全 文 ：基金项目 张家界市科学技术局资助项目(04HT023)。
作者简介 王辉(1980-),男,湖南张家界人,助理工程师,从事园林植
物栽 培及园 林绿 化管 理工 作。*通 讯 作 者,E!mail:
tkhthlh@126.com。
鸣 谢 感谢吉首大学城乡资源与规划学院 2000级生物科学专业
陈旋等同学在TLC制备和分析方面的大力支持。
收稿日期 2007!03!13
黄酮类物质[1]是指具有 C6!C3!C6环式结构(母核)的酚
类化合物,是植物界中分布最广泛的一类成分。黄酮类物质
是一大类具有广泛开发前景的天然抗氧化剂资源物质[2],其
有明显的抗溃疡、消炎、抗菌、抗衰老、降血酯等生理活性,
可用作防治高血压及动脉血管硬化的辅助治疗。黄酮类物
质除主要用于医药工业外,在食品工业中也有广泛的应用。
黄酮类物质的提取,主要是根据其结构性质及伴存的杂质
来选择适合的溶剂,常用的提取方法有水提法、碱性稀醇提
取法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声提取法等[3];总
黄酮的含量测定主要有比色法、高效液相色谱法等[4-5]。
红檵木(LoropetalumChinensevar.rubrum)系白花檵木的
变种,为金缕梅科檵木属常绿或半落叶灌木,其野生种产于
湘东罗宵山脉腹地的浏阳与醴陵相交区域[6]。红檵木树姿优
美,一年内能多次开花,花叶艳丽夺目,观赏性极佳,是湖南
省十分珍贵的乡土观赏植物[7]。湖南省自1991年将“红檵木
开发利用技术研究”列为“八五”科技攻关项目以来,已经围
绕该资源植物开展了从栽培生理、育苗技术、组织培养、光合
特性与叶色素含量变化、品种的系统分类与分子甄别等[8-12]
较广泛的研究,在红檵木栽培品种的选育与分类系统等基
础研究方面已取得了一定的成果[9]。但作为湖南省独有的观
赏资源植物,其开发利用有待深化。笔者进行了3种类型栽
培红檵木品种[8](嫩叶红类、透骨红类、双面红类)的叶总黄
酮提取测定及花、叶色素的成分比较,以期为红檵木的开发
利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料及其处理 红檵木老叶、幼嫩叶均为2004年
5月采自吉首大学张家界校区内栽培的不同类型红檵木品
种。将采集的3种类型红檵木品种的嫩、老叶及花洗净,置
50℃烘箱内烘干,叶经粉碎并过 40目筛制得叶粉末样品,
备用;花则置干燥环境中贮藏,备用。
1.2 试剂 芦丁标样(药典版,纯度98%,西安恒生制药厂
提供),浓盐酸、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、甲醇、石油醚、乙
醇、正丁醇、乙酸乙酯等均为分析纯,分析纯硅胶G(青岛海
洋化工有限公司生产)。
1.3 主要仪器 岛津AEG!220分析天平,日本产SF!6索氏
提取器,医用离心机,日本产 RE540旋转蒸发仪,岛津 UV!
160A紫外可见分光光度计,紫外检测器等。
1.4 方法
1.4.1 总黄酮的提取与测定。
1.4.1.1 总黄酮提取。①索氏回流提取法[13]。称取干燥至恒
重的红檵木叶粉末5.000g→滤纸包好后放入索氏提取器虹
吸管内→抽提瓶中加入适当体积量的甲醇→60℃回流提取
3h→抽提液→抽提液浓缩后以石油醚∶抽提液为 1∶1体积
比进行数次萃取除脂→萃取液加入乙醇并使醇浓度在85%
以上,放置过夜以除去蛋白质及多糖→过滤、离心得滤液,
再旋转蒸发浓缩至小体积→转入容量瓶以 60%乙醇定容
至50ml→索氏法总黄酮样液。②碱提酸沉法[3]。称取干燥至
恒重的红檵木叶粉末2.000g→按叶粉末的15倍(W∶V=1∶15)
加饱和 Ca(OH)2上清液,40℃水浴提取 2h→过滤→滤液
酸化到pH值5→离心、取上清液→旋转蒸发仪浓缩至小体
积→转入容量瓶以60%乙醇定容至 50ml→碱提法总黄酮
样液。
1.4.1.2 总黄酮测定。①标准样品的制备。精密称取120℃
干燥至恒重的芦丁 25mg,60%乙醇热溶解后冷却并定容
至50ml,得浓度为0.5mg/ml的芦丁标准液,备用。②测定
波长的选择与标准曲线的制作[3-4,13]。精密量取1.0ml芦丁
标准液,加1.0ml5%NaNO2摇匀后放置6min左右,加1.0ml
10%Al(NO3)3摇匀后放置 6min左右,加 5.0ml1.5mol/L
3种类型红檵木叶总黄酮含量测定及花与叶红色素的TLC比较
王辉 1,赵虹桥 2,熊玉双 3,唐克华 4*,曾富民 4 (1.吉首大学张家界校区后勤办园林绿化部,湖南张家界 427000;2.吉首大学张家
界校区教务办,湖南张家界 427000;3.湖南省张家界市农业局,湖南张家界 427000;4.吉首大学城乡资源与规划学院,湖南张家界427000)
摘要 对3种类型红檵木的幼叶与老叶进行了总黄酮提取及分光光度比色法测定,并进行了嫩叶红红檵木品种的花和幼叶红色素
的硅胶G薄层层析(TLC)比较分析。结果表明:总黄酮含量以嫩叶红红檵木幼叶为最高,达1.02%;3类品种之间的总黄酮含量排序
是:嫩叶红幼叶>透骨红幼叶>双面红幼叶,嫩叶红老叶>双面红老叶>透骨红老叶。TLC分析结果表明:嫩叶红幼叶与花的红色素含有
相同的颜色成分。
关键词 红檵木;总黄酮;色素;叶;花;薄层层析
中图分类号 Q94!333 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)17-05132-03
DetectionofTotalFlavoneContentinLoropetalumchinensevar.rubrumLeavesandTLCComparisonofRedPigmentinFlowers
andLeaves
WANGHuietal(GreeningOficeofZhangjiajieCampus,JishouUniversity,Zhangjiajie,Hunan427000)
Abstract TotalflavoneinyoungleavesandoldleavesofthreetypesofLoropetalumchinensevar.rubrumwasextractedanddetectedby
spectrophotometer.Redpigmentinflowersandyoungleaveswereanalyzedbythin!layerchromatography(TLC).Resultshowedthattotalflavone
contentinyoungleaveswashighest(1.02%).TotalflavonecontentinthethreetypesofLoropetalumchinensevar.rubrumwasyoungleavesof
Nenyehong>Touguhong>ShuangmianhongandoldleavesofNenyehong>Shuangmianhong>Touguhong,respectively.TLCanalysisresult
showedthatredpigmentinyoungleavesandflowersofNenyehonghadalmostthesamecolorcomponent.
Keywords Loropetalumchinensevar.rubrum;Totalflavone;Pigment;Leaves;Flowers;Thin!layerchromatography
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(17):5132-5134 责任编辑 金琼琼 责任校对 王 淼
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.17.053
NaOH放置10min,再加60%乙醇定容至10.0ml,摇匀,显色
10min后,进行200~600nm扫描,测定最大光吸收波长。精
密量取芦丁标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,参照波长测定
中显色程序操作,测定各显色液在最大吸收波长下的吸光
度值。以各显色液的吸光度为横坐标X,对应的芦丁浓度为
纵坐标Y,计算得芦丁浓度-吸光度直线回归方程并制作标
准曲线图。③样品的测定。准确量取索氏法、碱提法总黄酮
样液各1.0ml,按照芦丁标准曲线制作的显色程序各取3份
进行平行测定,以测得的最大光吸收下的吸光度值,代入标
准曲线方程计算出样液中总黄酮含量。
1.4.1.3 总黄酮提取测定的方法学验证[14-15]。对采用的总黄酮
提取、显色及分光光度测定方法进行精密度与准确度验证。
1.4.2 叶与花红色素的提取及TLC比较[11]。
1.4.2.1 提取。称取红檵木叶粉末样各10.000g、干花5.000
g,均按重量体积比=1∶15加 20%乙醇浸提 4h,再用中火力
档微波处理5min,过滤后得色素粗提液,粗提液在 50℃下
减压浓缩至 1/4体积,再 4000r/min离心 20min,取离心的
上清液进行 3步萃取,除杂质后得红色素精制样液,备用。
1.4.2.2 TLC比较。①薄板制作与点样。按文献数据自制
20cm×20cm硅胶 G板;用毛细管点样器取红色素精制样
液在距薄板下缘端1cm位置分别点样,每次点样量为10~20
μl,点样时注意控制样斑直径在 0.5cm以内,晾干、展层试
剂饱和后放入展层剂中展开,待展开到距薄板前沿约 1cm
处时停止展层,用直尺量出各色素斑点成分到原点的距离
并计算出其Rf值。②检测。对非颜色成分以紫外检测器进
行检测,观察其有无及所处位置,标出位置后再测算其Rf值。
2 结果与分析
2.1 3种类型红檵木品种的幼叶、老叶总黄酮含量
2.1.1 测定波长选择及标准曲线制作。对芦丁标准液进行
显色后扫描测定,得其所显红色的对应最大光吸收峰为510nm。
依据试验方法,测定各浓度芦丁标准液的吸光度,得到的浓
度-吸光度直线回归方程是:Y=0.8708X-0.0142,其相关系
数R2=0.9993,对应的标准曲线见图1。
2.1.2 3种类型红檵木品种的幼叶、老叶总黄酮含量。不同
方法提取的3种类型红檵木品种的幼叶、老叶总黄酮含量
测定与计算的结果见表1。由表1可知,红檵木嫩叶红类型
的幼叶及老叶总黄酮含量比其他2类型品种高,各类型幼
叶的总黄酮含量均比老叶高。3种类型红檵木品种,幼叶的
总黄酮含量排序为:嫩叶红>透骨红>双面红,而老叶中总黄
酮含量排序为:嫩叶红>双面红>透骨红。
将嫩叶红品种的2种叶进行索氏回流提取法与碱提酸
沉法总黄酮提取结果比较,初步推断以索氏回流提取法效
果为佳。
2.1.3 提取测定方法的可靠性。
2.1.3.1 精密度。精确称量嫩叶红红檵木的幼叶干粉10.00g
各5份,采用索氏法提取总黄酮和制备样液,然后测定该样
液显色后的吸光值,以直线回归方程计算出样液和叶中总
黄酮含量,结果见表2。由表2可见,5次提取测定的叶平均
总黄酮含量为 1.101%,相对标准偏差(RSD)为 0.80%,该
结果反映以索氏回流提取法及 510nm显色测定红檵木总
黄酮的方法精密度好。
2.1.3.2 准确度。准确称取嫩叶红红檵木的幼叶干粉10.00g
各5份,编号,并在进行索氏法提取前依次加入浓度为 0.5
mg/ml的芦丁标准液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml,制备的样液定
容处理和显色测定均按标准曲线制作的操作方法,测定加
标准物质的提取回收率,结果见表 3。由表 3可见,采用的
总黄酮索氏回流法提取及510nm显色、分光光度测定,其
方法的加标样平均回收率为 100.3%,相对标准偏差(RSD)
为1.48%,说明该方法准确度高。
2.2 花与叶红色素的薄层层析(TLC)比较分析 表4是嫩
叶红红檵木的花、叶红色素TLC比较分析结果。由表 4可
见,萃取精制的花色素液中的层析斑点与幼叶的红色素斑
点成分 Rf十分接近,都有明显的红、蓝、紫色斑点;相比较
而言,老叶的红色素萃取精制液,其斑点的层析展开不好,
色彩斑点在可见光下不明显,在紫外检测器下也只显相对
于花色素萃取液颜色较深的蓝色斑点,推测可能是因为嫩
叶红老叶呈粉绿色,估计其红色素成分较少。
红檵木类型
索氏法叶总
黄酮含量∥%
碱提法叶总
黄酮含量∥%
嫩叶红幼叶 1.190 1.185 1.189 1.188 1.02 0.359 0.344 0.348 0.346 0.72
嫩叶红老叶 0.644 0.649 0.657 0.646 0.55 0.203 0.207 0.212 0.205 0.41
透骨红幼叶 1.143 1.160 1.156 1.158 0.99 - - - - -
透骨红老叶 0.412 0.404 0.402 0.403 0.34 - - - - -
双面红幼叶 1.059 1.084 1.082 1.083 0.93 - - - - -
双面红老叶 0.559 0.551 0.533 0.555 0.47 - - - - -
索氏法样液A值
A1 A2 A3 平均
碱提法样液A值
A1 A2 A3 平均
表1 不同方法提取的3种红檵木品种叶总黄酮测定结果
样号 样品重∥g叶总黄酮含量∥% 平均含量∥% RSD∥%
1 10.001 1.101
2 10.003 1.105
3 10.004 1.120 1.101 0.8
4 10.001 1.088
5 10.003 1.093
表2 叶总黄酮提取测定方法的精密度
测定
编号
样品固有总
黄酮∥mg
样品加芦丁
量∥mg
测得总黄
酮∥mg
回收率
%
平均回
收率∥%
RSD
%
1 1.020 0.050 1.069 99.7
2 1.020 0.100 1.121 101.2
3 1.020 0.150 1.168 98.9 100.3 1.48
4 1.020 0.200 1.218 99.1
5 1.020 0.250 1.276 102.4
表3 叶总黄酮提取测定方法的准确度
王 辉等 3种类型红檵木叶总黄酮含量测定及花与叶红色素的TLC比较35卷17期 5133
3 小结与讨论
(1)3种类型红檵木幼叶和老叶的总黄酮提取测定结
果表明:嫩叶红类型的红檵木幼叶总黄酮含量最高,嫩叶红
红檵木幼叶及老叶的总黄酮含量均比其他 2类红檵木高。
从 3种类型的红檵木幼叶和老叶总黄酮含量排序来看,存
在一种对立性规律,这可能与研究时采集的材料遗传性状
尚未稳定有关,但就其总黄酮含量而言,嫩叶红类红檵木品
种极有可能是较为原始的品种[8],而透骨红与双面红品种选
育上的先后差别尚难判定,这也正是当前对红檵木品种需
要进行科学分类和选育[9]的重要因素。
(2)红檵木嫩叶型的幼叶与花红色素的硅胶 G薄层层
析分析结果表明:两者的组成成分可能基本相同。至于花和
幼叶的红色素,是否主要是黄酮类[11]成分目前还不能明确
判定。但基本可以肯定,叶的红色素与花的红色素有相互可
替代的性质,这对于红檵木修剪的枝条在色素方面的进一
步开发利用是有利的。
限于经费等研究条件,关于花、叶红色素的成分及其功
能研究有待于进一步深入。
参考文献
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色斑序号 花红色素颜色 Rf花 嫩叶红色素颜色 Rf叶
1 紫红 0.31 蓝紫 0.30
2 鲜红 0.35 鲜红 0.35
3 蓝绿 0.39 蓝绿 0.40
4 鲜红 0.42 淡红 0.43
5 红色 0.46 红色 0.48
6 淡紫 0.50 紫红 0.53
表4 嫩叶红花与幼叶红色素层析的紫外光下色斑及其Rf值
(上接第5098页)
进一步研究微胚乳超高油玉米株高和穗位高的遗传提供
参考。
从2个组合株高和穗位高的样本分布来看,均呈偏态
或多峰分布,表现出主基因特征,但用主基因+多基因混合
遗传模型进行分离分析,结果表明并非 2个组合的株高和
穗位高都存在主基因,即出现了样本分布分析和多世代联
合分离分析不一致的情况。这表明应用该研究方法可以发
掘出被微效多基因和环境变异掩盖的遗传信息,即多基因
控制的性状,多个基因的效应有大有小,并不是彼此相等;
确切的判断还要依赖于分离世代分离分析方法。
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安徽农业科学 2007年
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