全 文 ：中西医结合肝病杂志 1 99 3年第 3卷第 1期
垂 盆 草 对 小 鼠 和 大 氛肝 胜 脂 质
过 氧裕 损 拐 的 防 护 作 用
中国医学科学院药物研究所 ( 1 0 0 0 5 0) 薛继艳 魏怀玲 刘耕陶
握要 本实验观察了垂盆草水提物对急性酒清中毒所致小鼠肝脏脂质过氧化损伤的影响 ,同
时又观察了垂盆草水提物对氧自由基损伤的作用 。 结果表明 , 口服垂盆草 ( 1 0哪kg ) ,无论是给药 3
次还是 1 次均能明显 防止酒精所致小鼠肝脏谷耽普肤 ( G SH )的耗竭及脂质过氧化产物丙二醛
( M D A )的生成 。 垂盆草与大鼠肝徽粒体体外温孵 ,对 N A DP H一vit C 所致微粒体脂质过载化和
eP 纤一半脆氮酸 (卿 )所致大鼠肝细胞的脂质过氧化损伤亦具有显著的防护作用 。 表明该药可保护肝
细胞免受脂质过载化损伤 。
关妞词 垂盆草 酒精 行脆昔肚 实验性肝损伤 丙二醛 过氧化脂质 动物实验
垂盆草 ( s七d u m s ar m en t二m B助 , ,为我 式会社产品 。 胰岛素为丹麦 dN va nI du 咐娜 :
国浙江地区常用 民间草药 , 早已用于急性肝 公司产品 。 其余试剂均为国产分析纯产品 。
炎 ,迁延性肝炎的治疗 。药理实验表明该药有 二 、方法
降低四氯化碳中毒大鼠血清谷丙转氨酶的作 1 . 肝微粒体的制备 , 按照 址以级 p川法 ,先
用 。 巳知四锐化碳损伤肝脏的机理是由于形 将大鼠禁食过夜 。 取肝脏前先用冰冷的生理
成三氛甲基自由基 ,导致肝脏脂质过氧化 l3[ , 盐水从门静脉灌洗肝脏至土色 ,然后用 0 . IM
由此联想垂盆草可能具有抗脂质过氧化活 磷酸缓冲液 (P H一 7 . 4) 制备肝匀浆 . 先在 日
性 。 因此我们观察了垂盆草水提物 (以下简称 立高速冷冻离心机上以 1 0 , 0 0 g0 X Z o m in 离
垂盆草 )对急性酒精中毒所致小鼠肝脏脂质 去线粒体及细胞碎片 , 然后再进行超速离心 ,
过氧化损伤 、 对 N A D p H一 vi t C 所致大鼠肝 1 05 , 0 0 g0 X 6 0m in ,沉淀部分即为微粒体 。 将
微粒体脂质过氧化及对 eF +2 — 半耽氨酸 微粒体重悬于 0 . IM 磷酸缓冲液 中 ,保存于所致大鼠肝细胞脂质过氧化损伤的影响 。 今 一 30 ℃ , 一周 内 使 用 , 蛋 白浓 度用 L o w yr
将结果报告如下 。 o H[ 3〕法测定 。
材料与方法 2 . 肝脏 G S H 的测定 : 肝脏 G S H 含量按
一 、材料 lE lm an GL 闭法测定 。 取 0 . 5而 10 %肝匀浆 ,
1
. 动物 : 昆明种小白鼠 ,体重 2 2 9 ~ 2 59 . 加 入 0 . 5m 1 4%磺 基 水 扬酸 沉 淀 , 然 后
w ist
e r 雄性大鼠 ,体重 2 5 0 9一 3 0 0 5 。 均 由中国 3 0 0 0 r pm 低温离心 1 0 分钟 , 取上清液 0 . s m l
医学科学院动物中心提供 。 加入 0 . 4%显色剂 D T N B , 室温放置 10 分钟
2
. 药品与试剂 : 垂盆草水提物 由上海静 后 ,在 41 2n m 处测定 。 D 值 。
安中药厂提供 , 临 用时用蒸馏水配制成 5口 3 . 肝脏 M D A 的测定 : 肝脏 MD A 含量按
ml 溶液 。 5 , 5, 一二硫一 2一硝基苯甲酸〔5, 5 ’ uB e罗 JA[ 幻法测定 。 取 10 %肝匀浆 l ml 加入
一 D i th of b is ( 2一 iNt r o be nz of c A ic d〕和还原型辅 20 %三氛醋酸 lml 沉淀蛋白 ,于 30 0 r pm 离
酶 百 ( N A D p H )为 S i g m a 产品 。 L一半胧氨酸 心 1 0 分钟 ,取 l m l 上清液加入 l m l 0 . 6 7%硫
购自 M er ck 公司 。 R p M I一 1 6 4 0 为日本制药株 代巴 比妥酸 ,于 10 0℃沸水浴煮 15 分钟 , 冷
中西医结合肝病杂志 1 99 3年第 3卷第 1期
却后于 5 2 3unl 处测定 。 D 值 。
结 果
一 , 垂盆草对酒精所致小鼠肝脏脂质过
氧化损伤的防护作用 : 将小白鼠随机分成 6
组 ,每组 8 只 。其中两个给药组提前一天以垂
盆草灌胃二次 ,剂量分别为 5 9 / kg 及 1 0 9 / ks 。
对照组给同等量的蒸馏水 。 然后将各组动物
禁食过夜 ,在给酒精前 1小时再分别 口服给
药 1 次 。 另外两组小鼠于禁食过夜后和给酒
精前 1 小时以垂盆草灌胃 1次 ,剂量同上 。 给
酒精 6 小时后断头处死 , 用 0 . IM 磷酸缓冲
液 (P H ~ 7 . 4) 制备 10 %肝匀浆 (低温 ) 。 以测
定肝脏 G sH 及 M D A 的含量 。 实验结果表明 ,
小 鼠口服酒精 6 小时后 ,肝脏 G s H 含量较正
常对照组明显下降 ,而脂质过氧化产物 M D A
含量明显上升 ,表明肝脏有脂质过氧化损伤 。
口服垂盆草 1 次后 , 大剂量组 ( 1 09 / kg 能明
显升高急性酒精中毒所致小鼠肝脏 G s H 含
量 ,并能阻抑肝脏 M D A 含量的升高 , 而 5 5/
kg 组则无明显作用 。 口服垂盆草 3 次 , 则两
个剂量组均对小鼠肝脏 G S H 的降低及 M D A
的生成有明显抑制作用 。 结果见表 1 。
表 1 垂盆草对小吸急性酒精中毒所致肝脏脂质
过妞化扭伤的保护作用 (每组 8 只小民 )
0
.
05 m M
。
37 ℃温孵 30 分钟后 , 加入 20 %三
氯醋酸 0 . 5m l , 3 0 0 0r mP 离心 10 分钟后 , 取
l ml 上清液测定 M D A 含量 。 结果表明 ,垂盆
草具有显著的抗脂质过氧化作用 , 加入垂盆
草组 M D A 生成 明显减少 , 且呈剂量效应关
系 (见表 2 ) 。
裹 2 垂盆草对 NDA P H一vit c 所致大皿肝像
粒体脂质过级化的形响
(农中 M人D 数值为 4 个平行苍之均位 )
M D A 玩 hi切 it o n组别 (
~ m/
g 蛋白士 sD ) (% )
N A D P H
一 V i t C
垂盆草 12 5 阳
6 5 阳
3 2
.
5 卜盈g
13
.
0 9士 0 . 69
7
.
7 1士 0 . 1 0 - -
1 0
.
2 4士 0 . 3 7 赞
1 1
.
9 3士 0 . 2 9
4 1
。
1
2 1
.
8
8
.
88
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6 6 4
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5 2 4
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.
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7 4 5
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O士 . 4. 0 . 书 -
8 6 0 0士 1 22 . 0 - - -
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2丁. 52士 1 2 . 4
1 7
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1 4
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0 2士 3. 8 5 .
1 3
.
3 2士 9. 5 6 - -
: 9 6士 3. 8 5二均同酒精对邢祖比骊 i 去 P蔺 O用亏而 石币之 O丁百r es we -… P < 0 . 0 0 1二 、 垂盆草对 N A D p H 一 v it C 所致大鼠
肝微粒体脂质过氧化的防护作用 , l m l 反应
混合物中含肝微粒体蛋白 l m g , 然后加入不
同剂量的垂盆草 ( 1 2 5u g /而 , 6 5u s /m l 及 3 2 .
su s /由1 ) , 预 温 孵 15 分 钟 后 , 加 入 适 量
N A D p H 及 v it C ,使终浓度分别为 0 . Zm M 及
均同 N A D沪H一 : c 组比较 , 二 P < 0 . 01 , * < 0 . 05
一 : . 垂盆草对 eF 抖一半脆氨酸所致新鲜
分离的大鼠肝细胞脂质过氧化损伤的防护作
用 ,在 se l , n[ 幻方法的基础上稍加改变 ,采用
胶原酶两步灌流法以分离大鼠肝细胞 , 存活
率 90 %以上 。 以 l x l沪 个细胞 /而 R p M I一
16 4 0 培养液 (含胰岛素 0 . Zu /m l ) ,加于 2 4 孔
培养板小孔 内 , 在 95 % 0 2 及 5写co : 、 37 ℃的
条件下培养 , 预培养 1 小时后 , 分别加入
l o o u g
、
s o u g 及 2 5 u s 垂盆草共同培养 l 小时 ,
然后再加 FeS O ; 及半脱氨酸 ,终浓度为 5 0“ M
及 20 0娜 。 结果如表 3 所示 ,在肝细胞培养过
程中加入 eF +2 一半耽氨酸 1小时后 , 培养液
中 G rP 及 M D A 含量明显上升 , 若在 eF +2 一
半胧氨酸损伤前加垂盆草预培养 1 小时 , 则
能明显抑制 eF Z + 一半胧氨酸所致大 鼠肝细
胞 G盯 的释放和 M D A 的生成 ,且呈剂量效
应关系 。 而垂盆草本身对正常大鼠肝细胞
G p T 和 M D A 基本上无影响 。 结果见表 3
四 、肝细胞扫描电镜观察结果表明 ,正常
肝细胞呈圆形 ,表面微绒毛细腻 , 分布均匀 。
而用 eF Z +一半脱氨酸损伤后 , 约 80 %肝细胞
形态出现明显改变 ,细胞不规则 ,表面绒毛脱
落 ,周边绒毛大部分融合成层状突起 。预先用
中西医结合肝病杂志 1 9 9 3年第 3卷第 1期
表 3 垂盆草对 Fe 抖一半脱组酸 (ycs )所致新鲜分离的大鼠肝细胞脂质过级化的防御作用 (每组 4个平行管 )
组别
G S H 释放
(Ul 八 0 0川士 S D )
士土正常肝细胞
肝细胞 + 10 0阳垂盆草
F e Z+
一 e y s
肝细胞十 10 0阳垂盆草 + Fe Z+ 一 yc s
肝细胞十 50 阳垂盆草+ Fe Z+ ~ 仁 y s
肝细胞 + 25 阳垂盆草 + 氏 2十 一 ycs
3
.
5 1
3
。
5 4
4
.
4 9
3
.
7 6
3
.
9 4
4
.
3 7
0
.
2 4 赞 赞
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.
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份 资 璐
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3 2
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. 川 / 1 0 0闪士 S D )
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9 7 士 0 . 4 1…4 . 9 7 士 0 . 4 8 - 一 赞
均同介 2+ 一卿 s 损伤组相比较 ,一 , p < 0 . 0 1 ; , p < 0 . 0 2 ,
1 0 咚 垂盆草保护后 , 再用 同等量 eF ,十一半
肌氨酸损伤 1 小时 , 则绝大部分肝细胞形态
保持正常圆形 ,表面绒毛规则 ,分布均匀 。
讨 论
文献报道 〔卜幻 , 大鼠长 期以用酒精或急
性酒精中毒会导致肝脏损伤 , 其担布机制之
一是通过激活氧分子 ,导致肝脏脂质过氧化
所致 。 而体内依赖于谷胧着肤的抗氧化系统
在抵抗 乙醇所致肝脏损伤中起着关键的作
用 9j[ 。 谷脱普肤除了能同 自由基直接反应外 ,
它还是依赖于硒及不依赖于硒的两种谷肤普
肤过氧化酶的共同底物 l0[ 〕 , 而这两种酶能够
还原已经生成的有机轻过氧化物 。 本研究结
果表明 ,小鼠口服大剂量乙醇后 ,肝脏谷肤 一作
肤含量明显下降 , 脂质过氧化产物丙二醛的
含量明显上升 。 预先 口服垂盆草则能阻抑肝
内谷胧普肤的减少及 M D A 的升高 。
大鼠肝微粒体与垂盆草在体外温孵一定
时间后 ,对 N A D p H一 v it C 自由基生成系统
引起的 脂质过氧化有 明显抑制作用 。 垂盆草
对 氏 , + — 半胧氨酸所致大鼠肝 细胞脂质过氧化损伤同样具有明显的防护作用 , 生化
指标及电镜形态的检查结果完全平行一致 。
体内与体外的实验结果提示垂盆草对肝细胞
的脂质过氧化损伤有防护作用 , 这对临床应
用有参考意义 。 因临床用于治疗肝炎病人的
垂盆草制剂就是本实验中所用的粗制剂 。 至
铃 资 P < 0
.
0 5
。
于此粗制剂中那种成份具有这种抗氧化作用
还待进一步研究。
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G lu at t h fo n e ; M
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( o r iig n a l ar t i e l e o n 件郎 14 )
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K e y w or d : H e P a t it i s B v i r u s ; e a n t ig e n sy st
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资任编辑 :湛怡孙