全 文 ：收稿日期:2013－11－09．
基金项目:湖北省教育厅指导性项目(B200729006) ;恩施州科技局指导性项目．
作者简介:李伟(1975－ ) ，男，硕士，讲师，主要从事于细胞生物学及资源开发的研究．
不同产地火棘果实黄酮体外抗氧化作用
李 伟，程 超
(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要:主要测定了来自恩施 6 种不同产地的火棘果黄酮的含量，用大孔树脂进行分离纯化，并测定了黄酮在不同抗
氧化体系中的抗氧化作用，试验结果发现成熟度较低的火棘果中黄酮的含量较高;AB－8 型大孔树脂对黄酮的吸附
率和解吸率高，适于火棘果黄酮的分离纯化．在 DPPH和邻苯三酚自氧化体系中，火棘果黄酮对 DPPH自由基和超
氧自由基有显著的清除效果，且随着黄酮浓度升高，清除率也随之升高．经纯化后的火棘果黄酮较纯化前的火棘果
黄酮抗氧化性有所增强．
关键词:火棘果;黄酮;大孔树脂;纯化;抗氧化
中图分类号:TS201． 2 文献标志码:A 文章编号:1008－8423(2013)04－0382－04
The Antioxidation Effect in vitro of Flavonoides from Different
Pyracantha fortuneana Fruits
LI Wei，CHEN Chao
(School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalties，Enshi 445000，China)
Abstract:In this article，the flavonoides contents of 6 kinds of Pyracantha fortuneana fruits were deter-
mined，separated and purified by macroporous resin，and the antioxidant activities of flavonoides in dif-
ferent system were also determined． The results were as follows:The flavonoides content of low maturity
was higher than the others，and AB－8 macroporous resin was suitable for the separation and purification of
flavonoides for its high adsorption and desorption rate． The flavonoides had significant inhibition effect on
the DPPH and superoxide radical，and the inhibition rate increased along with the flavonoides concentra-
tion． The inhibition effect of purified flavonoides was higher than the unpurified．
Key words:Pyracantha fruits;flavonoides;macroporous resin;purification;antioxidation
火棘(Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li)为蔷薇科苹果亚科火棘属常绿野生灌木果树植物，产区均可
以果实代替粮食．火棘属植物主要分布在我国西南地区，以湖北、四川、贵州等省产量较大［1－2］．
有关火棘的研究重点在火棘的组织培养、观赏园艺及功能作用方面［3－4］，同时前期研究发现火棘果黄酮
具有很强的抗氧化效果［5］，但目前对恩施州不同地区火棘功效成分及功能作用的研究较少研究报道． 因此
本文主要以湖北省恩施州不同海拔地区、不同成熟期的火棘果实中的黄酮为分析指标，对其进行初步分离纯
化，并对不同产区的黄酮的抗氧化作用进行了研究，期望本研究可为火棘优良种质的选育方面提供新的信息
资料．
表 1 火棘果原料产地及特征
Tab． 1 The place and characteristics of raw materials
from Pyracantha fortuneana Fruits
编号 产地 海拔 /m 成熟度 颜色
C1 恩施市白杨坪 820 十成熟 深红色
C2 恩施市龙洞河 450 六成熟 浅红色
C3 宣恩县晓关 800 七成熟 浅红色
C4 建始建茅田 1 200 十成熟 深红色
C5 恩施市龙洞河 450 十成熟 深红色
C6 利川市南坪 1 100 八成熟 浅红色
1 材料与方法
1． 1 试验材料
火棘果实:试验材料共有 6 种，如表 1 所示． 以下编号代
表种类与此相同．
1． 2 试验试剂
芦丁标准品(上海研生实业有限公司) ;DPPH(上海化学
工业发展有限公司) ;AB－8、D－101、NKA－II 型大孔树脂(天
津欧瑞生物科技有限公司)．
第 31 卷第 4 期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol． 31 No． 4
2013 年 12 月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Dec． 2013
乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、浓盐酸、没食子酸、三烃甲基氨基甲烷，均为国
药集团化学试剂有限公司，分析纯．
1． 3 试验仪器
DL－5 低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂) ;ＲE－52 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;DHL－A
电脑恒流泵(上海沪西分析仪器厂) ;TH－1000 梯度混合器(上海沪西分析仪器厂) ;层析柱:1． 6×50 cm(上海
沪西分析仪器厂) ;DBS－100 电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂) ;756MC紫外可见光分光光度计
(上海精密科学仪器有限公司)．
1． 4 试验方法
1． 4． 1 火棘果黄酮提取工艺流程 参照文献［6］，略有修改，准确称取 10 g 原料，按料液比 1 ∶ 5 加入石油
醚，回流脱色脱脂 1 h，4 800 r /min离心 15 min，收集沉淀自然干燥，将干燥粉末用 1 ∶ 25 料液比在 80℃下用
90%乙醇溶液回流提取 3 h，4 800 r /min离心 15 min，取上清液浓缩后冷冻干燥即可．
1． 4． 2 黄酮含量测定 分别吸取 0． 5mg /mL芦丁标准溶液 0、0． 4、0． 8、1． 2、1． 6、2． 0mL于 10mL容量瓶中，
加 5% NaNO2 溶液 0． 3mL，放置 6 min，再加 10% Al(NO3)3 溶液 0． 3 mL，放置 6 min，加 4% NaOH 溶液 4． 0
mL，加水至刻度，摇匀，放置 15 min，于 510 nm测吸光度［7］．以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线
并得线形回归方程为 y= －0． 004 9+1． 072 1x，Ｒ2 = 0． 999 6．
黄酮的得率(%)=
A510 +0． 004 9
1． 072 1×W×1 000
×V×100
其中:V:黄酮溶液总体积(mL) ;W:火棘果黄酮重量(g)．
1． 4． 3 黄酮的分离纯化
1． 4． 3． 1 大孔树脂预处理 分别称取 10 g AB－8、D－101、NKA－Ⅱ型大孔树脂，用 95%乙醇浸泡 24 h，充分
溶胀后，抽滤，蒸馏水反复冲洗至中性;再用 5% NaOH浸泡 3 h，再用蒸馏水洗至中性;用 5% HCL溶液浸泡 3
h，再用蒸馏水洗涤至中性备用［8－9］．
1． 4． 3． 2 大孔树脂筛选 称取 1． 0 g经处理好的树脂于 50 mL烧杯，加入质量体积分数为 C0 的黄酮提取液
10 mL，室温搅拌 2 h，4 800 r /min离心 15 min，得上清液 1，测其黄酮质量体积分数为 C1 ．取出吸附饱和的树脂
加入 10 mL体积分数为 90%乙醇洗脱，同样温度下搅拌 2 h，离心，得上清液 2，测其黄酮质量体积分数 C2，分
别以吸附率和解吸率为参考指标进行树脂优化［8－9］．
吸附量=C0V－C1V1
吸附率=(C0V－C1V1)/C0V×100%
解吸率=C2V2 /(C0V－C1V1)×100%
式中:C0 为黄酮提取液质量体积分数，mg /mL;C1为树脂吸附后剩余溶液质量体积分数，mg /mL;C2为洗脱液
质量体积分数，mg /mL;V为加入黄酮体积;V1为上清液 1 的体积;V2为上清液 2 的体积．
1． 4． 3． 3 饱和吸附量的确定 将一定量大孔树脂装柱，以 0． 61 mg /mL黄酮液上柱，流速 1． 5 mL /min，收集
流出液，测定流出液体积及吸光度．直至流出液吸光度与黄酮原溶液吸光度一样时，即达到饱和吸附量，停止
上柱．
1． 4． 3． 4 洗脱剂质量体积分数的确定 先用蒸馏水洗脱，洗去大孔树脂吸附的多糖(取 1 mL蒸馏水洗脱液
按苯酚－硫酸法检测多糖，至颜色变为无色时停止蒸馏水洗脱) ，而后依次用 50 mL 30%、50%、70%、90%乙
醇溶液洗脱，收集不同质量体积分数乙醇洗脱液，测定黄酮质量体积分数，以确定最佳洗脱剂．
1． 4． 3． 5 黄酮纯溶液的收集 在层析柱中加入一定量树脂，加入一定量(能使树脂达到饱和吸附状态)提
取液，只至达到饱和吸附，先用蒸馏水洗脱多糖类物质，接着用乙醇洗脱，并收集前 30 管，每管 5 mL，流速为
1． 5 mL /min．收集后，分别取 0． 5 mL收集液测其吸光值．
1． 4． 4 不同产地火棘果黄酮提取液及黄酮纯化后的抗氧化作用研究
1． 4． 4． 1 对 DPPH自由基的清除作用 在试管中依次加入 2． 5 mL 6． 5×10－5mol /L DPPH和 1． 5 mL60%乙
醇，总体积 4． 0 mL，混合 20 min后，于 1 cm 比色皿测定 517 nm 吸光度记为 A0;加入 2． 5 mL 6． 5×10
－5mol /L
DPPH再加入各梯度提取液，即 5、10、15、20、25 μg /mL黄酮提取液，最后加入 60%乙醇至 4． 0 mL测定 A517nm
记为 Ai;加入 2． 5 mL60%乙醇和各梯度待测液，各加 60%乙醇至 4． 0 mL，测定 A517nm 记为 Aj;按下列公式计
383第 4 期 李 伟等:不同产地火棘果实黄酮体外抗氧化作用
算 DPPH 自由基清除率［10］．
I(%)=［1－(Ai－Aj)/ A0］×100%
1． 4． 4． 2 对超氧自由基清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定，取 4． 5 mL pH 8． 23 50 mmol /L Tris－
HCl缓冲液、4． 2 mL蒸馏水，混匀后室温保持 20 min，取出后立即加入 3 mmol /L邻苯三酚(以 10 mmol /L HCl
配制，空白管用 10 mmol /L HCl代替邻苯三酚溶液)0． 3 mL，迅速摇匀后，在 325 nm 下每隔 30 s 测定吸光度．
加入邻苯三酚前，先加入一定体积黄酮溶液，蒸馏水减少，再按下述方法计算抑制率［11］．抑制率计算公式:
抑制率(%)=(△A0 －△A)/△A0 ×100%
式中:△A0为邻苯三酚的自氧化速率，△A为加入黄酮溶液后邻苯三酚的自氧化速率，单位均匀为吸光度每
分钟的增值．
图 1 不同产地火棘果黄酮含量
Fig． 1 The flavonoide quantity of different kinds
of Pyracantha fortuneana fruits
表 2 3 种大孔树脂对火棘果黄酮吸附及解吸性能比较
Tab． 2 Comparison of adsorption and desorption of three types
macroporous resin on Pyracantha fortuneana fruit flavonoid
树脂型号 吸附前黄酮量 /mg
吸附后黄
酮量 /mg
吸附
率 /%
解吸后
黄酮量 /mg
解吸
率 /%
NKA－Ⅱ 13． 52 11． 636 13． 93 0． 38 20． 16
AB－8 13． 52 11． 211 17． 08 0． 661 28． 63
D－101 13． 52 11． 636 13． 93 0． 534 28． 34
图 2 AB－8 型大孔树脂对黄酮的动态吸附能力
Fig． 2 Dynamic adsorption capability of AB－8
macroporous resins on flavonoid
表 3 不同质量体积分数乙醇对黄酮的洗脱效果
Tab． 3 The eluted effect on flavonoides of
different concentration ethanol
乙醇体积分数 /% 30 50 70 90
黄酮洗脱率 /% 27． 11 13． 43 13． 37 13． 51
2 结果与分析
2． 1 不同产地火棘果中黄酮含量测定结果
分别对 6 种原料的火棘果实中的黄酮含量进行测
定，重复 3 次，具体结果见图 1．
由图 1 可以看出，不同产地火棘果黄酮含量差异显
著，尤其是 C3 黄酮含量最高，其次是 C2，这可能是由于
成熟期对黄酮含量有影响．
2． 2 火棘果黄酮的分离纯化
2． 2． 1 大孔树脂的筛选 试验选择黄酮含量最高的宣
恩晓关的火棘果为原料研究其纯化工艺，具体结
果见表 2．大孔树脂由于其理化性质不同对黄酮
的吸附及解吸影响很大，树脂的极性、孔径、比表
面积、孔容等均能影响其吸附率．从表 2 可以看
出，AB－8 对黄酮的吸附能力相对较强，解析率
也相对较高，相同条件下 AB－8 型大孔树脂解吸
出来的黄酮量较多，故选择 AB－8 型大孔树脂为
分离纯化火棘果黄酮树脂．
2． 2． 2 饱和吸附量确定 按照试验方法 1． 4． 3． 3 进行
树脂饱和吸附量的确定，以黄酮溶液的上样体积为横坐
标，流出液的吸光度值为横坐标绘制饱和吸附量曲线，
具体结果见图 2．
由图 2 可知，AB－8 型大孔树脂对黄酮的吸附达到
饱和时的上样体积约为 80 mL，即树脂吸附的黄酮总量
为 16． 161 mg，吸附量为 0． 946 mg黄酮 /mL树脂．
2． 2． 3 洗脱剂质量体积分数的优化 火棘果黄酮溶液
中含有水溶性杂质如可溶性糖，因此上样后先用水洗脱
以除去极性较大的糖类物质，而后按照实验方法分别选
用 30%、50%、70%、90%的乙醇进行洗脱，测定结果见表 3． 由表
3 可知当洗脱剂质量体积分数为 30%时洗脱率最大，可收集到最
多纯液，故选用此质量体积分数乙醇溶液作为洗脱剂．
2． 2． 4 黄酮纯化溶液的收集 首先上样使 AB－8 树脂对火棘果
黄酮达到饱和吸附，而后用蒸馏水洗脱至无糖为止，接着用 30%的乙醇进行洗脱，并按每管 5 mL 收集洗脱
液，以收集管数为横坐标，洗脱液黄酮的吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，结果见图 3．由图 3 可以看出洗脱液
共有一个洗脱峰，且 6 ～ 16 管黄酮含量达到最高值，因此重复上样，重复收集 6 ～ 16 管，以制备纯化黄酮．
483 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 31 卷
图 3 AB－8 型大孔树柱层析结果
Fig． 3 The column chromatography map of AB－8 type resin
表 4 火棘果黄酮及纯化后火棘果黄酮对 DPPH自由基清除作用
Tab． 4 The inhibition effect on DPPH of flavonoide of
Pyracantha fortuneana fruit and the purified
火棘果黄酮种类 回归方程 相关系数 IC50 /(μg·mL
－1)
C1 y=27． 97ln(x)+5． 57 0． 970 2 4． 90
C2 y=32． 16ln(x)－64． 65 0． 997 0 35． 35
C3 y=1． 49x+13． 97 0． 998 2 24． 11
纯化 C3 y=3． 28x+13． 86 0． 986 5 11． 03
C4 y=27． 11ln(x)－6． 03 0． 995 1 8． 65
C5 y=38． 37ln(x)－32． 32 0． 998 6 9． 59
C6 y=33． 48ln(x)－15． 32 0． 993 4 7． 10
表 5 火棘果黄酮及纯化后黄酮对超氧自由基清除作用
Tab． 5 The inhibition effect on ultra oxygen free radical of flavonoide
from Pyracantha fortuneana fruit and the purified
火棘果黄酮种类 回归方程 相关系数 IC50 /(μg·mL
－1)
C1 y=1． 43x+1． 76 0． 996 7 33． 85
C2 y=1． 07x+16． 54 0． 999 9 31． 36
C3 y=27． 45ln(x)－50． 41 0． 997 8 38． 78
纯化 C3 y=0． 90x+16． 04 0． 999 7 37． 63
C4 y=43． 55ln(x)－98． 51 0． 996 1 30． 27
C5 y= x+17． 4 0． 9838 32． 6 0
C6 y=39． 81ln(x)－80． 21 0． 995 2 26． 96
2． 3 火棘果黄酮提取液及纯化后的抗氧化研究
2． 3． 1 对 DPPH自由基清除率的测定 分别测定收集
制备的 C3 火棘果黄酮与其他 6 种未纯化的火棘果黄酮
对 DPPH自由基的清除作用，结果见表 4．
半数清除质量体积分数(IC50)被普遍采用作为评
价抗氧化剂清除自由基能力强弱的指标．半数清除质量
体积分数即体系平衡后，自由基被半数消除时所需要加
入抗氧化剂的质量体积分数． 从表 4 的 IC50值可以看
出，火棘果黄酮对 DPPH 自由基具有很强的清除能力，
尤其是 C1、C4、C5、C6 显著高于 C2、C3 和纯化后
的 C3，由此可见成熟度对火棘果黄酮抗氧化作用
影响很大;此外纯化后的火棘果黄酮对 DPPH 自
由基的清除能力强于未纯化的，这可能是由于纯
化降低了火棘果黄酮中杂质的干扰．
2． 3． 2 对超氧自由基清除率的测定 利用邻苯
三酚自氧化体系，研究收集制备的 C3 火棘果黄
酮与其他 6 种未纯化的火棘果黄酮对超氧阴离子
自由基的清除作用，结果见表 5．
超氧自由基是机体代谢过程中产生的，在清
除超氧自由基实验中，火棘果黄酮表现出良好的
清除能力，并且清除效果与黄酮质量体积分数具
有良好的量效关系．从表 5 的 IC50 值可看出，实验
的 6 个产地的火棘果黄酮对超氧自由基的抗氧化
能力相差不大，同时纯化后的火棘果黄酮对超氧
自由基的清除能力与纯化前的效果相当．
3 结论
通过以上试验可以得出，成熟度较低的火棘
果中黄酮的含量较高． 对 3 种大孔树脂的动态吸
附和解吸效果进行了比较，得出 AB－8 型大孔树脂吸附率和解吸率都高一些，选择性好，适于火棘果黄酮的
分离纯化．
在 DPPH 体系和邻苯三酚自氧化体系中，火棘果黄酮对 DPPH 自由基和超氧自由基有显著的清除效
果，且随着黄酮质量体积分数升高，清除率也随之升高．经纯化后的火棘果黄酮较纯化前的火棘果黄酮抗氧
化性有所增强．但是不同产地的火棘果黄酮对两种自由基的清除能力不同，尤其是对 DPPH 自由基的清除
能力差异较大，这可能与其中所含的黄酮种类有关，此部分内容有待于进一步深入研究．
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583第 4 期 李 伟等:不同产地火棘果实黄酮体外抗氧化作用