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辣木叶中多酚提取的工艺研究
沈 慧,陶宁萍* ,赵林敏,梅梦瑶
(上海海洋大学食品学院,上海 201306)
收稿日期:2016-02-23
作者简介:沈慧(1992-) ,女,硕士研究生,研究方向:辣木多酚的研究,E-mail:514833410@ qq.com。
* 通讯作者:陶宁萍(1968-) ,女,教授,研究方向:食品营养与品质评价,E-mail:nptao@ shou.edu.cn。
基金项目:国家科技支撑计划(2015BAD17B01)。
摘 要:本论文采用热浸提法,以食用酒精为溶剂,考察酒精度数、液料比、D-异抗坏血酸钠用量、提取温度和提取时
间对辣木叶多酚提取率的影响,并在单因素实验的基础上,通过响应面实验分析,优化了辣木叶多酚的提取工艺。结
果表明,辣木叶多酚的最优提取工艺条件:食用酒精度数为 64% vol,液料比为 20∶ 1(mL·g -1),D-异抗坏血酸钠添加量
为 0.15‰,提取温度为 64 ℃,提取时间为 115 min,在此条件下多酚的得率为 3.39%。
关键词:辣木叶,多酚,酒精,提取
Extraction technology of polyphenol from Moringa oleifera leaves
SHEN Hui,TAO Ning-ping* ,ZHAO Lin-min,MEI Meng-yao
(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)
Abstract:In order to study the extraction technology of polyphenol from Moringa leave,alcohol was used as the
solvent,effects of the extraction conditions,namely alcohol concentration,alcohol solution /Moringa leaves ratio,
extraction temperature,extraction time and amount of D-sodium erythorbate on the extraction rate of polyphenol
were investigated.And then the first 4 factors were chosen for optimization of the extraction conditions by means of
response surface methodology combined with Box - Behnken experimental design based on the single factor
experiments.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:the concentration of alcohol
was 64%vol,alcohol solution / the Moringa leaves ratio was 20∶ 1(mL·g - 1),the dosage of D- sodium erythorbate
was 0.15‰,the extraction temperature was 64 ℃,the extraction time was 115 min.The yield of polyphenol was
3.39% .
Key words:Moringa oleifera leaves;polyphenol;alcohol;ectraction
中图分类号:TS202.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002-0306(2016)18-0287-06
doi:10. 13386 / j. issn1002 - 0306. 2016. 18. 046
辣木(Moringa oleifera) ,分类学属为植物界
(Plantage) ,种子植物门(Spermatophyta) ,双子叶植
物纲(Dicotyledoneae),白花菜目(Brassicales) ,辣木
科(Moringaceae) ,辣木属(Moringa Adans) ,乔木种
(Arbor)。辣木原产于印度,由于辣木的叶、籽、根和花
均能食用,主要用于增进营养与食疗保健,因而被誉为
“神奇之树”[1]。我国于 20 世纪 60 年代引入,2012 年
11月我国卫生部发布公告批准辣木叶为新食品原料,
这使得辣木叶在国内具有一定的发展前景[2]。
辣木叶富含各类维生素和矿物质成分,K 含量
很高,远高于 Na 的含量,适合高血压患者食用。除
此以外,辣木叶还有许多医学效用,如消炎抑菌、降
血糖、降血压、抗肿瘤、抗氧化等,其主要功效成分是
多酚,并且辣木叶中多酚含量较高,具有很好的利用
价值[3-4]。
目前,国内对于辣木叶的研究主要集中在蛋白
质、多糖和黄酮的研究,对多酚提取的研究较少,并
且已有的提取多采用工业乙醇、甲醇等有机试剂作
为提取溶剂,提取后的提取液不可用于相关食品的
生产[2]。本研究以辣木叶为原料,以食用酒精为载
体,采用热浸提方法,在单因素实验的基础上,利用
Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法对提取
工艺进行优化,确定最佳工艺条件,以期为工业化提
取辣木叶多酚提供适宜的工艺参数,得到的辣木叶
酒精提取液可用于辣木酒的相关研究。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
辣木叶粉 云南辣木叶粉(水分含量 10.91 g /
100 g湿样) ,由上海中福集团有限公司提供;没食子
酸、福林酚试剂、碳酸钠 国药集团化学试剂有限公
司;95%食用酒精 等级为 GB10343-2008 中的优
级,上海铨泽实业有限公司;D-异抗坏血酸钠 食品
添加剂,江西省德兴市百勤异 VC 钠有限公司;蒸馏
水等。
288
HWS24 型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限
公司;UV2300 紫外分光光度计 麦仪科学仪器(上
海)有限公司;TG16-WS 台式高速离心机 湖南湘
仪离心机仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的绘制 准确称量 10 mg没食子酸,
用蒸馏水定容至 100 mL,配置成 0.1 mg /mL 的没食
子酸水溶液。
具体操作根据文献[5-6]做适当的修改:精确吸取
0.1 mg /mL 的没食子酸标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0 mL,分别置于 20 mL 的比色管中,加蒸馏水
至 1 mL,再加 1.5 mL福林酚试剂,3 mL 75 g /L 碳酸
钠试剂,加水定容至 10 mL后放置反应 2 h。
用样品管在 600~900 nm 范围内扫描波长,得到
扫描曲线,确定多酚的测定波长为 752 nm。
以 0 管作空白,在 752 nm处测定吸光值,以没食
子酸标准品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,得到多
酚标准曲线方程:y = 99.357x-0.01538,相关系数 R2
= 0.9992,其线性关系良好。
1.2.2 辣木叶多酚的提取、测定及得率的计算 准
确称取一定量的辣木叶粉,以食用酒精于一定温度
下进行浸提,提取后离心,得到绿色浸提液。
精确量取 0.02 mL提取液于 20 mL的比色管中,
加蒸馏水至 1 mL,再加 1.5 mL 福林酚试剂,3 mL
75 g /L碳酸钠试剂,加水定容至 10 mL 后放置反应
2 h后,于 752 nm处用紫外-可见分光光度计测定其
吸光值。
辣木叶多酚的得率按以下公式计算:
多酚得率(%)= cvm × 100
其中:c:提取液中多酚的含量,mg /mL;v:提取液
体积,mL;m:称取的辣木叶粉量,mg。
1.2.3 单因素实验 采用 1.2.2 中方法提取辣木叶多
酚,提取条件为:固定反应条件为 1 g 辣木叶粉,按液
料比 10∶ 1(mL·g -1),常温(20~26 ℃)浸提 30 min,期
间每隔 10 min 振摇 1 min,考察不同酒精度(55%、
60%、65%、70%、75% vol)对多酚得率的影响[7-8];固
定反应条件为 1 g辣木叶粉,加入 65% vol 的酒精溶
液,常温(20~26 ℃)浸提 30 min,期间每隔 10 min振
摇 1 min,考察不同液料比(10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25 ∶ 1、
30∶ 1 mL·g -1)对多酚得率的影响[9];固定反应条件为
1 g辣木叶粉,按液料比 20∶ 1(mL·g -1)加入 65% vol
的酒精溶液,常温(20~26 ℃)浸提 30 min,期间每隔
10 min振摇 1 min,根据 GB 2760-2014 食品安全国
家标准食品添加剂使用标准[10],D-异抗坏血酸钠的
最大添加量为 0.15‰,进行添加量的筛选,考察不同
添加 量 (0.03‰、0.06‰、0.09‰、0.12‰、0.15‰、
0.18‰)对辣木叶多酚得率的影响,并进一步测定多
酚稳定性;固定反应条件为 1 g 辣木叶粉,按液料比
20∶ 1(mL·g -1)加入 65% vol 的酒精溶液,D-异抗坏
血酸钠的添加量为 0.15‰,浸提 30 min,期间每隔
10 min振摇 1 min,考察提取温度(35、45、55、65、
75 ℃)对多酚得率的影响[11];固定反应条件为 1 g 辣
木叶粉,按液料比 20∶ 1(mL·g -1)加入 65% vol 的酒
精溶液,D-异抗坏血酸钠的添加量为 0.15‰于 65 ℃
浸提,期间每隔 10 min 振摇 1 min,考察提取时间
(30、60、90、120、150 min)对辣木叶多酚得率的影响。
1.2.4 Box-Benhnken中心组合实验设计 在单因素
实验的基础上,选取影响较大的四个因素,每个因素
选取三个对多酚得率影响较大的水平,建立四因素
三水平的 Box-Benhnken 中心组合实验,以多酚得率
为响应值,各因素的三个水平采用-1、0、1 进行编码,
如表 1。
表 1 响应曲面设计实验因素水平和编码
Table 1 Independent variables and their levels used
in the response surface design
因素
水平
- 1 0 1
A酒精度数(%vol) 60 65 70
B液料比(mL·g -1) 15∶ 1 20∶ 1 25∶ 1
C提取温度(℃) 55 65 75
D提取时间(min) 90 120 150
1.3 数据处理
利用 Design-Expert 8.0.6Trial 软件绘制曲线,用
Excel 7.0 进行数据分析,并用 SPSS2.0 软件进行显著
性分析。
2 结果与讨论
2.1 单因素对多酚得率的影响
2.1.1 酒精度数对多酚得率的影响 由图 1 可知,辣
木叶多酚得率随着酒精度数的增大呈先增大再减小的
趋势。这是由于多酚是多种化合物的混合物,包括各
类苷类物质等,这些物质的极性和化学结构不同,在不
同酒精度中的溶解度也不同。因此,确定提取辣木多
酚的最佳酒精度数为 65% vol。这与陈瑞娇等[8]对辣
木叶总黄酮提取确定的 70%的乙醇溶液相类似。
图 1 酒精度数对辣木叶多酚得率的影响
Fig.1 Influence of concentration of alcohol
on yield of Moringa leaf polyphenols
注:字母不同代表存在显著性差异(p < 0.05),图 2~图 6 同。
2.1.2 液料比对多酚得率的影响 图 2 显示多酚得
率随液料比的增加先增大再减少。溶剂用量太少,
导致多酚提取不完全,得率低;而用量过多会增加成
本,对后续步骤带来不便,并且会由于辣木叶粉中一
些其他物质如多糖溶出,影响了多酚的提取分离,导
致多酚得率减少。在液料比为 20∶ 1(mL·g -1)时多酚
的得率最高,因此选择液料比 20∶ 1(mL·g -1)。
289
图 2 液料比对辣木叶多酚得率的影响
Fig.2 Influence of ratio of solution of alcohol
to Moringa leaves on yield of Moringa leaf polyphenols
2.1.3 D-异抗坏血酸钠用量对多酚得率的影响 酚
类物质由于含有两个或两个以上的酚羟基,因而极易
被氧化。D-异抗坏血酸钠属于还原剂,能够将多酚氧
化酶中的 Cu2 +还原成 Cu +,还可将多酚氧化酶反应中
生成的醌还原成酚,阻止醌的进一步氧化。因此,可以
通过添加 D-异抗坏血酸钠保护多酚。由图 3 可以看
出,当抗氧剂添加量为 0.15‰时,效果较好。
图 3 D-异抗坏血酸钠添加量对辣木叶多酚得率的影响
Fig.3 Influence of the amount of D-sodium erythorbate
on yield of Moringa leaf polyphenols
进一步测定多酚的稳定性,结果如图 4 所示:
图 4 多酚稳定性的研究
Fig.4 The stability of Moringa leaf polyphenols
由图 4 可知,未加入抗氧化剂时随着时间延长
多酚得率会出现显著性下降,而加入 0.15‰的 D-异
抗坏血酸钠后多酚稳定性增强。
2.1.4 提取温度对多酚得率的影响 当提取温度小
于 65 ℃时,辣木多酚的得率随温度的升高而增加;
当温度大于 65 ℃时,辣木多酚的得率随温度的升高
而降低。升温加强了辣木多酚的溶解扩散作用,加
快了其溶出的速度,但温度过高一方面会对辣木多
酚产生氧化破坏,另一方面酒精挥发导致酒精度数
降低,降低了多酚的得率,因而在 65 ℃以后得率逐
渐减少。因此,确定最佳的提取温度为 65 ℃。
图 5 提取温度对辣木叶多酚得率的影响
Fig.5 Influence of extraction temperature
on yield of Moringa leaf polyphenols
2.1.5 提取时间对多酚得率的影响 提取时间对多
酚得率有较大的影响。提取时间过短,导致多酚未
能被完全溶解出来,提取不彻底。因此,延长提取时
间可以大大提高多酚的得率。然而,提取时间过长,
会造成辣木中的其它物质在热效应的作用下也被提
取出来,影响提取液中多酚的含量,并且长时间受热
会加速酚类物质与氧气反应不利于提取。
图 6 提取时间对辣木叶多酚得率的影响
Fig.6 Influence of extraction time
on yield of Moringa leaf polyphenols
由图 6 可知,当提取时间小于 120 min 时,多酚
得率随时间的延长提高;当提取时间超过 120 min
时,多酚得率减少。因此,辣木多酚的最佳提取时间
为 120 min。
2.2 辣木叶多酚提取工艺优化
根据单因素各实验结果,采用 Box-Benhnken 进
行实验因素设计,实验方案及结果如表 2 所示:
对表 2 中数据进行多元二次回归分析得到各个
因素与响应值的回归方程:
Y = 3.37 - 0.086A + 0.083B - 0.12C - 0.14D +
0.062AB- 0.023AC - 0.033AD - 0.030BC + 0.005BD -
0.17CD-0.12A2 -0.52B2 -0.44C2 -0.38D2
回归模型的 R2 = 0.9996,为进一步验证回归模型
的准确性,对实验数据和方程进行方差分析,其分析
结果如表 3 所示,从表 3 可知模型对多酚得率值的影
响显著(F = 2834.69,p < 0.0001 < 0.05)即实验所采用
的二次模型是合理的,在统计学上是有意义的。而
方程的失拟项小,差异性不显著(p = 0.0990 > 0.05)
290
表 2 Box-Behnken实验设计方案与结果
Table 2 Box-Behnken imental design and results
实验号 A B C D Y多酚得率(%) 实验号 A B C D Y多酚得率(%)
1 - 1 - 1 0 0 2.79 16 0 1 1 0 2.33
2 1 - 1 0 0 2.50 17 - 1 0 - 1 0 3.00
3 0 1 0 0 2.83 18 1 0 - 1 0 2.87
4 1 1 0 0 2.79 19 - 1 0 1 0 2.79
5 0 0 - 1 - 1 2.64 20 1 0 1 0 2.57
6 0 0 1 - 1 2.74 21 0 - 1 0 - 1 2.53
7 0 0 - 1 1 2.69 22 0 1 0 - 1 2.27
8 0 0 1 1 2.11 23 0 - 1 0 1 2.23
9 - 1 0 0 - 1 3.05 24 0 1 0 1 2.42
10 1 0 0 - 1 2.94 25 0 0 0 0 3.37
11 - 1 0 0 1 2.85 26 0 0 0 0 3.38
12 1 0 0 1 2.61 27 0 0 0 0 3.37
13 0 - 1 - 1 0 2.42 28 0 0 0 0 3.37
14 0 0 - 1 0 2.63 29 0 0 0 0 3.38
15 0 - 1 1 0 2.24
表 3 响应面回归方程的方差分析
Table 3 Analysis of variance of fitted regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 3.9 14 0.26 2834.69 < 0.0001 **
A 0.088 1 0.088 949.65 < 0.0001 **
B 0.082 1 0.082 877.33 < 0.0001 **
C 0.18 1 0.18 1934.31 < 0.0001 **
D 0.24 1 0.24 2556.61 < 0.0001 **
AB 0.016 1 0.016 167.84 < 0.0001 **
AC 2.025E-003 1 2.025E-003 21.75 0.0004 **
AD 4.225E-003 1 4.225E-003 45.38 < 0.0001 **
BC 3.600E-003 1 3.600E-003 38.67 < 0.0001 **
BD 1.000E-004 1 1.000E-004 1.07 0.3176 --
CD 0.12 1 0.082 19.21 < 0.0001 **
A2 0.10 1 0.11 25.48 < 0.0001 **
B2 1.77 1 1.57 369.65 < 0.0001 **
C2 1.28 1 1.23 290.25 < 0.0001 **
D2 0.96 1 0.88 207.43 < 0.0001 **
残差 1.303E-003 14 9.310E-005
失拟项 1.183E-003 10 1.183E-004 3.94 0.0990 --
纯误差 1.200E-004 4 3.000E-005
总和 3.70 28
注:“-”表示不显著(p > 0.05) ;“**”表示极显著(p < 0.01)。
表明回归模型与实验拟合程度好,有利于模型,因此
可以利用该模型预测多酚得率代替实际实验点对实
验进行结果分析。由表 3 可知,酒精度数、液料比、
提取温度、提取时间四种因素均对响应值多酚得率
的影响极显著(p < 0.01),AB、AC、AD、BC、CD 的 p
值均小于 0.05,而 BD 的 p 值为 0.3176 大于 0.05,说
明酒精度数与液料比、酒精度数与温度、酒精度数与
时间、液料比与温度、温度与时间之间对响应值交互
作用极显著(p < 0.01),而料液比和时间对响应值交
互作用不显著(p > 0.05)。
根据拟合函数的预测值可做出任意两个因素对
响应值影响的三维响应面图,从模型的三维响应面
图可以直观的反应因素对响应值的影响。图 7a~f分
别为酒精度数和液料比对多酚得率的影响、酒精度
数和提取温度对多酚得率的影响、酒精度数和提取
时间对多酚得率的影响、液料比和提取温度对多酚
得率的影响以及提取温度和提取时间对多酚得率的
影响,从图 7a~f可知当其他因素浓度在 0 水平,其中
一个因素浓度在一定水平时,多酚得率随着另外一
个因素浓度的增加先上升后下降。图 7e反应的是液
料比和提取时间对多酚得率的影响。结合各响应面
的等高线分析可以说明酒精度数和液料比之间交互
291
图 7 提取条件对辣木叶多酚得率的响应面图
Fig.7 Response surface of extraction conditions yield of Moringa leaf polyphenols evaluation
作用显著,酒精度数和提取温度之间交互作用显著,
酒精度数和提取时间之间交互作用显著,液料比和
提取温度之间交互作用显著,提取温度和提取时间
之间交互作用显著,而液料比和提取时间之间交互
作用较弱,这与表 3 中的分析相一致。
通过对响应面分析和对回归方程求导,可得到酒
精度数、液料比、提取温度、提取时间的最佳条件为:酒
精度数 63.63% vol、液料比 20.20∶ 1(mL·g -1)、提取温
度 63.64 ℃、提取时间 115.20 min,在此条件下模型的
预测响应值(多酚得率)为:3.41%。鉴于实验操作可
行性选择酒精度数 64%vol,液料比 20∶ 1(mL·g -1),提
取温度 64 ℃,提取时间 115 min进行验证实验。
在最佳修正条件下进行 3 组平行验证性实验,
所得辣木提取液的多酚得率为 3.39%± 0.04%。说明
该模型能够较好地预测实际多酚的得率。
3 结论
通过研究发现,食用酒精浸提辣木叶多酚切实
有效。酒精度数、料液比、提取温度、提取时间对辣
木叶多酚的提取都有不同程度的影响。通过响应面
优化并调整辣木叶多酚的最佳提取工艺条件为:酒
精度数 64% vol,液料比 20∶ 1(mL·g -1),D-异抗坏血
酸钠添加量 0.15‰,提取温度 64 ℃,提取时间
115 min,在此条件下多酚的得率为 3.39%;所制得的
辣木提取液可进一步用于辣木酒的研发。
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(下转第 296 页)
296
从图 5(b)看出,随着料液比和加酶量的变化,Y
值都有所变化,但相对于加酶量对 Y 值变化,Y 值沿
料液比方向变化幅度较大,等高线接近圆形,加酶量
与料液比交互作用较弱,料液比等高线曲线较密集,
而加酶量等高线曲线较稀疏,表现为相对于加酶量
对 Y值的影响,料液比对 Y的影响较显著。
从图 5(c)可看出,随着浸提液 pH 的变化,Y 值
先增大后减小,变化幅度较大,曲线较为陡峭,而随
着加酶量的变化 Y 值也有所变化,但是变化幅度相
比于浸提液 pH较小,曲线较平缓,浸提液 pH与加酶
量的交互作用较强,表现为浸提液 pH对响应值 Y的
影响较显著,而加酶量对 Y值影响相对较小。
2.3.3 最优工艺条件的预测及验证 Design-Expert
V8.0.6 对数据进行分析预测得:因素影响大小顺序
为:浸提液 pH >料液比 >加酶量;响应值 Y 的最佳
工艺参数为:料液比 1 ∶ 2.02、浸提液 pH5.49、加酶量
1.00%,此条件下预测 Y 值为 8.8748,粗多糖得率为
0.92%,多糖含量为 9.75%。根据实际实验的可操作
性,将工艺参数修正为:料液比 1∶ 2、浸提液 pH5.5、加
酶量 1.00%,在此条件下进行验证实验得到粗多糖
得率为 0.91%,多糖含量为 9.8%,与理论值相比,相
对误差为 0.4%,与模型值接近,优化结果可靠。
3 结论
通过单因素实验和 Box-Behnken 实验设计以料
液比、浸提液 pH、加酶量为三因素,Y 为响应值,对南
海鸢乌贼墨汁多糖的提取进行优化,得出鸢乌贼墨多
糖的最佳提取工艺参数为:料液比 1∶ 2、浸提液 pH5.5、
加酶量 1.00%,此条件下粗多糖得率为 0.91%,多糖含
量为 9.8%,采用响应面法优化鸢乌贼墨多糖提取工
艺,取得最佳提取工艺,且具有可行性。
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