全 文 ：No.9.2008
收稿日期:2008-01-03 *通讯作者
基金项目:湖南省科学技术厅科技计划重点项目(04NK4001);国家外国专家局项目(2003430042)。
作者简介:陈雪香(1981—),湖南郴州人,硕士研究生,主要从事资源植物化学的研究工作。
山莓叶抑菌活性物质的提取、
抑菌效果及其化学成分初步研究
陈雪香 1,2,谭 斌 3,周双德 4,蔺万煌 1,肖苏尧 2,曹 庸 2*
(1.湖南农业大学植物激素重点实验室,长沙 410128;2.华南农业大学
食品科学院,广州 510642;3.湖南农业大学天然产物工程技术中心,
长沙 410128;4湖南农业大学生物科学技术学院,长沙 410128)
摘要:采用80%乙醇、水、石油醚3种不同溶剂提取山莓叶中抑菌活性成分,通过抑菌实验结果表
明:山莓叶提取物中,其中80%乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌均具有较
强的抑制作用,水提取物抑菌作用较弱,石油醚提取物无明显抑菌作用;其中三种提取物对酵母的抑
制作用均较弱;80%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌和酵母的最小抑菌浓
度(MIC)为6.25~12.5mg/mL;80%乙醇提物经30、50、80℃的温度各处理2h,121℃下处理20min;
光照6~18h,pH5~7仍具有很好的抑菌效果;系统预试实验初步表明:山莓叶乙醇提取物中主要含
有多糖及其甙类、鞣质、黄酮类、酚类物、强心甙、有机酸以及香豆素、甾体、萜类等成分。
关键词:山莓;抑菌活性;化学检识;化学成分
中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)09-0192-04
Preliminaryresearchonextraction,antibioticefectandchemical
constituentsofrubuscorchorifoliusleavesextract
CHENXue-xiang1,TANBin3,ZHOUShuang-de4,LINWan-huang1,XIAOSu-yao2,CAOYong2*
(1.KeyLaboratoryofPhytohormonesofHunanAgriculturalUniversity,Changsha410128;
2.ColegeofFoodScienceHuananAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;
3.EngineeringTechnologyCenterforNaturalProductsinHunanAgricultureUniversity,
Changsha410128;4.ColegeofBioscienceandBiotechnology,
HunanAgricultureUniversity;Changsha410128)
Abstract:ActiveconstituentsinRubuscorchorifoliusleaveswereextractedbythreediferentsolventwhich
were80%ethanol,waterandpetrolicether,andthebacteriostasiswasstudied.Theresultshowedthat:80%
ethanolextractionofRubuscorchorifoliusleaveshadstrongerbacteriostasisonEscherichiacoli,Staphyl-
ococcusaureusandShigeladysenteroae,butwaterextractionhadweakbacteriostasisandpetro-licether
extractionhadnobacteriostasis.Inaddition,extractedantibacterialsubstancehadshowedbacteriostasison
PeniciliumspandSaccarom-ycescerevisiae,buttheefectswerenotobvious.Fungicidalactivitiesactive
principleneedmorestudy.ThelowestconcentrationofethanolextractionofRubuscorchorifoliusleaveswas
6.25~12.5mg/mL,Antibacterialsubstancehadgoodstabilitywhentreatat30,50,80℃ for2h,121℃ for20
min,lightat6~18handpH5~7;testpre-experimentofchemicalcomponentsshowthat:itmaincomponent
arepolysaccharidesandglucoside,tannin,flavonoids,phenols,cardiac,glycocides,organicaacid,cumarin,
steroidantiterpenoidetc.intheethanolextractofRubuscorchorifoliu.
提取物与应用
192
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.09.078
No.9.2008
山莓(RubuscorchorifoliusL.f)属于蔷薇科悬钩子属
植物,为直立灌木,俗名树莓、牛奶泡、三月泡、龙
床泡、泡儿刺等,在我国除东北、甘肃、青海、新疆、
西藏外,其他各省市均有分布[1]。据《本草纲目》记载,
山莓的果、根及叶均可入药,有活血、解毒、止血之
功效,叶性苦,具有消肿解毒的功效,主治多发性
脓肿、乳腺炎等症[2],湘西土家人常采食其叶治疗
难愈的腹泻,其效果显著。目前国内外对山莓的研
究主要集中在资源利用方面,利用其聚合果进行食
品加工[3-4],利用其鞣质作为化工原料等,而在其
活性成分抑菌方面的研究报道尚少。本课题组曾通过
中等极性的有机物从山莓叶中萃取获得两种未知化学
成分[5],本文则利用不同极性的有机溶剂对山莓叶进
行提取,然后对提取物进行抑菌活性研究,同时检测
温度、光照、pH对提取物抑菌活性的影响,并对其
醇提取物进行化学成分分析,为山莓叶提取物进一步
分离纯化、单体分析、活性实验奠定基础,为挖掘山
莓叶的药理作用、充分开发利用山莓资源提供科学
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料 山莓叶采于张家界永定区,经吉首大
学城乡资源与规划学院廖博儒副教授鉴定。材料于
室内阴干备用。
1.1.2 供试菌种 啤酒酵母菌、大肠杆菌、金黄色
葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、以上菌种均为湖南省卫生
防疫站提供的标准株。
1.1.3 培养基 牛肉浸膏蛋白胨培养基,PDA培养基。
2 实验方法
2.1 3种不同溶剂提取山莓叶活性物质
将阴干的山莓叶粉碎至 0.3mm,分别加入水、
80%乙醇、石油醚[v(提取液)∶m(材料)=10∶1(mL∶g)]超声
波处理 10min,然后浸提 48h,过滤,滤液减压浓
缩,并冷冻干燥,即得山莓叶粗提物,备用。
2.2 K-B纸片法测定粗提物抑菌活性[6]
称取上述 3种不同提取液提取的山莓粗提物各
0.1500g,以 1mL对应的溶剂溶解后,放入 20片 6
mm圆形灭菌滤纸片,充分浸泡后烘干待用。以生
理盐水作为阴性实验对照,4μg/mL的庆大霉素溶
液作为阳性实验对照。供实菌种采用平板活化,取
活化后的菌种用生理盐水配成 1.5×106cfu/mL的菌
悬液,并分别取待试菌悬液 0.2mL以涂布法制成菌
平板,每块平板内等距离放入 5片滤纸,其中 3片
不同试样滤纸片,其他 2片分别为阳性对照和阴性
对照滤纸片。将实验样品分别置于适宜温度下培养
(细菌 37℃下培养 12h,酵母 28℃培养 24h),观
察,并测定抑菌圈直径,分析上述 3种处理样品的
抑菌效果。
2.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定
最低抑菌浓度(MIC)的测定 用试管连续二倍稀
释法:将9支灭菌试管排成一列、编号,各加入灭菌
普通肉汤1mL,在第1管内加入0.1g/mL的提取物1
mL,混匀后吸取 1mL到第 2管,混匀再取 1mL到
第3管,依次类推至第9管,弃去1mL,第10管不
加提取物,然后每管加入菌液 0.1mL(菌悬液 106
cfu/mL,混匀,置 37℃恒温培养 24h;酵母 28℃,
培养 36h。结果判定:肉汤清亮透明表示无细菌生
长(-),肉汤浑浊表示有细菌生长(+),以能抑制细菌
生长的山莓提取物最高稀释度作为其最低抑菌浓度
(MIC),以无菌水作对照。
2.4 醇提液的制备
山莓叶干粉(0.3mm)100g,用 10倍体积的 80%
乙醇浸提48h,过滤,重复提取2次,合并滤液,减
压浓缩至100mL,用于抑菌效果实验。
2.5 不同温度对山莓叶醇提物处理后的抑菌性测定
分别取 1mL醇提液置于 30、50、80℃的水浴
条件理各处理 2h,和 121℃湿热处理 20min之后,
用K-B滤纸片法测其抑菌效果。
2.6 不同光照时间及不同光质条件对山莓叶醇提物
抑菌活性的测定
分别取1mL醇提液置于室内散射光、太阳直射
光、紫外光下,分别处理6、12、18h,并用K-B滤
纸片法测定其抑菌效果。
2.7 不同pH值对山莓叶醇提物处理的抑菌性测定[6]
用稀盐酸和稀氨水调醇提液的pH值,使试样中
pH分别为 3、5、7、9、11、13后,分别取 1mL并
用K-B滤纸片法测其抑菌效果。
2.8 山莓叶醇提物化学成分检识方法[7]
称取山莓叶干粉(0.3mm)100g,用 10倍体积的
80%乙醇浸提 48h,过滤,重复提取 2次,合并滤
液,减压浓缩,冷冻干燥,采用试管法对山莓叶醇提
物进行化学成分检识实验。
3 结果与分析
3.1 山莓叶抑菌活性成分的提取
经过多次重复性实验后表明(见表 1):山莓叶活
Keywords:Rubuscorchorifolius;antibacterialactivity;technologyofchemistry;chemicalcomposition
提取物与应用
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注“-”表示无明显抑菌圈。
表3 提取物在不同pH条件下的抑菌活性结果
抑菌圈直径/cm
菌种
pH
3 5 7 9 11 13
大肠杆菌 - 1.4 2.0 - - -
金黄色葡萄球菌 - 1.4 1.7 - - -
痢疾志贺氏菌 - - 1.8 1.2 1.1 -
注“-”表示无明显抑菌圈。
表1 山莓3种不同溶剂提取物的抑菌效果
实验样品
菌种(抑菌圈直径/cm)
啤酒酵母 大肠杆菌
金黄色葡
萄球菌
痢疾志
贺氏菌
生理盐水 - - - -
石油醚提取物
(0.15g/mL) - 0 - -
80%乙醇提取物
(0.15g/mL) 0.9 1.8 2.1 2.5
水提物
(0.15g/mL) - 0.8 0.9 0.9
庆大霉素
(4μg/mL) 1.5 1.5 1.6 1.5
注:“-”无菌生长,“+”有菌体,“++”菌体较少,“+++”菌体
较多,“++++”菌体很多。
表2 80%乙醇提取物的最小抑菌浓度的测定(MIC)
性物质对不同的菌株具有不同的抑菌效果,3种不同
极性溶剂提取的山莓叶活性物质抑菌效果具有很大
的差异,其中以 80%乙醇提取物的抑菌效果最好,
水提物抑菌作用较弱,石油醚提取物对所供菌种均
无抑菌作用。80%乙醇提取物对痢疾志贺氏菌、金黄
色葡萄球菌的抑制作用很强,对大肠杆菌稍弱一些,
啤酒酵母菌的抑制作用较弱;水提物仅对金黄色葡
萄球菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌有较弱的抑制作
用,对啤酒酵母菌无抑制作用。该实验结果初步显
示,山莓抑菌活性成分在 80%乙醇溶液中的溶解性
比在其他2种溶剂中的溶解性好,其抑菌活性物质可
能是一系列具有中等极性的物质。因此以后实验以
80%乙醇提取物作为材料。
3.2 山莓叶提取物最低抑菌浓度(MIC)的确定
通过试管连续二倍稀释法检测 80%乙醇提取物
的最低抑菌浓度,测定结果表明(见表 2):80%乙醇
提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆
菌的最低抑菌浓度约为 6.25mg/mL,对啤酒酵母的
最低抑菌浓度约为12.5mg/mL。
3.3 不同温度对山莓叶乙醇提物处理后的抑菌活性
80%乙醇提取的山莓叶提取物抑菌有效成分经不
同温度的热处理后,经 30、50、80℃处理 2h后其
抑菌活性较稳定,经 121℃高温处理 20min后,山
莓提取物对大肠杆菌抑菌作用稍减弱,这说明山莓
提取物抑菌有效成分能耐较高温度,对热较稳定见
图1。
3.4 不同光照条件对山莓叶醇提物处理后的抑菌
活性
山莓叶醇提物经同种光照不同时间处理后,对
其抑菌效果影响较小;经不同光质照射条件处理后,
其对抑菌物活性影响也较小,这说明了山莓叶提取
的抑菌活性成分在 6~18h的较短时间内对光照较稳
定,不同光质对山莓活性物质的影响也较小,结果
见图2。
3.5 山莓叶乙醇提物经不同pH处理后的抑菌效果
山莓叶 80%乙醇提物经不同 pH处理后,pH值
为 5~7时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果
较好,pH值为7~9时对痢疾志贺氏菌的抑菌效果较
好,其中在pH7时,山莓叶醇提物的抑菌效果最好,
抑菌圈达到最大,当pH11时仅痢疾志贺氏菌有抑菌
浓度/
(mg/mL)
50 - - - -
25 - - - -
12.5 - - - -
6.25 - - - +
3.12 + + + ++
1.56 ++ ++ ++ +++
0.78 +++ +++ +++ ++++
0.39 ++++ ++++ ++++ ++++
0.19 ++++ ++++ ++++ ++++
无菌水 ++++ ++++ ++++ ++++
实验菌种大肠杆菌
金黄色葡萄
球菌
痢疾志贺
氏菌
啤酒酵母
提取物与应用
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作用,而对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无抑菌效果。
pH为3和13时,其抑菌活性完全消失,由此说明山
莓叶抑菌活性成分在 pH5~7较稳定,其抑菌效果好
见表3。
3.6 山莓叶乙醇提取物化学成分检识
系统预试屎验结果表明:山莓叶醇提物中的成
分主要含有有机酸、糖类、黄酮及其甙类、鞣质、酚
类、强心甙、香豆素、甾体、萜类。
表4 山莓乙醇提取物化学成分检识结果
实验法 现象 可能含有成分
氯伪-浓硫酸实验 氯仿层有红色反应 ,硫酸层有绿色荧光 植物甾醇或三萜成分
盐酸镁粉反应 红色 黄酮或黄酮苷类
醋酸铅反应 黄绿色沉淀生成 黄酮或黄酮苷类
三氯化铁反应 绿色 酚类
三氯化铁-铁氰化钾反应 滤纸黄色背景下呈蓝色 酚类
样品水溶液作 Fehling试剂反应 红棕色沉淀生成 糖类
加热后的样品水溶液作-萘酚实验 溶液界面处有紫色环出现 糖类
三氯化铁试剂检试 绿黑色淀淀生成 鞣质
碱石灰水试剂检试 青绿色沉淀生成 鞣质
异羟 酸铁试剂反应 黄色变为红褐色 香豆素
开环-闭环试剂 棕色变为无色 香豆素
乙醇提物水溶液,点加到广范纸上,干燥显色 标准对照得山莓乙醇提物pH值为5~6 有机酸
Baljet试剂反应 显红棕色 强心甙
Keler-Kiliani试剂反应 有紫色环及沉淀生成 强心甙
4 结论与讨论
以 3种不同极性的溶剂对山莓叶进行抑菌活性
物质的提取,其中以 80%乙醇溶液的提取物具有明
显的抑菌活性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾
志贺氏菌等抑制效果显著;80%乙醇提取物对金黄
色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌大肠杆菌的最低抑菌浓
度为 6.25mg/mL,对啤酒酵母的最低抑菌浓度为
12.5mg/mL,由此说明山莓中 80%乙醇提取物对金
黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌和大肠杆菌具有很好
的抑菌效果;提取物经 30、50、80℃处理 2h后的
其抑菌活性较稳定,经 121℃高温处理 20min后,
山莓提取物对大肠杆菌抑菌作用稍减弱,这说明山
莓提取物抑菌有效成分对热比较稳定,但在实验过
程中避免太高的温度,以免影响其活性;山莓乙醇
提物经同种光照不同时间处理后,对其抑菌效果影
响较小;经不同光质照射条件处理后,其对抑菌物
活性影响也较小,这说明了山莓叶提取的抑菌活性
成分在 6~18h的较短时间内对光照较稳定,不同光
质对山莓活性物质的影响也较小;至于长时间的光
照对其有影响还有待进更深入的研究;山莓叶 80%
乙醇提物经不同 pH处理后,pH值为 5~7时对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好,pH值为
7~9时对痢疾志贺氏菌的抑菌效果较好,其中在
pH7时,山莓叶醇提物的抑菌效果最好,当pH11时
仅痢疾志贺氏菌有抑菌作用,而对大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌无抑菌效果。pH为 3和 13时,其抑菌
活性完全消失,由此说明山莓叶抑菌活性成分在中
性微偏酸性条件下其抑菌活性最好,不宜在酸性和
碱性条件下。
山莓叶具有良好的抑菌活性,是一种潜在的天
然防腐剂,具有很好的应用前景。为此,我们拟从山
莓抑菌活性物的成分、性质、毒性、单体和结构等方面
进行深入研究,以便更大程度地发挥山莓的作用。
参考文献:
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