全 文 ：第 11 期 刘广友，等:准立方体纳米 α-Fe2O3 的制备及光催化活性研究
第 26 卷第 11 期
2014 年 11 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol． 26，No． 11
Nov．，2014
文章编号:1004-1656(2014)11-1751-07
垂丝海棠叶多糖的超声提取及其抗氧化性质研究
卫 强* ，徐 彪，徐 飞，邱 镇，纪小影
(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)
摘要:在单因素实验的基础上，采用 Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法，研究提取时间、超声波功率、
液料比对垂丝海棠叶多糖含量的影响，建立影响因素与响应值之间的数学模型，确立最佳提取工艺为:提取时
间 20 min，液料比 45 ∶ 1，超声波功率 135W。抗氧化实验结果表明，在达到最大浓度 0. 74mg·mL－1时，垂丝海
棠叶多糖(超声)、垂丝海棠叶多糖(煮沸)和 Vc的对 DPPH的清除率依次为 79. 9%，69. 7%，64. 8%，垂丝海
棠叶多糖(超声)和垂丝海棠叶多糖(煮沸)对·OH 自由基的清除率分别为60. 1%、51. 2%，垂丝海棠叶多糖
(超声)还原 Fe3+能力较强。
关键词:垂丝海棠叶;多糖;响应面;超声提取;抗氧化
中图分类号:O629. 12 文献标志码:A
Study on ultrasonic extraction process of polysaccharides and antioxidant
activities from the leaves of malus halliana koehne
WEI Qiang* ，XU Biao，XU Fei，QIU Zhen，JI Xiao-ying
(Pharmacology college，Anhui XinHua University，Hefei 230088，China)
Abstract:According to single-factor experiments，Box-Behnken design and its response surface analysis，main factors that affectaed
the polysaccharides yield from the leaves in Malus halliana koehne such as extraction time，ultrasonic power，liquid-material ratio
were studied to find the optimal process. The best extraction process was as follows:liquid-material ratio was 45 ∶ 1，extracting 20
min by 135W power of ultrasound. According to the results of antioxidant activities，the DPPH scavenging activities of polysaccha-
rides extracted by ultrasound，polysaccharides extracted by boiling method and vitamin C was respectively 79. 9%，69. 7%，64. 8%
when concentration of the polysaccharides reached the 0. 74mg·mL－1. Scavenging activities of free radical·OH of the polysaccha-
rides extracted by ultrasound and boiling method was respectively 60. 1% and 51. 2% . Meanwhile，the polysaccharides from ultra-
sonic extraction revealed their better Fe3+ reduction activities.
Key words:leaves of malus halliana koehne;polysaccharides;response surface methodology;ultrasonic extraction;antioxidant
人类各种疾病中，90%以上起源于活性氧和
氧化应激而体内过多的氧自由基则对人体健康有
破坏行为，可导致人体正常细胞和组织的损伤，引
起多种疾病，如炎症、辐射损伤、肿瘤、帕金森病、
老年痴呆症和心脏病等［1-2］。多糖具有抗肿瘤［3］、
保护肝脏［4］、抗炎［5］、抗辐射［6］、免疫调节［7］、降血
糖［8］等药理作用，而抗氧化作用是多糖抗衰老、抑
肿瘤、降血脂、降血糖的作用机制之一［9］。
观赏海棠(Malus spp. )指蔷薇科苹果属中果
实直径小于 5cm，具有观赏价值的品种。垂丝海
收稿日期:2014-05-30;修回日期:2014-07-11
基金项目:安徽省大学生创新创业训练项目(AH201312216001)资助;安徽省质量工程项目(2013gxk105)资助;安徽新华学院质量工程项
目(2013gxkcx01)资助
联系人简介:卫强(1977－) ，男，副教授，主要从事天然活性产物研究。E－mail:weiqiang509@ sina. com.
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
棠(Malus halliana koehne)为“海棠四品”之一，为
常用园林景观植物［10］。垂丝海棠在我国民间多用
于跌打损伤、骨折和出血的治疗［11］。现代研究表
明，垂丝海棠果实提取物中多酚、黄酮类成分具有
较强的抗氧化作用。本文对垂丝海棠叶中多糖类
成分进行提取工艺研究和抗氧化活性研究，以期
为其产品开发奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
垂丝海棠叶采自合肥翡翠湖地区，经安徽新
华学院庆兆副教授鉴定为蔷薇科苹果属垂丝海棠
(Malus halliana koehne)的茎上叶。葡萄糖、1，1-
二苯基-2-三硝基苯肼、铁氰化钾、三氯乙酸、水杨
酸、三氯化铁、苯酚等试剂均为分析纯，水为纯化
水。
1. 2 仪器与设备
TD4K-Z台式低速离心机(济南福的机械有限
公司) ;KJ-SY-150 超声提取器(北京同德创业科技
有限公司) ;UV-5100 型紫外可见分光光度计(上
海元析仪器有限公司)。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 提取工艺 垂丝海棠叶→低温烘干，粉碎
成粗粉，称取 5g→90%乙醇超声 2 次，70%乙醇超
声 3 次→抽滤，弃去滤液，残渣加水超声提取→浓
缩→离心→Sevag法除蛋白→粗多糖→测定含量
1. 3. 2 提取方式 单因素实验选取不同的超声
波功率、提取时间、水与垂丝海棠叶质量比(简称
液料比，g /g)、浸泡时间进行考察，再以 Box-Be-
hnken中心组合实验设计进行提取实验。
1. 3. 3 多糖含量测定 精密称取葡萄糖标准品
1g，以水溶解定容于 50mL 容量瓶中。精密吸取
0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 2、1. 4mL 的葡萄糖标准液于
25mL具塞试管中，加水至 2. 0mL，再分别加入
1. 0mL 5%苯酚溶液和 5mL 浓 H2SO4，室温放置
5min，再于沸水浴中恒温 15min。取出，迅速置于
冰水中维持 10min。取 2. 0mL 水为参比，同上操
作，于 490nm 波长下测定吸收度。以吸收度(A)
为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标(μg·mL－1)绘制
标准曲线，计算含量［13］。
1. 3. 4 多糖含量计算 多糖含量(mg·g－1)=粗多
糖质量 /垂丝海棠叶质量
1. 3. 5 清除DPPH自由基能力 精密称定0. 0384g
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) ，甲醇溶解并定
容于 500mL容量瓶，得浓度为 0. 2mmol·mL－1的 DP-
PH溶液，冰箱 4℃冷藏，备用。
分别精密称定维生素 C(Vc)、垂丝海棠叶多
糖(超声)和垂丝海棠叶多糖(煮沸)各 0. 02g，以
50%乙醇溶解，定容至 25mL，再稀释至不同浓度
(mg·mL－1) ，分别取 1mL 稀释液，加入 1mL 上述
DPPH溶液，以 50%乙醇为空白，室温暗光反应
30min，于 517nm 波长下测定吸收度，其清除率
(SA1)计算公式
［14］:
SA1 = 1－
Aa －Ab
A0( ) ×100%
其中:Aa 为样品溶液吸收度;Ab 为空白组吸
收度;A0 为对照组吸收度。
1. 3. 6 还原 Fe3+能力-普鲁士兰法 取 10mL 具
塞比色管，依次加入不同浓度的 Vc、垂丝海棠叶多
糖(超声)和垂丝海棠叶多糖(煮沸)溶液各
1. 5mL，再加入 1. 5mL磷酸盐缓冲液(浓度 0. 2mol
·L－1，pH6. 6)和 2mL1%的铁氰化钾，混匀，水浴
(50℃)维持反应 20min，加入 2. 0mL10% 三氯乙
酸，混匀后离心 10min(2 500r·min－1) ，取上清液
1. 0mL，加水 1. 0mL 和 1% 的三氯化铁溶液
0. 5mL，以空白试剂为参比，在 700nm 波长下测定
吸收度［15］。
1. 3. 7 清除·OH自由基能力 原理:H2O2 与 Fe
2+
产生·OH，·OH 反应活性高，可与水杨酸反应产
生有色物质。其反应式如下:
H2O2+Fe
2+→Fe2+ +·OH+OH－
保持反应时间不变，取相同体积的反应体系
溶液(8. 8mmol·L－1 H2O2 1mL，9mmol·L
－1 Fe2+
1mL，9mmol·L－1水杨酸乙醇溶液 1mL) ，加入不同
浓度的 Vc、垂丝海棠叶多糖(超声)和垂丝海棠叶
多糖(煮沸)溶液各 1. 5mL，以水为参比，以空白试
剂为比较，于 510nm波长处测定吸收度值，以下列
公式［14］计算清除率(SA2)
SA2 =
A0 －Ax
A0( ) ×100%
其中:Ax 表示样品溶液吸收度值;A0 表示空
白对照组吸收度值。
2571
第 11 期 卫 强，等:垂丝海棠叶多糖的超声提取及其抗氧化性质研究
1. 3. 8 数据统计 采用 Design-Expert 8. 0. 6 统计软
件对提取工艺进行实验设计和分析。以 SPSS17. 0软
件分析抗氧化研究结果，以 Cochran＆Cox 近似 t检验
进行组间比较。
2 结果与分析
2. 1 单因素实验
2. 1. 1 提取时间对多糖含量的影响 如图 1 所
示。固定液料比为 30 ∶1，超声波功率为 90W，研究
不同提取时间(5、10、20、30、40、50min)对垂丝海
棠叶多糖含量的影响，结果以提取 20-40min 时多
糖含量较高。
图 1 提取时间对多糖含量的影响
Fig. 1 Effect of extracting time on the
extraction rate of polysaccharide
2. 1. 2 液料比对多糖含量的影响 如图 2 所示。
固定提取时间 20min，超声波功率为 90W，研究不
同液料比对多糖含量的影响。结果液料比(9 ∶1，
18 ∶1，27 ∶1，36 ∶1，45 ∶1，54 ∶1，g /g)为 27 ∶1-45 ∶1时
相对含量较高。
图 2 液料比对多糖含量的影响
Fig. 2 Effect of the ratio between solvent and material
on the extraction rate of polysaccharide
2. 1. 3 超声波功率对多糖含量的影响 如图 3
所示。固定液料比为 45 ∶1，提取时间 20min，研究
不同超声波功率(35，90，135，180，235，280W)对
多糖含量的影响，结果以超声波功率为 90-180W
时多糖含量较高。
图 3 超声波功率对多糖含量的影响
Fig. 3 Effect of ultrasonic power on the
extraction rate of polysaccharide
2. 2 响应面分析
2. 2. 1 Box-Behnken 因素水平设计 结果见表 1
所示。
表 1 Box-Behnken实验因素与水平表
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
水平
提取时间
(A，min)
液料比
(B，g /g)
超声波功率
(C，W)
－1 20 27 90
0 30 36 135
1 40 45 180
由 Box-Behnken中心实验设计，在单因素实验
基础上选取提取时间(A)、液料比(B)、超声波功
率(C)三个因素考察进行响应面分析，其因素、水
平见表 1。
2. 2. 2 实验设计与结果 以 A、B、C 为自变量，
以垂丝海棠叶多糖含量为响应值，实验结果见表
2。以 Design-Expert 8. 0. 6 统计软件对实验结果进
行多元回归拟合，见表 3。
表 2 响应面分析设计及实验结果
Table 2 Ｒesponse surface methodology and the
results of the experiments
实验号
编码水平
A B C
多糖含量
/mg·g－1
1 －1 0 1 13. 2
2 －1 －1 0 13. 6
3 1 0 1 16. 7
4 －1 0 －1 15. 9
5 1 －1 0 16. 5
6 0 0 0 17. 0
7 0 1 －1 15. 5
8 0 1 1 15. 9
9 1 0 －1 15. 2
10 0 －1 －1 16. 1
11 0 －1 0 14. 9
12 －1 1 0 14. 8
13 0 0 0 16. 9
14 0 0 0 16. 9
15 0 0 0 15. 4
16 0 0 0 17. 2
17 0 0 0 16. 8
3571
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
表 3 回归分析结果
Table 3 The results of variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P＞F 显著性
A 4. 961 25 1 4. 961 25 188. 231 7 ＜0. 000 1 ＊＊
B 0. 031 25 1 0. 031 25 1. 185 637 0. 312 3
C 0. 50 1 0. 50 18. 970 19 0. 003 3 ＊＊
AB 1. 322 5 1 1. 322 5 50. 176 15 0. 000 2 ＊＊
AC 4. 41 1 4. 41 167. 317 1 ＜0. 000 1 ＊＊
BC 0. 64 1 0. 64 24. 281 84 0. 001 7 ＊＊
A2 5. 258 132 1 5. 258 132 199. 495 5 ＜0. 000 1 ＊＊
B2 2. 480 237 1 2. 480 237 94. 101 13 ＜0. 000 1 ＊＊
C2 1. 478 132 1 1. 478 132 56. 080 87 0. 000 1 ＊＊
模型 0. 184 5 7 0. 026 357
失拟项 0. 093 3 0. 031 1. 34 0. 379 5
总误差 22. 25 16
＊＊表示极显著水平(P＜0. 01)
由表 3 可知，提取时间(A) ，提取时间(A)、液
料比(B)、超声波功率(C)三个因素交互项及其二
次项的 P 值均小于 0. 01，说明对多糖含量的影响
极显著，显示本实验中单因素和交互因素均对多
糖含量有显著性影响。经检验，该模型的相关系
数 γ = 0. 991 7，说明自变量与响应值线性关系显
著，回归方程如下:
Ｒ1 = 16. 96+0. 79A+0. 063B－0. 25C－0. 58AB+1. 05AC+0. 40BC－1. 12A
2－0. 77B2－0. 59C2
a 提取时间与液料比
a Extracting time and the ratio between solvent and material
b 提取时间与超声波功率
b Surface plot of extracting time and ultrasonic power
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第 11 期 卫 强，等:垂丝海棠叶多糖的超声提取及其抗氧化性质研究
c 液料比与超声波功率
c Ultrasonic power and the ratio between solvent and material
图 4 各两因素交互作用影响垂丝海棠叶多糖提取的响应曲面和等高线图
Fig. 4 Ｒesponse surface and contour plots for the interactions on the extraction yield
of polysaccharide from the leaves of Malus halliana koehne
根据回归分析结果，作出相应曲面图，如图 4
所示。三组图直观地反映了各因素对响应值的影
响。响应面图是响应值 Y对应于实验因素 A、B、C
所构成的三维空间曲面图及其在二维平面上的等
高线图，响应面可直观反映三个因素之间及两者
之间的交互作用对响应值的影响。等高线的形状
可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交
互作用显著，而圆形则与之相反。结合表 3 的 P
检验值，由图 4a 可知，液料比和提取时间交互作
用为极显著水平(P＜0. 01) ，等高线椭圆形;当超
声波功率固定，随着液料比和提取时间的增加，多
糖含量呈现先快速提高后缓慢减小的趋势。从等
高线上看，提取时间在 35min，液料比在 30 ∶1附近
值对提高含量有重要影响。由图 4b 可知，超声波
功率和提取时间交互作用为极极显著水平(P ＜
0. 01) ，等高线椭圆形;当液料比固定，随着超声波
功率和提取时间的增加，多糖含量呈现先缓慢提
高后缓慢减小的趋势，超声波功率过分加大对多
糖含量呈现较大负面影响。从等高线上看，超声
波功率在 135W，提取时间 30min 附近值对提高含
量有重要影响。由图 4c 可知，超声波功率和液料
比交互作用为极显著水平(P＜0. 01) ，等高线椭圆
形;当提取时间固定，随着超声波功率和液料比两
个因素的增加，多糖含量呈现先缓慢提高后缓慢
减小的趋势，且两个因素对多糖含量的影响较为
均衡。表明在超声波功率 135W，液料比 36 ∶1附近
取值对多糖含量影响相对较小。
2. 2. 3 验证性实验 根据实验模型拟合出垂丝海
棠叶多糖提取最优工艺参数为:提取时间 20min，液
料比 45 ∶1，超声波功率 135W，多糖含量理论值为
16. 96mg·g－1。以此工艺进行验证实验，结果垂丝海
棠叶多糖 3次平均含量为 16. 89mg·g－1(n=3，ＲSD=
1. 18%) ，与理论预测值接近，证明实验模型设计合
理。
2. 3 抗氧化活性测定及比较
2. 3. 1 提取工艺 为了验证工艺的优越性，分别
精密称取药材 5g 两份，一份以水煮沸提取 3 次
(第一次 2h，第二次 1h，第三次 0. 5h)。另一份以
2. 2. 3 项下工艺进行提取，提取 3 次(第一次
30min，第二次 15min，第三次 15min) ，分别得到水
煮沸法提取多糖［以下简称“垂丝海棠叶多糖(煮
沸)”］和超声法提取多糖［以下简称“垂丝海棠叶
多糖(超声)”］，经 1. 3. 1 项下进行纯化，测定含
量，结果见表 4。
表 4 两种提取方法下的垂丝海棠叶多糖含量比较(n=3)
Table 4 Comparison of polysaccharides yield in two
different extracting methods(n=3)
方法 提取次数和时间
多糖含量
(mg·g－1，X ±SD)
煮沸法提取 3 次(2、1、0. 5 h) 30. 57±0. 38
超声波提取 3 次(30、15、15 min) 42. 89±0. 42
由表 4 可知，垂丝海棠叶多糖以超声波提取 3
次，其含量为 42. 89mg·g－1，与传统的水煮沸法提
取相比，显示省时、高效的优点。
2. 3. 2 对 DPPH的自由基清除能力 建立对 DP-
PH的自由基清除率与浓度的回归方程，根据回归
方程计算清除率 50%时的样品浓度，结果见表 5。
5571
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
表 5 垂丝海棠叶多糖对 DPPH的自由基清除能力
Table 5 DPPH scavenging activity of polysaccharide from the leaves of malus halliana koehne
样品 回归方程 Ｒ2 DPPHIC50(mg·mL
－1，X ±SD，n=5)
垂丝海棠叶多糖(超声) Y=109. 7X－3. 365 Ｒ2 = 0. 986 0. 486±0. 036△△b
垂丝海棠叶多糖(煮沸) Y=96. 29X－2. 828 Ｒ2 = 0. 974 0. 549±0. 022
Vc Y=79. 75X+4. 608 Ｒ2 = 0. 975 0. 569±0. 016
注:垂丝海棠叶多糖(超声)与 Vc相比，bP＜0. 01;垂丝海棠叶多糖(超声)与垂丝海棠叶多糖(煮沸)比较，△△P＜0. 05
由图 5 可知，随着垂丝海棠叶多糖和 Vc浓度
的增加，对 DPPH 的自由基清除率逐步增强。当
达到最大浓度 0. 74mg·mL－1时，垂丝海棠叶多糖
(超声)、垂丝海棠叶多糖(煮沸)和 Vc的对 DPPH
的清除率依次为 79. 9%，69. 7%，64. 8%。从清除
率高低看，垂丝海棠叶多糖(超声)最高，垂丝海棠
叶多糖(煮沸)和 Vc次之。
图 5 垂丝海棠叶多糖对 DPPH的自由基清除能力
Fig. 5 DPPH scavenging activity of polysaccharide from
the leaves of Malus halliana koehne
2. 3. 3 还原 Fe3+能力 结果见图 6 所示。
图 6 垂丝海棠叶多糖还原 Fe3+能力
Fig. 6 Fe3+ reduction activity of polysaccharide
from the leaves of Malus halliana koehne
由图 6 可知，当达到最大浓度 0. 74mg·mL－1
时，垂丝海棠叶多糖(超声)和垂丝海棠叶多糖(煮
沸)的还原 Fe3 吸收度分别为 0. 619、0. 517，说明
垂丝海棠叶多糖(超声)较垂丝海棠叶多糖(煮
沸)具有更高的 Fe3 还原能力。
2. 3. 4 清除·OH自由基能力 结果见图7所示。
图 7 垂丝海棠叶多糖清除·OH自由基能力
Fig. 7 ·OH scavenging activity of polysaccharide
from the leaves of Malus halliana koehne
由图7可看出，随着垂丝海棠叶多糖浓度的增
加，清除·OH自由基能力也逐步增强，在达到最大
浓度 0. 74mg·mL－1时，垂丝海棠叶多糖(超声)、垂
丝海棠叶多糖(煮沸)对·OH自由基的清除率依次
为60. 1%，51. 2%，说明垂丝海棠叶多糖(超声)较
垂丝海棠叶多糖(煮沸)具有更高的清除·OH自由
基能力。
3 结 论
超声波提取主要利用超声波的空化作用、热
效应和机械作用而完成的，具有提取效率高、溶剂
用量少、不破坏成分等优点［15-16］。本实验以超声
波提取垂丝海棠叶中多糖，通过单因素实验确定
优化因素，通过 Box-Behnken 中心组合实验结果，
软件模拟出最佳工艺为:提取时间 20min，液料比
45 ∶1，超声波功率 135W，1 次提取后的平均多糖含
量为 16. 89mg·g－1，3 次(30、15、15 min)提取后的
平均多糖含量为 42. 89 mg·g－1，比 3 次煮沸(2、1、
0. 5 h)提取的多糖含量高出 40. 3%。抗氧化实验
表明，当达到最大浓度 0. 74mg·mL－1时，垂丝海棠
6571
第 11 期 卫 强，等:垂丝海棠叶多糖的超声提取及其抗氧化性质研究
叶多糖(超声)、垂丝海棠叶多糖(煮沸)对 DPPH
的自由基清除率依次为 79. 9%，69. 7%，对·OH自
由基的清除率依次为60. 1%，51. 2%，还原 Fe3 吸
收度分别为 0. 619、0. 517，结果表明超声提取可明
显增强垂丝海棠叶多糖的抗氧化活性，这可能与
超声提取产生的温度低，对多糖成分破坏小，而煮
沸为高温提取，改变了多糖的分子结构和性质有
关。
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( 责任编辑 罗 娟)
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