全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:1056-1063
文章编号:1001-6880(2015)6-1056-08
收稿日期:2015-03-24 接受日期:2015-04-28
* 通讯作者 E-mail:yanyy75@ 163． com
响应面法优化火棘总酚含量测定方法
张 焕1，董光耀1，舒 畅1，王俊杰1，陈西喆2，鄢又玉1*
1武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023;2 湖北神农蜂语生物产业有限公司，十堰 442000
摘 要:通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘总酚含量的定量方法。考察了福林酚试剂的浓度(mol /
L)及用量、Na2CO3 溶液的浓度(g / L)及用量、水浴时间及温度、待测液体系的 pH 值及乙醇浓度等因素对火棘
总酚含量测定的影响。在单因素试验的基础上，进一步通过 Box-Behnken设计优化火棘总酚的检测条件。结果
表明，火棘总酚的最适检测条件为:1 mL适宜浓度的火棘总酚提取物，加入 0． 4 mol /L福林酚试剂 5 mL，漩涡混
匀后，加入 170 g /L Na2CO3 溶液 1 mL，混匀后于 34 ℃水浴反应 40 min，冰水中快速冷却，室温条件下于 765 nm
波长测吸光度。该方法具有极好的重复性及重现性，1 h 内检测稳定性高，回收率高达 99． 95%，测定时可忽略
待测液体系 pH及乙醇浓度的影响。该方法可推广应用于其它植物总酚含量的检测。
关键词:火棘;总酚;福林酚比色法;响应面优化
中图分类号:TS209 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 06． 022
Optimization of Content Determination Method of Total Polyphenols from
Pyracantha fortuneana by Ｒesponse Surface Methodology
ZHANG Huan1，DONG Guang-yao1，SHU Chang1，WANG jun-jie1，CHEN Xi-zhe2，YAN You-yu1*
1College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Hubei Wuhan 430023，China;
2 Hubei Shennong Honey Bio-Tech． Co．，Ltd．，Hubei Shiyan 442000，China
Abstract:A quantitative determination of total polyphenols from Pyracantha fortuneana were optimized by Folin-Ciocal-
teu colorimetry with Ｒesponse surface methodology． The effect of concentration of Folin-Ciocalteu reagent (mol /L)and
its addition amount (mL)，concentration of Na2CO3 solution (g /L)and its addition amount (mL)，incubation time and
temperature，pH and concentration of ethanol of the solution system on the total polyphenols measurement was investiga-
ted thoroughly． On the basis of single factor experiment，the detection conditions of polyphenols from P． fortuneana were
further optimized by Box-Behnken design． The results showed the optimal condition for detection was as follows:5 mL of
0． 4 mol /L Folin-Ciocalteu reagent was added into 1 mL suitable concentration of polyphenols extracts from P． fortu-
neana，after vortex mixing，1 mL of 170 g /L Na2CO3 solution was added and mixed，then placing in 34 ℃ water bath
and reacting for 40 min，then rapidly cooling with ice water，finally measuring absorbance at the wavelength of 765 nm
under room temperature． The developed method had good repeatability and reproducibility，as well as high stability within
1 h and high recovery rate of 99． 95% ． It was almost not affected by the pH of solution system and the concentration of
ethanol in extracts． This method can be applied to detect total polyphenols from other plant sources．
Key words:Pyracantha fortuneana;total polyphenols;Folin-ciocalteu colorimetry;response surface optimization
火棘［Pyracantha fortuneana (Maxim．)Li］为常
绿灌木或小乔木，主产于川、滇、黔、陕、鄂、湘、粤、
桂、闽、浙、皖、苏等我国南方山区及丘陵地带，资源
极其丰富，目前已被国家卫生部批准作为食品新资
源食用果品［1］。其果实富含多酚成分［2，3］，植物多
酚具有抗氧化［4］、抗肿瘤，延缓衰老、免疫调节［5，6］
等多种生物活性。
目前用于植物多酚的含量检测方法较多，主要
有分光光度法［7］、近红外光谱法［8］以及色谱法［9，10］
等。其中分光光度法因对设备的要求不高，操作简
单而得到最广泛应用。主要包括酒石酸亚铁比色
法［11］、福林酚比色法［12］和高锰酸钾滴定法［13］等，其
中福林酚法应用最为广泛。但不同资料所报道的用
于总酚测定的福林酚比色法检测条件却存在很大的
差异［12，14-19］，主要表现在:①最大检测波长不一致，
有以 680、725、740、750、760、765、780 nm 等为测定
波长;②福林酚试剂与碱液 Na2CO3 含量及比例各
不相同，有 1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3 及 1∶ 5 等;③Na2CO3 溶液
浓度差别很大，有 5% (w /v)、7． 5%、10%、15%、
20%、饱和浓度等;④显色时间分布在 30 ～ 120 min
等;⑤显色温度 20 ～ 60 ℃不等。因此很有必要对影
响福林酚显色的因素进行系统考察，以确定最优检
测条件。目前对火棘中多酚化合物的定量测定方法
尚未见报道。为了更好地开发利用火棘植物中的功
效成分，本文通过响应面优化建立了福林酚比色法
检测火棘总酚含量的定量方法，此方法也可推广应
用于其它植物总酚的含量测定。
1 材料与方法
1． 1 材料与设备
Lambda 25 型紫外-可见光分光光度计(美国 PE
公司)，CＲ 22G 高速冷冻离心机(日本 HATACHI 公
司)，Molelement1018a型摩尔超纯水机(上海摩勒科
学仪器有限公司)，万分之一电子天平(德国赛多丽
斯公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特实验设备
有限公司);HSJ系列恒温水浴搅拌器(金坛市科析
仪器有限公司);STAＲTEＲ 2100 实验室 pH计(奥豪
斯仪器有限公司)。
没食子酸标准品(中国药品生物制品检定所，
批号:110831-201403)，福林酚试剂(sigma公司)，碳
酸钠、乙醇等均为国产分析纯。
火棘果，2014 年 11 月中旬采自湖北恩施来凤
地区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘
火棘 Pyracantha atalantioides的果实。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 火棘多酚提取物的制备
取干燥、粉碎过 20 目筛的火棘果粉末 20 g，加
体积分数 45%乙醇 200 mL于 92 ℃冷凝回流提取2 h，
减压抽滤，滤液定容于 200 mL，浓度以火棘干物质质量
计为 100 g /L，离心，收集上清液 0 ～4 ℃冷藏备用。
1． 2． 2 火棘多酚的测定
取 1． 2． 1 中稀释 100 倍后的火棘多酚提取液 1
mL，加入 0． 4 mol /L福林酚试剂 5 mL，混匀后，再加
入 170 g /L的 Na2CO3 溶液 1 mL，补充双蒸水至总
体积为 10 mL，混匀(后续试验均依照此体系执行)，
于 25 ℃避光恒温水浴反应 1 h，冰水冷却，室温条件
下于 765 nm波长处测定吸光度。
1． 2． 3 最大吸收波长的确定
取适宜浓度的火棘多酚提取液及没食子酸标准
品溶液各 1 mL，参照 1． 2． 2 显色反应后，室温条件
下于 200 ～ 900 nm 全波段扫描，以确定最大吸收波
长。
1． 2． 4 反应体系的确定
以 10 μg /mL 没食子酸标准品溶液 1． 0 mL 作
为研究对象，确定福林酚法检测总酚含量的最佳反
应体系。分别考察了福林酚试剂的浓度(mol /L)及
用量(mL)、Na2CO3 溶液的浓度(g /L)及用量(mL)、
水浴时间(min)及温度(℃)对总酚含量测定的影
响以及火棘总酚溶液体系 pH 值及火棘总酚提取液
中乙醇体积浓度(%)等因素对火棘总酚含量测定
的影响。
影响火棘多酚含量测定的单因素考察
1． 2． 5 影响火棘多酚含量测定的单因素考察
在 1． 2． 4 的基础上，确定多酚检测的反应体系
为 V待测溶液 ∶ V福林酚试剂 ∶ V 碳酸钠溶液 = 1∶ 5∶ 1，以此反应体
积比为模板，继续深入探讨福林酚试剂及 Na2CO3
溶液的浓度、水浴时间及温度、火棘总酚溶液体系
pH值及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度对火棘多
酚测定的具体影响。
1． 2． 6 响应面优化实验
在 1． 2． 5 项的基础上，以吸光度为评价指标，固
定待测溶液及反应体系，确定福林酚的浓度为 0． 4
mol /L，选择对火棘多酚检测影响显著的 3 个因素:
水浴时间、水浴温度及 Na2CO3 溶液的浓度，按照
Box-Behnken设计，具体见表 1。
表 1 Box-Behnken设计因素水平及编码值
Table 1 Levels and factors of response surface tests
因素 Factors
水平 Levels
-1 0 + 1
X1碳酸钠浓度 Na2CO3 concentrations (g /L) 50 125 200
X2 水浴时间 Incubation time (min) 20 45 70
X3 水浴温度 Incubation temperature (℃) 20 30 40
7501Vol. 27 张 焕等:响应面法优化火棘总酚含量测定方法
1． 2． 7 方法学验证
经过响应面优化得到火棘多酚含量检测的最优
条件后，我们确定了没食子酸的标准曲线及火棘多
酚的工作曲线，并进行重复性、重现性、稳定性、回收
率等方法学验证实验。
2 结果与讨论
2． 1 最大吸收波长的确定
参照 1． 2． 3 设计，结果表明火棘多酚提取液及
没食子酸标准品溶液均在 765 nm处达到最大吸收，
故可选 765 nm作为最大检测波长。
2． 2 反应体系的确定
参照 1． 2． 4 设计，结果分别见图 1(A ～ E)。
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.20
0.19
0.18
0.17
0.16
0.15
0.14
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.16
0.15
0.14
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.15
0.14
0.13
0.12
0.11
0.10
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7
福林酚体积
Volume%of%Folin鄄ciocalteu%
reagent(mL)
0 0.2%0.4%0.6%0.8%1.0%1.2%1.4%1.6 0 0.5%1.0%1.5%2.0%2.5%3.0%3.5%4.0%%4.5
5 10% 15% 20% 25% 30 0 60 120% 180% 240% 300% 360% 420
福林酚浓度
Concentration%of%Folin鄄ciocalteu%
reagent(mol/L)
碳酸钠溶液体积
Volume%of%Na2CO3%solution(mL)
碳酸钠溶液浓度
Concentration%of%Na2CO3%
solution(mL)
水浴时间
Incubation%time(min)
A B C
D E
图 1 福林酚试剂的用量(A)及浓度(B)、Na2CO3 溶液的用量(C)及浓度(D)、水浴时间及温度(E)对火棘总酚含量测定的
影响
Fig. 1 Effects of amount (A)and concentration (B)of Folin-Ciocalteu reagent，amount (C)and concentration (D)of Na2CO3，In-
cubation time and temperature (E)on total polyphenols of P． fortuneana
由图 1(A)可知，随着福林酚用量的增加，吸光
度逐渐增加，至福林酚体积 5 mL 时达到最大，此后
趋于平缓，因此，福林酚添加量选为 5 mL。由图 1
(B)可知，福林酚浓度增加时，吸光度逐渐升高，当
浓度超过 0． 2 mol /L 时增幅趋缓，故选择福林酚浓
度为 0． 2 mol /L继续研究。由图 1(C)及图 1(D)可
知，随着 Na2CO3 溶液体积及浓度的增加，吸光度先
快速增加后趋于平缓，添加量为 1． 0 mL，浓度为 150
g / L时达到最大，因此 Na2CO3 溶液添加量选为 1． 0
mL，浓度为 150 g / L。由图 1(E)可知，随着水浴温
度的增加，吸光度先增后减，25 ℃时，达到最大值，
当温度继续增加时，体系稳定性下降;随着水浴时间
的延长，吸光度增幅缓慢，选水浴时间 30 ～ 60 min
较为合适。
2． 3 影响火棘多酚含量测定的单因素考察
参照 1． 2． 5 设计，结果见图 2(A ～ E)。
参照 2． 2 的分析，结合图 2(A ～ C)可知，在用
于火棘多酚检测时，福林酚浓度可调整至 0． 4 mol /
L，Na2CO3 溶液浓度可选择 200 g /L，水浴温度选择
25 ℃，水浴时间 60 min较为合适。由图 2(D)可知，
溶液体系的 pH 对总酚含量的测定有一定影响，当
pH ＜3 时，无显著影响，3 ＜ pH ＜ 5 时，随 pH 增加，
吸光度增加，5 ＜ pH ＜ 7 时，随 pH 增加，吸光度减
小。考虑到火棘酚类溶液呈酸性，在酸性条件下贮
藏稳定，因此只考察酸性条件对检测的影响。工业
化生产时，多酚的提取免不了使用乙醇为溶剂，由图
2(E)可知，待检体系中乙醇的含量对多酚检测有一
定影响，随着乙醇浓度的增加，吸光度先增后减，乙
醇浓度为 40 %时达到极值，进一步增大乙醇浓度超
过 80 %时，待检溶液出现浑浊，分析认为是提取液
中少量多糖醇沉析出或 Na2CO3 难溶入乙醇而析
出。
8501 天然产物研究与开发 Vol. 27
0.30
0.29
0.28
0.27
0.26
0.25
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% 0.7% 0.8 100% 160% 200% 260% 300 60
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7 0 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70
福林酚浓度
Concentration%of%Folin鄄ciocalteu%
reagent(mol/L)
碳酸钠浓度
Na2CO3%concentration(mL)
水浴时间
Incubation%time(min)
0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.35
0.34
0.33
032
0.31
0.30
0.29
120% 180% 240
0.185
0.180
0.175
0.170
0.165
0.160
0.155
0.150
0.145
0.164
0.162
0.160
0.158
0.156
0.154
0.152
0.150
火棘总酚溶液体系 pH
pH%of%total%polyphenols%
solution%from%P.fortuneana
火棘总酚提取液中乙醇体积浓度
Volume%conentration%of%ethanol%in%total
polyphenols%solution%form%P.fortuneana
A B C
D E
25%℃
45%℃
35%℃
15%℃
55%℃
图 2 福林酚试剂的浓度(A)、Na2CO3 溶液的浓度(B)、水浴时间及温度(C)、火棘总酚溶液体系 pH值(D)及火棘总酚提
取液中乙醇体积浓度(E)对火棘总酚含量测定的影响．
Fig. 2 Effects of concentration of Folin-Ciocalteu reagent (A)，concentration of Na2CO3(B)，incubation time and temperature
(C) ，pH of total polyphenols solution from P． fortuneanna (D)and ethanol concentration of extraction solution from P． fortu-
neana (E)on total polyphenols of P． fortuneana
2． 4 响应面优化实验
按照 1． 2． 6 设计，具体结果参见表 2。
表 2 Box-Behnken实验设计及结果
Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results
实验序号
No．
水 平 Factors
X1碳酸钠浓度
Na2CO3
concentrations
X2 水浴时间
Incubation time
X3 水浴温度
Incubation
temperature
吸收度
Absorbance
1 -1 -1 0 0． 12
2 1 -1 0 0． 321
3 -1 1 0 0． 148
4 1 1 0 0． 308
5 -1 0 -1 0． 122
6 1 0 -1 0． 31
7 -1 0 1 0． 154
8 1 0 1 0． 304
9 0 -1 -1 0． 254
10 0 1 -1 0． 277
11 0 -1 1 0． 301
12 0 1 1 0． 305
13 0 0 0 0． 302
14 0 0 0 0． 293
15 0 0 0 0． 304
16 0 0 0 0． 308
17 0 0 0 0． 302
9501Vol. 27 张 焕等:响应面法优化火棘总酚含量测定方法
利用 Design-Expert 8． 0． 6 软件，对表 2 结果进
行统计分析，得到三元二次回归方程式:Y = 0． 30 +
0． 087 X1 + 5． 25 × 10
-3 X2 + 0． 013 X3-0． 01 X1X2-9． 5
× 10-3 X1X3-4． 75 × 10
-3 X2X3-0． 07 X
2
1-7． 9 × 10
-53X22-
9． 65 × 10-3 X23 利用 Design-Expert 8． 0． 6 软件，进一
步对实验结果进行统计分析，结果见表 3。
表 3 方差分析表
Table 3 ANOVA of regression analysis
方差来源
Source
平方和
Sum of squares
自由度
Degree of freedom
均方
Mean squares
F值
F values
P值
P values
模型 model 0． 085 9 9． 473 × 10-3 131． 30 ＜ 0． 0001＊＊
X1 0． 061 1 0． 061 846． 50 ＜ 0． 0001 ＊＊
X2 2． 205 × 10-4 1 2． 205 × 10-4 3． 06 0． 1239
X3 1． 275 × 10-3 1 1． 275 × 10-3 17． 67 0． 0040 ＊＊
X1X2 4． 202 × 10-4 1 4． 202 × 10-4 5． 82 0． 0465 *
X1X3 3． 610 × 10-4 1 3． 610 × 10-4 5． 00 0． 0604
X2X3 9． 025 × 10-5 1 9． 025 × 10-5 1． 25 0． 3003
X21 0． 020 1 0． 020 283． 10 ＜ 0． 0001 ＊＊
X22 2． 628 × 10-4 1 2． 628 × 10-4 3． 64 0． 0980
X23 3． 921 × 10-4 1 3． 921 × 10-4 5． 43 0． 0525
残差 Ｒesidual 5． 051 × 10-4 7 7． 215 × 10-5
失拟项 Lack of Fit 3． 843 × 10-4 3 1． 281 × 10-4 4． 24 0． 0983
纯误差 Pure Error 1． 208 × 10-4 4 3． 020 × 10-5
总离差 Cor Total 0． 086 16
Ｒ2 = 0． 9941 Ｒ2Adj = 0． 9865 Ｒ2pred = 0． 9261 CV = 3． 26% 精密度 = 31． 256
注:* 0． 01 ＜ P ＜ 0． 05;＊＊ P ＜ 0． 001。
由表 3 可知，X1、X3、X
2
1 项对响应值影响极显著
(P ＜ 0． 01)，X1X2 项影响显著(0． 01 ＜ P ＜ 0． 05)。
判定系数 Ｒ2 = 0． 9941 说明模型显著，相关性非常
好，实验因素对响应值有较大影响。校正判定系数
Ｒ2Adj = 0． 9865，表明 98． 65%的实验数据的变异性可
以用此回归模型解释。变异系数 CV = 3． 26%，说明
实验的可信度及精确度较好。精确度 ＞ 4 视为合
理，本实验精密度 = 31． 256，表明符合要求。模型 F
值为 131． 30，表明该模型达到极显著水平(P ＜
0. 01)。此外，失拟项 F 值为 4． 24(P = 0． 0985 ＞
0. 05)，说明失拟值和纯误差没有显著性关系，回归
模型在被研究的整个回归区域不失拟，该模型能用
于指导实验。
进一步对模型进行两因素效应分析，结果见图 3。
由图 3(A)可知，Na2CO3 浓度与水浴时间交互
作用显著，吸光度随 Na2CO3 浓度的增加呈现先快
增后减缓的趋势，在 Na2CO3 浓度为 145 g /L左右时
达到极值，Na2CO3 浓度对吸光度影响显著。图 3
(B)表明水浴时间与水浴温度交互作用不显著，相
对而言，水浴温度对吸光度的影响更显著一些。图
3(C)表明，吸光度随 Na2CO3 浓度的增加呈现先快
增后减缓的趋势，在 Na2CO3 浓度为 160 g /L左右时
达到极值，相对而言，Na2CO3 浓度对吸光度影响更
显著。
通过软件(Design Expert 8． 0． 6)分析得到火棘
多酚检测的最适条件为 Na2CO3 浓度 171 g /L、水浴
时间 40． 43 min，水浴温度 33． 97 ℃，在此条件下吸
光度的预测值为 0． 3306。为了验证该响应面结果
的可行性，对所得最佳条件进行了优化和验证实验。
在 Na2CO3 浓度 170 g /L、水浴时间 40 min，水浴温
度 34 ℃条件下进行 5 次实验，所得吸光度分别为
0． 3253、0． 3263、0． 3243、0． 3260、0． 334，平均值为
0. 3277，相对标准偏差为 0． 495%，说明该条件下实
验结果稳定，与预测值的相对误差为 1． 51%，说明
该响应面结果可靠。
2． 5 测定方法评价
2． 5． 1 标准曲线关系考察
配制不同浓度(10、15、20、25、30、35 μg /mL)的
0601 天然产物研究与开发 Vol. 27
0.30
0.25
0.20
0.15
70
60
50
40
30
20
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
0.30
0.25
0.20
0.15
0.305
0.300
0.295
0.290
0.285
0.280
0.275
0.270
0.265
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
水
浴
时
间
In
cu
ba
tio
n%
tim
e(
m
in
)
水
浴
时
间
In
cu
ba
tio
n%
tim
e(
m
in
)
水
浴
时
间
In
cu
ba
tio
n%
tim
e(
m
in
)
6 8 10% 12% 14% 16% 18% 20
碳酸钠浓度 Na2CO3%concentration(g/L)
20% 30% 40% 50% 60% 70
水浴时间 Incubation%time(min)
6 8 10% 12% 14% 16% 18% 20
碳酸钠浓度 Na2CO3%concentration(g/L)
A
B
C
6 8 10
1412 161820 20
30
40
50
60
70
水浴时间
Incubation%time(min)碳酸钠浓度 Na2CO3%
concentration(g/L)
6 810
1412 161820 20
30
40
50
60
70
水浴时间
Incubation%time(min)碳酸钠浓度 Na2CO3%concentration(g/L)
6 8 10
1412 161820 20
30
40
50
60
70
水浴时间
Incubation%time(min)碳酸钠浓度 Na2CO3%
concentration(g/L)
图 3 火棘多酚含量测定响应面及等高线图
Fig. 3 Ｒesponse surface plots and contour plots for the determination of polyphenols content from P． fortuneana
注:A:碳酸钠浓度与水浴时间;B:水浴时间与水浴温度;C:碳酸钠浓度与水浴温度
Note:A:Concentration of Na2CO3 and incubation time;B:Incubation time and temperature;C:Concentration of Na2CO3 and incubation temperature
没食子酸溶液及火棘总酚提取液(0． 4、0． 6、0． 8、
1. 0、1． 2、1． 4 g /L)，按以上试验得出的最适条件显
色后，在 765 nm波长 \测吸光度，分别以没食子酸及
火棘总酚提取液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标
进行线性回归，分别得到线性回归方程为:Y =0． 00111
+0．01682X(Ｒ2 =0． 9983)，Y =0． 04482 +0． 32057xX(Ｒ2
=0． 9965)。结果表明没食子酸及火棘总酚提取液浓
度分别在 10 ～35 μg /mL以及 0． 4 ～1． 4 g /L与吸光度
线性关系良好。其中 y为吸光度，x为浓度。
2． 5． 2 重复性考察
按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为 0． 4、
1． 4 g /L样品 2 份，由同一分析人员在 765 nm 波长
处平行测定 5 次吸光度，记录数据，求相对标准偏差
ＲSD(%)，结果见表 4。
表 4 重复性实验
Table 4 Ｒepeatability tests of the determination results
火棘总酚浓度
Concentration
of total
polyphenols
from
P． fortuneana
(g /L)
吸光度
Absorbance
A1
吸光度
Absorbance
A2
吸光度
Absorbance
A3
吸光度
Absorbance
A4
吸光度
Absorbance
A5
平均值
Average
value
A
标准偏差
SD
相对标准偏差
ＲSD
(%)
0． 4 0． 177 0． 175 0． 173 0． 176 0． 174 0． 175 0． 00158 0． 90%
1． 4 0． 502 0． 501 0． 506 0． 500 0． 501 0． 502 0． 00235 0． 47%
1601Vol. 27 张 焕等:响应面法优化火棘总酚含量测定方法
表 5 重现性实验
Table 5 Ｒeproducibility tests of the determination results
火棘总酚浓度
Concentration
of total
polyphenols
from
P． fortuneana
(g /L)
吸光度
Absorbance
A1
吸光度
Absorbance
A2
吸光度
Absorbance
A3
吸光度
Absorbance
A4
吸光度
Absorbance
A5
平均值
Average
value
A
标准偏差
SD
相对标准偏差
ＲSD
(%)
0． 4 0． 173 0． 170 0． 175 0． 176 0． 174 0． 1736 0． 00230 1． 33%
1． 4 0． 500 0． 498 0． 504 0． 501 0． 503 0． 5012 0． 00239 0． 48%
由表 4 可知，该方法测定 2 份样品的标准偏差
分别为 0． 00158 和 0． 00235，相对标准偏差为
0. 90%和 0． 47%，呈现出良好的重复性。
2． 5． 3 重现性考察
按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为 0． 4、
1． 4 g /L样品 2 份，由不同实验室，不同分析人员在
765 nm波长处平行测定 5 次吸光度，记录数据，求
相对标准偏差 ＲSD(%)，结果见表 5。
由表 5 可知，该方法测定 2 份样品的标准偏差
分别为 0． 00230 和 0． 00239，相对标准偏差为
1. 33%和 0． 48%，呈现出良好的重现性。
2． 5． 4 稳定性考察
按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为 0． 4、
1． 4 g /L样品 2 份，每隔 10 min在 765 nm波长处测
定吸光度，连续测定 6 次。记录数据，求相对标准偏
差 ＲSD(%)，结果见表 6。
表 6 稳定性实验
Table 6 Stability tests of the determination results
火棘总
酚浓度
Concentration
of total
polyphenols
from
P． fortuneana
(g /L)
吸光度
Absorbance
A1
吸光度
Absorbance
A2
吸光度
Absorbance
A3
吸光度
Absorbance
A4
吸光度
Absorbance
A5
吸光度
Absorbance
A6
平均值
Average
value
A
标准偏差
SD
相对标准偏差
ＲSD
(%)
0． 4 0． 177 0． 178 0． 180 0． 180 0． 181 0． 181 0． 1788 0． 0016 0． 92%
1． 4 0． 502 0． 502 0． 504 0． 505 0． 506 0． 506 0． 5033 0． 0018 0． 36%
由表 6 可知，该方法测定 2 份样品的标准偏差
分别为 0． 0016 和 0． 0018，相对标准偏差为 0． 92%
和 0． 36%，表明样品在 1 h内检测稳定。
2． 5． 5 加标回收率测定
取 5 份浓度为 0． 4 mg /mL火棘总酚提取液 1． 0
mL，分别加入没食子酸 0． 2 mg，按以上实验确定的
最适条件，测定 5 份样品的吸光度并计算混合后的
总酚含量。计算回收率及相对标准偏差，结果见表
7。
表 7 没食子酸加样回收率实验(n = 5)
Table 7 Ｒecovery tests of gallic acid (n = 5)
火棘总酚吸光度
Absorbance
总酚原有量
Original
amount
(mg)
没食子酸加入量
Added
amount
(mg)
总酚测得量
Detected
amount
(mg)
回收率
Ｒecovery
rate
(%)
平均值
Average
value
(%)
相对标准偏差
ＲSD
(%)
0． 2 0． 5988 99． 8%
0． 2 0． 5998 99． 97%
0． 177 0． 4 0． 2 0． 6007 100． 12% 99． 95% 0． 12%
0． 2 0． 5995 99． 92%
0． 2 0． 5996 99． 93
2601 天然产物研究与开发 Vol. 27
由表 7 可知，该方法的相对标准偏差仅为
0. 12%，具有较高的回收率 99． 95%。
3 结论
通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘
总酚含量的定量方法。结果表明，火棘总酚的最适
检测条件为:1 mL 适宜浓度的火棘总酚提取物，加
入 0． 4 mol /L 福林酚试剂 5 mL，漩涡混匀后，加入
170 g /L Na2CO3 溶液 1 mL，混匀后于 34 ℃水浴反
应 40 min，冰水中快速冷却，室温条件下于 765 nm
波长测吸光度。该方法具有极好的重复性及重现
性，1 h内检测稳定性高，回收率高达 99． 95%，测定
时虽然待测液体系 pH及乙醇浓度对吸光度有一定
的影响，但因为待检样品液检测时都被预先稀释了
很多倍或通过待检体系得以稀释，因此可忽略待测
液体系 pH及乙醇浓度的影响。该方法可推广应用
于其它植物总酚含量的检测。
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