全 文 ：收稿日期:2014 －03 －18
基金项目:国家创新训练项目(项目编号:201310920008)。
作者简介:张云(1991— ) ，男，2011级药学专业本科生。
* 通讯作者:吴伟(1979— ) ，男，讲师，博士，研究方向:生物技术制药。
doi:10． 3969 / j． issn． 2095 －4565． 2014． 05． 012
响应面法优化火棘果中黄酮类化合物提取
工艺的研究
张 云，朱晨欣，徐晓燕，李 格，曾倩兰，王嫣然，吴 伟*
(湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)
摘 要:采用乙醇回流提取方法，以单因素试验结果为依托，利用 Design － Expert 软件中 Box － Behnken
模型探索提取时间、提取浓度及提取温度对黄酮类化合物提取率的影响。结果表明，提取时间、提取浓度
及提取温度对提取率的影响极为显著，得到最佳提取工艺的条件为:提取时间4 h、乙醇体积分数80． 6%、
提取温度 71 ℃。以此条件进行试验，得到火棘果中黄酮类化合物的提取率为 1． 268%，与理论提取率
1． 270%较接近。
关键词:火棘果;黄酮;响应面
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:2095 －4565(2014)05 －0048 －05
Optimization of Extraction Conditions of Flavonoids in Pyracantha
Fortuneana by Ｒesponse Surface Methodology
Zhang Yun，Zhu Chenxin，Xu Xiaoyan，Li Ge，Zeng Qianlan，Wang Yanran，Wu Wei*
(School of Medicine，Hubei Polytechnic University，Huangshi Hubei 435003)
Abstract:The extraction conditions of flavonoids in Pyracantha fortuneana were optimized by response surface
methodology． The effects of ethanol concentration，temperature and extraction time were studied． The optimal
extraction conditions were as follows:extraction time 4 h，temperature 71 ℃，and ethanol concentration
80． 6% ． Under these optimal conditions，the extraction efficiency of flavonoids was 1． 268% ． The extraction
process was feasible and could be used in the industrial production．
Key words:Pyracantha fortuneana;flavonoids;response surface
黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于
自然界的、具有 2 － 苯基色原酮(flavone)结构
的化合物。它们的分子中有一个酮式羰基，第
一位上的氧原子具碱性，能与强酸反应成盐，
其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄
酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合
成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。
绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在
植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等
方面起着重要的作用。
火棘果(Pyracantha fortuneana)为蔷薇科
植物，又名救命粮、赤阳子、红子等，广泛分布
于湖北、湖南、四川等省区，且产量极大。据初
步调查，目前在湖北发现的火棘有 4 种，仅恩
施州年产火棘果可达 3 × 107 kg，全省年均产
果近 5 × 107 kg。火棘果的药效作用主要包
括:①促进消化，改善体内循环，促进新陈代
谢，增强体力和免疫力;②能清除机体中有害
第 30卷 第 5期
2014年 10月
湖 北 理 工 学 院 学 报
JOUＲNAL OF HUBEI POLYTECHNIC UNIVEＲSITY
Vol． 30 No． 5
Oct． 2014
氧自由基的影响，抑制脂质过氧化过程，从而
具有很强的抗氧化功能，这可能是其抗衰老、
降血脂、美白、清除体内垃圾、减肥等保健功效
的药理基础［1 － 3］。但近几年对火棘果的研究
多在营养成分、功效方面，对其有效成分的提
取鲜有报道。本文利用响应面优化试验对火
棘果中黄酮类化合物提取工艺进行探索，为充
分利用火棘果资源提供便利［4 － 5］。
1 材料与试剂
1 ． 1 材料
火棘果，采自湖北理工学院校园内，阴干，
粉碎，并过 60 目筛，装袋保存于真空干燥器内
备用。
1 ． 2 药品与仪器
芦丁标准品，色谱纯，上海源叶生物科技
有限公司;无水乙醇，分析纯，天津市天力化学
试剂有限公司;ＲE － 3000 旋转蒸发器，上海
亚荣生化仪器厂;SHZ － Ⅲ型循环水式真空
泵，上海亚荣生化仪器厂;120B 型高速粉碎
机，瑞安市春海药材仪器厂;UV752 型紫外分
光光度计，上海力权仪器有限公司;AL204 电
子分析天平，瑞士梅特勒 － 托利多公司;HH －
8 电热恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司。
1 ． 3 试验方法
1． 3 ． 1 标准溶液的配置及标准曲线的制备
准确量取芦丁标准品溶液(100 μg / mL)
0 ． 0 mL，5 ． 0 mL，10 ． 0 mL，15 ． 0 mL，20． 0 mL，
25mL 于 50 mL 容量瓶中，分别加入 4 ． 0 mL 氯
化铝溶液及 6 ． 0 mL 醋酸钠溶液［4］，摇匀后显
色 5 min，用 70%乙醇定容。则芦丁标准品浓
度分别为 0 μg / mL，10 μg / mL，20 μg / mL，
30 μg /mL，40 μg / mL，50 μg / mL。以 70% 乙
醇为空白对照，在波长 418 nm 处测定吸光度
(A) ，以浓度(C)为纵坐标，吸光度(A)为横坐
标绘 制 标 准 曲 线，所 得 标 准 曲 线 为:C =
45． 605 A － 0 ． 9189，Ｒ2 = 0 ． 9995，在浓度为
0 ～ 50 μg / mL 时线性关系良好。
1 ． 3 ． 2 黄酮类化合物提取率的计算
将提取溶液准确定容于 100 mL 容量瓶
中，准确量出 10 mL 于 50 mL 容量瓶中，加入
4 ． 0 mL 氯化铝溶液及 6 ． 0 mL 醋酸钠溶液，摇
匀并在室温下显色 5 min，用 70%乙醇准确定
容，在波长 418 nm 处测定吸光度，并计算其相
应提取率。
提取率(%)= (C × 500 × 10 －6)/ m，
式中:C(μg / mL)为提取溶液中黄酮类化合物
的浓度，m(g)为火棘果粉末质量。
1 ． 3 ． 3 单因素试验
利用石油醚作为提取溶媒，采用索氏提取
法对火棘果粉末进行脱色处理、烘干［6］，准确
称取适量已烘干粉末于圆底烧瓶中，加入提取
剂，回流提取，然后抽滤得到滤液，测定滤液中
黄酮类化合物的含量。单因素试验分别考察
乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间对火
棘果中黄酮类化合物提取率的影响。
1 ． 3 ． 4 响应面优化试验
根据响应面分析方法(ＲSM)中 Box － Be-
hnken Design (BBD)的中心组合试验设计原
理，在单因素试验的基础上，建立以提取时间、
乙醇浓度和提取温度为自变量的 3 因素 3 水
平的响应面分析法，3 个自变量分别以 X1、X2
和 X3 表示。响应面试验因素水平设计如表 1
所示，其中 － 1、0 和 1 分别为各因素低、中、高
水平，利用 Design － Expert V8 ． 0 ． 6 ． 1 进行响
应面试验设计，以黄酮化合物提取率作为各因
素的响应值来进行响应面分析，确定火棘果黄
酮类化合物的最佳工艺条件。
表 1 响应面试验因素水平
因素
水平
－1 0 1
提取时间(X1) 3． 5 h 4． 0 h 4． 5 h
乙醇浓度(X2) 75% 80% 85%
提取温度(X3) 65 ℃ 70 ℃ 75 ℃
2 结果与分析
2 ． 1 单因素试验
2 ． 1 ． 1 乙醇浓度对火棘果中黄酮类化合物提
取率的影响
在料液比 1 ∶ 20(g /mL)、提取时间 4 ． 0 h 及
提取温度为 70 ℃的条件下探索不同乙醇浓度
对黄酮类化合物提取率的影响关系。乙醇浓
第 5 期 张 云，朱晨欣，徐晓燕，等:响应面法优化火棘果中黄酮类化合物提取工艺的研究 49
度对黄酮类化合物提取率的影响如图 1 所示。
由图 1 可以看出，随着乙醇浓度的改变，黄酮
类化合物的提取率先上升然后下降，且知最大
提取率出现在乙醇浓度 75% ～ 85%之间。
图 1 乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响
2． 1． 2 料液比对火棘果中黄酮类化合物提取
率的影响
在乙醇浓度 70%、提取时间为 4． 0 h 及提取
温度为 70 ℃的条件下探索不同料液比对黄酮类
化合物提取率的影响。料液比对黄酮类化合物
提取率的影响如图 2 所示。由图 2 可知，随着料
液比的增加，火棘果中黄酮类化合物的提取率迅
速增加。但当料液比达到 1 ∶ 20(g /mL)后，随着
提取溶剂的继续增加，提取率趋于稳定，因此响
应面试验中料液比定为 1∶ 20(g /mL)为宜。
图 2 料液比对黄酮类化合物提取率的影响
2 ． 1 ． 3 提取温度对火棘果中黄酮类化合物提
取率的影响
在料液比 1 ∶ 20 (g /mL)、提取时间为 4 ． 0 h
及提取浓度 70% 的条件下探索不同提取温度
对黄酮类化合物提取率的影响。提取温度对
黄酮类化合物提取率的影响如图 3 所示。由图
3 可知，随着提取温度的增加，黄酮类化合物的
提取率先增加后减少，猜测原因是在高温下黄
酮类化合物发生结构变化从而降低了其提取
率［7］。最佳提取温度出现在 65 ～ 75 ℃之间。
图 3 提取温度对黄酮类化合物提取率的影响
2． 1． 4 提取时间对黄酮类化合物提取率的影响
在提取浓度 70%、提取温度 70 ℃及料液比
1∶ 20(g / mL)的条件下探索不同提取时间对黄酮
类化合物提取率的影响。提取时间对黄酮类化
合物提取率的影响如图 4 所示。由图 4 可知，随
着提取时间的增加，黄酮类化合物的提取率先增
加后减少。可能是持续的加热增加了黄酮类化
合物结构改变的几率，故而当提取时间增加时提
取率反而下降。最佳提取时间出现在 3． 5 ～ 4． 5
h 范围内。
图 4 提取时间对黄酮类化合物提取率的影响
2． 1． 5 提取次数对黄酮类化合物提取率的影响
在提取浓度 70%、提取温度 70 ℃、提取时
间 4 ． 0 h 及料液比 1 ∶ 20(g /mL)的条件下探索
不同提取次数对黄酮类化合物提取率的影响。
提取次数对黄酮类化合物提取率的影响如图 5
所示。由图 5 可知，当提取次数小于 4 次时，随
着提取次数的增加，黄酮类化合物的提取率有
较大增加，但当提取次数达到 4 次时，提取率
趋于平稳。为节约成本，响应面试验中提取次
50 湖 北 理 工 学 院 学 报 2014 年
数定为 4 次。
图 5 提取次数对黄酮类化合物提取率的影响
2． 2 响应面优化试验
2 ． 2 ． 1 响应面试验因素水平的选取
在单因素试验的基础上，选取提取时间、
提取浓度及提取温度 3 个因素为响应面试验中
的因素，黄酮类化合物的提取率为响应值，其
相应水平见表 1。
2 ． 2 ． 2 响应面试验结果
利用 Design － Expert V8 ． 0 ． 6 ． 1 中 Box －
Behnken 模型，按照表 1 中的因素水平进行试
验。对因素 X1 作(X1 － 4 ． 0)/0 ． 5 变换，因素
X2 作(X2 － 80%)/5% 变换，因素 X3 作(X3 －
70)/5 变换，将因素水平变换成其编码值，响
应面试验设计及结果如表 2 所示。
表 2 响应面试验设计及结果
Ｒun X1 X2 X3 提取率(%)
1 － 1 － 1 0 0． 857 0
2 0 － 1 － 1 0． 875 0
3 1 1 0 0． 812 5
4 － 1 0 － 1 0． 840 0
5 0 0 0 1． 248 0
6 － 1 0 1 0． 932 5
7 0 － 1 1 1． 003 0
8 1 0 1 0． 827 5
9 0 1 － 1 0． 960 5
10 0 1 1 1． 051 5
11 0 0 0 1． 261 5
12 0 0 0 1． 263 0
13 1 － 1 0 0． 662 0
14 0 0 0 1． 259 5
15 － 1 1 0 0． 876 0
16 0 0 0 1． 258 5
17 1 0 － 1 0． 665 0
2 ． 2 ． 3 响应面试验结果的分析
利用 Design － Expert 软件对表 2 中数据进
行方差分析，经过二次回归拟合后，得出拟合
方程式:
A = 1． 26 － 0． 067X1 + 0 ． 038X2 + 0． 059X3 +
0 ． 033X1X2 + 0 ． 017X1X3 － 0 ． 009X2X3 － 0． 31X1
2
－ 0 ． 15X2
2 － 0 ． 14X3
2 (1)
响应面试验结果的方差分析结果如表 3
所示。由表 3 可知，模型的 P 值小于0． 000 1，
表明模型方程拟合极显著(P ＜ 0 ． 001) ，可以
满足此次试验，其 Ｒ2 = 0 ． 9911。且因素 X1，
X2，X3，X1
2，X2
2 和 X3
2 的 P 值均小于0． 000 1，
表明其对火棘果中黄酮类化合物提取率的影
响极显著(P ＜ 0． 001) ，交互项 X1 X2 和 X1 X3 的
P 值小于 0 ． 05，表明其对火棘果中黄酮类化
合物提取率的影响显著(P ＜ 0 ． 05) ，上述结果
表明 3 个因素对响应值提取率的影响不是简
单的线性关系［8］，与相应方程吻合。此外，表
3 中的结果还显示方程的失拟项中 F 值仅为
3 ． 6，表明该方程对试验结果拟合度良好，试
验误差小，因此，可用该回归方程对试验结果
进行分析和预测。对提取率影响的大小顺序
依次为提取时间、提取温度和乙醇浓度，其中
提取时间对黄花菜多糖提取率的影响最为显
著。
影响因素的交互作用对提取率的影响如
图 6 所示。图 6a 为提取时间(X1)与提取浓
度(X2)对火棘果中黄酮类化合物提取率影响
的相应曲面图;图 6b 为提取时间(X1)与提取
提取温度(X3)对火棘果中黄酮类化合物提取
率影响的相应曲面图;图 6c 为提取浓度(X2)
与提取温度(X3)对火棘果中黄酮类化合物提
取率影响的相应曲面图。由图 6 可知，提取时
间对黄酮化合物提取率的影响最为显著，表现
为曲线坡度较陡;而提取温度和乙醇浓度次
之，表现为较提取时间的曲线更为平滑，且随
其数值的增加而减小，相应值变化较小。
根据响应面模型得到的优化条件为:提取
时间为 3 ． 95 h，乙醇浓度为 80 ． 55%，提取温
度为 71 ． 04 ℃。按照此条件，且在料液比1∶ 20
(g / mL)、提取次数为 4 次的条件下，黄酮类化
合物提取率理论上可达 1 ． 270%。
第 5 期 张 云，朱晨欣，徐晓燕，等:响应面法优化火棘果中黄酮类化合物提取工艺的研究 51
表 3 响应面试验结果的方差分析
Source Sum of squares df Mean squares F value p － value
Model 0． 70 9 0． 078 1 057． 31 ＜ 0． 000 1
X1 0． 036 1 0． 036 490． 77 ＜ 0． 000 1
X2 0． 012 1 0． 012 155． 89 ＜ 0． 000 1
X3 0． 028 1 0． 028 380． 25 ＜ 0． 000 1
X1X2 4． 323E － 003 1 4． 323E － 003 58． 53 0． 000 1
X1X3 1． 225E － 003 1 1． 225E － 003 16． 59 0． 004 7
X2X3 3． 422E － 004 1 3． 422E － 004 4． 63 0． 068 3
X1
2 0． 39 1 0． 39 5 346． 26 ＜ 0． 000 1
X2
2 0． 095 1 0． 095 1 282． 46 ＜ 0． 000 1
X3
2 0． 077 1 0． 077 1 048． 41 ＜ 0． 000 1
Ｒesidual 5． 170E － 004 7 7． 386E － 005
Lack of fit 3． 773E － 004 3 1． 258E － 004 3． 60 0． 123 9
SD 8． 594E － 003 Ｒ2 0． 999 3
Mean 0． 98 Adjusted Ｒ2 0． 998 3
C． V． % 0． 88 Predicted Ｒ2 0． 991 1
PＲESS 6． 255E － 003 Adequate precision 90． 171
图 6 影响因素的交互作用对提取率的影响
3 结论
通过响应面分析法优化了火棘果中总黄
酮的提取工艺，为便于操作，将最佳提取时间
修正为 4 h，乙醇浓度修正为 80 ． 6%，提取温
度修正为71 ℃。单因素试验确定了料液比为
1 ∶ 20、提取次数为 4 次。采用上述最优条件，进
行了提取黄酮化合物的验证试验，并且重复了 3
次，得到的平均提取率为 1． 268%，与预测值基本
相符，说明响应面优化法对火棘果黄酮提取条件
的优化是可行的。
参 考 文 献
［1］ 柴立，郑亚玉，谢宝忠，等．赤阳子开发应用系列
研究之一赤阳子营养成分及保健作用研究
［J］．贵阳中医学院学报，1988(1) :39 － 40．
［2］ 薛慧，侯建军，李玉山．火棘对高脂饮食大鼠血
液流变学的影响［J］．湖北民族学院学报(医学
版) ，2001，18(4) :8 － 9．
［3］ 韦忠恒，胡柳，黄剑娴．火棘果汁干预砷中毒小
鼠肝功能损害指标的变化［J］．中国临床康复，
2006，10(23) :99 － 101．
［4］ 甘秀海，赵超，周欣，等．火棘果中黄酮类化合物
的提取工艺研究［J］．广州化工，2012，40(8) :
78 － 79．
［5］ 梁淑芳，马绒利，马柏林．火棘黄酮类化合物的
提取及微乳薄层色谱分离鉴定［J］． 西北林学
院学报，2003，18(3) :60 － 62．
［6］ 甘秀海，陈华国，周欣，等．火棘果中总黄酮的含
量测定［J］． 光谱实验室，2012，29(2) :1223 －
1226．
［7］ 冯纪南，赵丽萍，黄海英，等．甘蔗叶中黄酮类化
合物的提取工艺研究［J］．食品科技，2012(4) :
219 － 223．
［8］ 孙哲浩，李宝珍，赵谋明，等． 响应面分析法优
化荔枝核总黄酮提取工艺的研究［J］． 食品与
机械，2006，22(1) :30 － 32．
(责任编辑 吴鸿霞)
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