用 50%甲醇溶液定容至 50m .l测定前用 0. 45μm的微孔滤膜滤过即得供试品溶液.
2. 2　对照品溶液的制备
精密称取红景天苷对照品 2. 5mg,置 10mL量瓶中 ,加甲醇适量 ,超声处理 10m in使完全溶解 ,放冷至室温后
加甲醇稀释至刻度制成每毫升含 0. 25mg红景天苷的溶液 ,摇匀即得.
2. 3　色谱条件
K romasil C18分析柱(4. 6mm ×250mm , 5μm);流动相:甲醇 (A) - 0. 04%磷酸水溶液 (B),按 A:B(6:94;18:
82;24:76)梯度洗脱;流速 1. 00mL /m in;进样量 5μL:紫外检测波长为 278nm;柱温为 30℃,采样时间 70 m in.
表 1　红景天药材样品的来源
样品编号 采样地点 样品名称 采样时间
1 青海玉树 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2003年 8月
2 青海海西 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2003年 8月
3 西藏昌都 高山红景天(Rhodio la a tropupurea) 2003年 8月
4 青海玉树 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2004年 8月
5 青海海南 唐古特红景天 (Rhodio la a lg ida) 2003年 8月
6 青海玉树 异齿红景天(Rhodio la heterodanta) 2003年 8月
7 青海大通 小从红景天(Rhodio la dum u losa) 2003年 8月
8 青海海南 唐古特红景天 (Rhodio la a lg ida) 2003年 8月
9 西藏昌都 大花红景天(Rhodio la c renu la ta) 2003年 8月
10 青海果洛 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2003年 8月
11 青海海西 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2003年 8月
12 青海海西 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2003年 8月
13 西藏林州 大花红景天(Rhodio la c renu la ta) 2004年 8月
14 西藏那曲 大花红景天(Rhodio la c renu la ta) 2003年 8月
15 西藏林州 大花红景天(Rhodio la c renu la ta) 2003年 8月
16 青海玉树 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2004年 8月
18 西藏林州 大花红景天(Rhodio la c renu la ta) 2003年 8月
19 青海玉树 狭叶红景天 (Rhodio la kirilow ii) 2004年 8月
2. 4　方法学考察
稳定性试验:精密称取干燥恒重的 1号批次样品(传统上认为该地产狭叶红景天品质佳 ,且又是红景天药材
的主流品种之一 [ 6] ,故列为对照药材),制备供试品溶液 ,分别于 0, 2, 4, 8, 12, 24小时测定 ,记录指纹图谱.以红景
天苷对照品色谱峰的保留时间及峰面积为参照 ,分别对指纹图谱中各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积
进行统计.结果表明 ,各色谱峰的相对保留时间 RSD不大于 0. 75%,相对峰面积 RSD为 0. 49 ～ 2. 45%, RSD不大
于 3%,说明供试品溶液在 24小时内稳定 ,符合指纹图谱研究的技术要求 [ 7] .
精密度试验:精密称取干燥恒重的 1号批次样品 ,制备供试品溶液 ,连续进样 5次 ,记录指纹图谱并分别对指
纹图谱中各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计.结果表明 ,各色谱峰的相对保留时间 RSD不大
于 3%,相对峰面积 RSD为 0. 02 ～ 2. 82%,说明该仪器系统的精密度较好 ,符合指纹图谱研究的技术要求.
重现性试验:精密称取干燥恒重的 1号批次样品 5份 ,制备供试品溶液 ,记录指纹图谱并分别对指纹图谱中
各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计 ,结果表明 ,各色谱峰的相对保留时间 RSD不大于 1. 40%,
相对峰面积 RSD为 0. 52 ～ 2. 72%, RSD小于 3%,符合指纹图谱研究的技术要求.
74　 西南民族大学学报 自然科学版 第 32卷
2. 5　红景天色谱指纹图谱的建立
按已优化的色谱条件 ,对 16批青藏高原不同产地的样品和待鉴别的 18、19号样品进行测试分析 ,所得的典
型色谱图(1号样品 )见图 1.以红景天苷对照品色谱峰的保留时间及峰面积为参照 ,求得各样品的相对保留值和
归一化 (相对 )面积.以 1号样品为对照药材 ,规定 1%以内的相对误差(相对保留值 )窗口进行匹配 ,分别对各指
纹图谱中共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积进行研究比较 ,在各样品间归纳确定了 13个共有峰作为基本
特征峰 (16批样品非共有峰面积平均小于总峰面积的 5 %),据此建立了由 13个峰(相对峰面积 )组成的红景天
的特征指纹谱(见表 2).
图 1　红景天样品色谱图
表 2　红景天的指纹图谱(13个峰的相对峰面积)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 0. 7104 19. 1384 1. 0750 0. 6071 1. 5788 1. 1522 1. 7299 1. 0000 20. 2024 0. 9138 1. 9518 1. 7047 2. 1411
2 0. 7705 15. 5130 1. 1995 0. 5265 1. 4830 1. 0910 1. 4558 1. 0000 13. 7760 0. 9251 2. 3270 2. 1001 2. 2599
3 0. 0000 10. 2886 0. 1797 0. 0838 1. 5592 1. 9926 2. 1410 1. 0000 3. 1543 0. 2522 0. 0000 0. 7975 0. 7276
4 0. 5042 19. 6865 1. 1243 0. 6324 1. 4355 1. 0798 1. 6233 1. 0000 19. 7763 0. 8516 2. 6702 0. 0000 1. 5099
5 2. 3693 93. 9954 9. 1185 3. 3389 3. 4660 1. 0663 3. 7213 1. 0000 44. 9804 4. 0156 2. 5240 1. 9586 3. 9401
6 3. 4991 186. 3995 8. 8072 6. 1371 7. 4868 2. 0855 6. 8583 1. 0000 129. 536 6. 7792 2. 4332 2. 6826 7. 3563
7 0. 5864 31. 7447 1. 0493 0. 6645 0. 9435 0. 8218 1. 5792 1. 0000 45. 7516 0. 6394 1. 0208 1. 6120 1. 6670
8 3. 9622 76. 6594 7. 8314 4. 1247 6. 5210 1. 9449 5. 1401 1. 0000 49. 8714 4. 9519 8. 5452 14. 6351 13. 4584
9 0. 3008 6. 0655 0. 4356 0. 0000 0. 3870 0. 8654 0. 5171 1. 0000 5. 4029 0. 1255 0. 6328 0. 2534 0. 6581
10 0. 1925 15. 6375 0. 4173 0. 0190 0. 3206 0. 5856 1. 3302 1. 0000 19. 5256 0. 0000 0. 5633 1. 3365 1. 8441
11 0. 5822 19. 0478 1. 2030 0. 6345 0. 7578 0. 3569 1. 6875 1. 0000 12. 4462 0. 6187 0. 9964 1. 6770 1. 2262
12 0. 1306 13. 6073 0. 1051 0. 0000 0. 2182 1. 3888 0. 8543 1. 0000 13. 2912 0. 1534 0. 0000 0. 0000 0. 0000
13 0. 2104 6. 2103 0. 3108 0. 0363 0. 0946 0. 3749 0. 5594 1. 0000 5. 6256 0. 2702 1. 4123 0. 6329 0. 6037
14 0. 0352 4. 8165 0. 0241 0. 1678 0. 4830 0. 2582 0. 6584 1. 0000 6. 2316 0. 2290 0. 0000 0. 0555 0. 1161
15 0. 0468 4. 7764 0. 0000 0. 1437 0. 4949 0. 3181 0. 6826 1. 0000 6. 2911 0. 2394 0. 3604 0. 0000 0. 0258
16 0. 5198 21. 5112 1. 1320 0. 5641 1. 4458 1. 1071 1. 6554 1. 0000 21. 1106 0. 8092 1. 4047 1. 3592 1. 8903
17 0. 5120 17. 3426 1. 0621 0. 5453 1. 1895 1. 0731 1. 6012 1. 0000 16. 6508 0. 6291 1. 2128 1. 3479 1. 5884
18 0. 0589 5.5342 0.0314 0. 0536 0. 0597 0. 2643 0.6751 1.0000 6. 0244 0. 2042 1.3132 0.0246 0. 1391
19 0. 0359 15.3529 0.000 0. 0297 1. 3994 1. 0793 1.4794 1.0000 13. 6428 0. 2140 0.0000 0.9871 1. 1572
第 1期 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究 75　
2. 6　指纹图谱的数据处理
2. 6. 1　重叠率
指纹图谱中色谱峰的重叠率 ,能够直观量化地反映两样品在化学组成方面的差异或相似性. 其计算公式如
下:重叠率 =[待测样品与标准样品共有的峰数 ×2 /(待测样品峰数 +标准样品峰数 )] ×100%.以狭叶红景天药
材 (1号样品)的指纹图谱作为基准 ,按重叠率公式分别计算出另外 15种样品以及待鉴别的 18、19号样品的重叠
率 ,其结果见表 3.
表 3　红景天药材重叠率(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19
100 80 66 87. 8 65. 7 62. 1 65. 6 64. 7 67. 7 85. 7 81. 2 82. 5 68. 7 68. 1 68. 3 86. 3 68. 8 86. 7
从重叠率可以看出 , 2、4、10、11、12、16号等样品与 1号样品的峰重叠率均大于 80%,说明这 7个样品在化学
组成方面有较高的相似性.它们都是狭叶红景天. 9、13、14、15号等样品与 1号样品的峰重叠率接近 70%,这 4个
样品都是大花红景天 ,在化学组成方面与 1号样品有一些差别 ,但仍可认为它们之间有较高的相似性.这样 ,上述
的 11个样品较高的重叠率 ,说明它们在化学组成方面有着较高的相似性 ,应用价值较高 ,是红景天的主流品种.
而 3、5、6、7、8号样的重叠率为 66%以下 ,它们分属高山 、唐古特 、异齿 、小丛红景天 ,与 1号样品相比在化学组成
方面存在着不小的差别 ,属于应用价值较低的品种.
2. 6. 2　红景天指纹图谱共有模式的建立
本实验研究的红景天样品品种较多 ,考虑到相似度分析中的稳定性 ,采用中位数矢量生成法建立共有模式 ,
结果见表 2倒数第三行(编号 17).
2. 6. 3　相似度分析
一般说来 ,中药指纹图谱相当复杂 ,用于样品鉴别时人工比较峰的多少和峰的大小不仅费时费力 ,而且往往
由于主观臆断 ,难免出差错 ,从而影响鉴别结果的准确性.指纹图谱反映的是样品整体的特征 ,所谓鉴别时进行指
纹图谱比较 ,即是要定量找出待鉴别样品与共有模式指纹图谱的亲疏程度 ,显然在将样品指纹图谱数据张成多维
空间矢量时 ,两矢量之间的距离 、夹角余弦以及相关系数等可以作为相似度分析中的测度指标 [ 8] .以共有模式作
为对照指纹图谱 ,其它的 16个样品与之比较 ,用我们自编的多元统计计算软件 [ 9] ,求得的欧氏距离 (dst)、夹角余
弦 (cosα)和相关系数(Rs t)见表 4. 根据两个 n维模式矢量夹角余弦或相关系数越大(越接近 1),或者两个 n维模
式矢量的欧氏距离越小 ,则它们越相似 ,由表 4可以看出 , 3、5、6(欧氏距离 ds t最大)、7、8、15等样品与共有模式的
相似度低一些 ,这与这些样品重叠率较低的情况是一致的.
表 4　相似度分析结果
No d st cosα R st No d st cosα R st No dst cosα R st
1 4. 1372 0. 9985 0. 9981 8 71. 5838 0. 9717 0. 9629 15 16. 5461 0. 9798 0. 9733
2 3. 7618 0. 9950 0. 9961 9 16. 0916 0. 9931 0. 9914 16 6. 1239 0. 9997 0. 9998
3 15. 3980 0. 8755 0. 8268 10 3. 7304 0. 9893 0. 9880
4 4. 3968 0. 9971 0. 9961 11 4. 6489 0. 9822 0. 9760 17 0. 0000 1. 0000 1. 0000
5 82. 3599 0. 9465 0. 9322 12 5. 8512 0. 9924 0. 9949
6 203. 8778 0. 9834 0. 9823 13 15. 8373 0. 9891 0. 9858 18 16. 1462 0. 9842 0. 9792
7 32. 4736 0. 9766 0. 9746 14 16. 5660 0. 9809 0. 9753 19 4. 0799 0. 9962 0. 9961
2. 6. 4　系统聚类分析
是一种无管理模式识别方法 ,利用表征观测对象的一组变量可以对样品进行分类 ,其具体算法可以参考有关
文献.应用于指纹图谱解析的思路是在对样本数据进行相似性测度的基础上 ,依据一定算法 ,如最短距离法(最近
76　 西南民族大学学报 自然科学版 第 32卷
相邻法 )、最长距离法 、重心法 、类平均法以及离差平方和(ward)法等 ,将一批待分类的样本分为若干类. 图 2划
出了 16个红景天样品与其共有模式 (17号 )以及 2个待鉴别的样品(18、19号)系统聚类结果 ,是以欧氏距离作
为样品的测度 ,采用离差平方和 (ward)法 ,应用MATLAB编程做出的. 从图中可以清楚地看出 , 16个红景天样品
可分为五类:3、9、13、14、15号为一类 ,主要为西藏产的大花红景天. 1、4、10、16、2、11、12号为第 2类 ,为青海省产
的狭叶红景天. 5、8号为第 3类 ,为青海省海南产的唐古特红景天. 6、7号分别为青海省玉树与大通产的异齿红景
天和小丛红景天.待鉴别的 18号样品与第一类聚为一类 ,因此可鉴别为西藏产的大花红景天;而待鉴别的 19号
样品与第二类聚为一类 ,应为青海省产的狭叶红景天.这些鉴别结果是与实际情况相符的.
图 2　红景天样品聚类谱系图
3　讨论
3. 1　指纹图谱中色谱峰的重叠率 ,能够直观量化地反映样品之间在化学组成方面的差异或相似性.可作为待鉴
别样品定性的初步依据.例如 , 2、4、10、11、12、16号等样品与 1号样品的峰重叠率均大于 80%,说明这 7个样品
(含 1号样 )在化学组成方面有较高的相似性. 它们都是狭叶红景天. 待鉴别的 18、19号样的重叠率分别为 68.
3%、86. 3%,均大于 66%以上 ,可以初步判定前者为西藏产的大花红景天 ,后者为青海省产的狭叶红景天.
3. 2　色谱指纹图谱应用于中药质量鉴别时对照指纹图谱的选取是重要的.因为相似度分析是以对照指纹图谱作
为比较标准的.一般来说共有模式比选择一个有典型意义的指纹图谱作为对照指纹图谱要更具代表性 ,因共有模
式代表或集中了一批同种属不同产地样品的共同特征 ,可直接用于待鉴样品的鉴别.本研究涉及的青藏高原红景
天药材不仅产地多样 ,而且品种也较复杂.除大花 、狭叶等主流红景天品种外 ,还有唐古特 、小丛 、异齿 、高山等非
主流红景天品种.考虑到个别样品的某些峰相对面积有离群情况存在 ,因此不采用均值矢量生成法而采用更为稳
健的中位数矢量生成法建立共有模式.
3. 3　色谱指纹图谱通过对各样品色谱图进行比较 ,反映其化学成分的差异 ,从而可以实现对药材的鉴别和质量
评价. 这一比较过程可以用包括各种距离 、夹角余弦和相关系数等相似性测度来表征. 在实际的指纹图谱相似度
计算中 ,要将所选取的所有色谱峰同时作比较计算 ,因而反映了指纹图谱的整体相似性 ,一般可对药材质量作出
较全面准确地评价.本次实验由相似度分析得出 3、5、6、7、8等样品与共有模式的相似度低一些 ,说明这些样品与
主流红景天品种在品质(化学成分)方面有较大的差异 ,这是与实际情况相符的. 待鉴别的 18、19号样品的相似度
(见表 4)分别与西藏产的大花红景天 、青海省产的狭叶红景天的相似度大小相当 ,因此可判定这两种红景天的归
属 ,这是与实际情况相符的.
3. 4　聚类分析能够揭示样品之间的关系 ,继而对样品进行分类和鉴别 ,从而能提供的指纹图谱信息比较多. 例如
第 1期 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究 77　
通过包含待鉴别样品 (18、19号 )在内的系统聚类分析 ,可以鉴别出待鉴别样品 18号为西藏产的大花红景天 , 19
号为青海省产的狭叶红景天.因此 ,系统聚类分析可作为中药指纹图谱应用于质量控制的补充 ,它将在中药材质
量控制综合评价分析中发挥作用.
4　结论
研究结果表明 ,依据国家关于指纹图谱研究的技术要求所建立的青藏高原红景天药材色谱指纹图谱 ,可应用
于青藏高原红景天药材的质量鉴别. 重叠率 、相似度分析 、聚类分析等综合数据处理分析简便可行 ,为不同品种红
景天及不同产地样品之间的鉴别提供了科学依据.
参考文献:
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Study on fingerprint of rhodiola rosea from the Q ingzang P lateau by high
performance liquid chromatography
WU Q i-xun, AN Yan , GAO Jing-Hong , LU Yong-chang , BAO J in-yuan, HU Shu-qing, YU Jun
(Depar tm en t o f Chem istry, Q ingha i Nationalites C ollege, Xining 810007, P. R. C)
Abstract:The ch roma tograph ic fingerprint o fRhodio la rosea from theQ ingzang Plateau is estab lished by high
pe rform ance liquid chrom atog raphy (HPLC). K romasil C18 [ 250mm ×4. 6mm 5μm ] co lumn is used, the
CH3OH - 0. 04% H 3 PO 4(grad ient e lu tion) as a mob ile phase and the f low speed o f 1. 00 mL /m in. The
w avelength of measu remen t is 278nm. A cco rding to the comparative study of chrom atog raphic finge rprin ts,
we find 13 communal peaks, which can be applied to identify Rhodiola rosea. U sing special softw are, we ge t
the chromatographic fingerprint sim ilarity of 16 samples, hierarchical clusters are app lied to interpre tate
chroma tog raphic fingerprints. The chrom atog raphic finge rprin t of Rhodio la ro sea has been estab lished. It can
be used to identify Rhodio la rosea. Them ethod o f this paper is he lp fu l to con tro l the quality of this herb.
Key words:high pe rfo rm ance liquid chromatography (HPLC);Rhodio la rosea;chromatog raphic fingerprin t;
sim ilarity;h ierarchical cluster