全 文 ：食品研究与开发 2007.Vol.28.NO.08
图6 提取次数对总黄酮得率的影响
Fig.6 Efectoftheextractiontimesonyieldoftotalflavonoids
作者简介:黄永春(1974-),男,博士,副教授,研究方向:多糖类物质的制备与利用。
实验中得到的川桂叶总黄酮的得率都高于单因素试验
和正交试验的每次结果,所选取的工艺A1B2C3D2确为
最佳工艺。
2.4 提取次数的确定
称取5.000g川桂叶粉,在正交试验确定的最佳工
艺条件下,分别微波提取1、2、3、4次,结果如图6所示。
由图6可以看出,随着提取次数的增加,累计总黄
酮得率增大,但增大的幅度逐渐减小,当提取次数超过
2次后,增大的幅度很小,从设备利用率和经济效益考
虑,确定提取次数为2次,总黄酮得率为22.36mg/g。
3 结论
1)首次从川桂叶中提取黄酮类化合物,为川桂资
源的开发利用提供理论依据。
2)微波法提取川桂叶总黄酮最佳工艺条件是:乙
醇浓度65%,固液比1∶20(g/mL),提取温度85℃,提取
时间9min,连续提取2次,总黄酮得率为22.36mg/g。
3)微波提取是一种现代提取技术,提取效率高,能
有效降低生产成本,提高经济效益。
参考文献:
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收稿日期:2006-12-29
黄永春 1,杨锋 1,段玉峰 2
(1.广西工学院生物与化学工程系,广西 柳州 545006;2.陕西师范大学食品工程系,陕西 西安 710062)
火棘水溶性多糖PP-A3理化性质研究
摘 要:对火棘水溶性多糖的PP-A3组分的理化性质进行了研究。结果表明:PP-A3的分子量约为210000u,其主要
由阿拉伯糖组成,其中含有少量的葡萄糖和果糖,阿拉伯糖∶葡萄糖∶果糖=1.62∶1∶1.59,此外含氨基酸总量约为0.5%。
关键词:火棘;多糖;分子量;理化性质
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科学研究
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食品研究与开发2007.Vol.28.NO.08
STUDYONPHYSICOCHEMICALPROPERTYOFPP-A3FROMWATER-SOLUBLEPYRACANTHA
FORTUNEANAPOLYSACCHARIDES
HUANGYong-chun1,YANGFeng1,DUANYu-feng2
(1.DepartmentofBiologicalandChemicalEngineering,GuangxiUniversityofTechnology,Liuzhou545006,Guangxi,
China;2.DepartmentofFoodEngineering,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710062,Shaanxi,China)
Abstract:ThephysicochemicalpropertiesofPP-A3fromwater-solublePyracanthafortuneanapolysaccharides
werestudiedinthispaper.TheresultsindicatedthatmolecularweightofPP-A3isabout210000u,anditwas
composedofarabinose,glucoseandfructoseinamolarratioof1.62∶1∶1.59andsomeaminoacidswhosetotal
contentis0.5%.
Keywords:pyracanthafortuneana;polysaccharides;molecularweight;physicochemicalproperty
多糖是一类重要的生物活性物质,广泛存在于动
物、植物、微生物等有机体中。它是自然界中储量丰
富的天然高分子,主要包括植物多糖、动物多糖以及
微生物多糖 3类。由于多糖有多种多样的生物活性,
以及在功能食品和临床上的广泛使用,使其研究成
为近年来的热点。其中从植物中提取的水溶性多糖
具有非常重要与特殊的生理活性,如免疫调节、抗肿
瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗病毒、抗炎、抗疲劳、
抗衰老等[1]。
火棘(Pyracanthafortuneana(Maxim.)Li)果实,又叫
赤阳子、救军粮,主要分布于我国东南和西南部,也是
秦巴山区主要野生植物之一 [2]。火棘始载于《滇南本
草》,其果实性味干酸,药用具有健脾消积、生津止渴、
清热解毒、活血止血等功效[3]。近年来的研究表明,火棘
果实具有很大的药用和食用开发价值[4]。有文献报道火
棘果实总提取物具有消除自由基、降血脂、增强免疫
力、增强体力和促进消化等作用[5]。
为了进一步开发火棘野生资源,在对秦巴山区产
火棘果实中水溶性多糖的提取、分离纯化及纯度鉴定
等[6-7]基础上,对火棘多糖组分PP-A3进行理化性质研
究,为进一步阐明火棘多糖构效关系作了前期工作。
1 材料、试剂及仪器
1.1 材料
火棘(Pyracanthafortuneana(Maxim.)Li)果实,采自
秦巴山区镇巴县。
1.2 试剂
DE-32:WhatmanInternationalLtd.;SephadexG-
200:Pharmacia公司;LSA大孔吸附树脂:西安蓝深
交换吸附材料有限公司;标准单糖:上海试剂二厂;
Dextran标准分子量:Pharmacia公司;其它试剂均为
分析纯。
1.3 仪器
DHL-A电脑恒流泵、DBS-100电脑全自动部分
收集器:上海沪西分析仪器厂;层析柱(2.5×45cm和
1.1×120cm):自制;RE-52A型旋转蒸发器:上海亚荣
生化仪器厂;真空冷冻干燥器:德国 Christ公司;稳压
稳流电泳仪Dy-3型:江苏兴化分析仪器厂;TU-1901
UV-VISSpectrophotometer:北京普析通用仪器有限公
司;超速离心机 L8-80:美国贝克曼公司;AgilentGC
6890N:美国安捷伦科技有限公司;FouriertransformIn-
fraredSpectrometerEQUINOX55型:德国 Brucher;
Beckman121MB型氨基酸自动分析仪:美国贝克曼公
司;DPS数据处理系统:浙江大学。
2 方法
2.1 火棘水溶性多糖的提取及分离纯化
称取火棘粉末,加石油醚(70℃~90℃)回流脱脂两
次,回收石油醚,固形物中加入热水于水浴中浸取,提取
液经减压浓缩、乙醇沉淀、冷冻干燥得火棘粗多糖。
对火棘粗多糖,通过蛋白酶-Sevag法脱除蛋白,乙
醇分级沉淀,并经 DE-52(Cl-型)柱层析分离纯化,得
到 PP-A2、PP-A3、PP-A4和 PP-B1、PP-B2、PP-B36
种级分[6-7]。
2.2 理化性质分析
作为前期工作,本文对PP-A3组分进行理化性质
研究。
2.2.1 分子量测定
用 SephadexG-200柱(1.1cm×120cm),分别以
DextranT-500、T-70、T-40、T-10葡聚糖标准品进行凝
胶层析,各上样 5mg,用 0.1mol/LNaCl洗脱,流速为
1.0mL/10min,每管收集 1.5mL,苯酚-硫酸法检测,分
别求得相应的洗脱体积Ve,再用蓝色葡聚糖T-2000上
柱,求得柱的外水体积Vo,以Ve/Vo为横坐标,LgMr为
科学研究
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食品研究与开发 2007.Vol.28.NO.08
表1 火棘多糖PP-A3的理化性质
Table1 PhysicochemicalpropertiesofPP-A3fromwater-solublePyracanthafortuneanapolysaccharides
碘-碘化钾反应
I2-KIreaction
-
茚三酮反应
Ninhydrinreaction
+
斐林试剂反应
Fehlingreaction
-
硫酸-咔唑反应
Sulfuricacid-carbazole
reaction
+
三氯化铁反应
Fericchloride
reaction
-
颜色、状态
Color&status
白色粉末
CTAB络合反应
CTABcomplexing
reaction
+
紫外吸收光谱
Ultravioletabsorption
spectrum
280nm
有吸收
纵坐标,绘制分子量标准曲线。将待测分子量的PP-A3
样品 5mg,溶于最小体积的 0.1mol/LNaCl中,按照
Dextran标准品层析条件操作,求得相应的洗脱体积,
得到Ve/Vo值,查标准曲线可得PP-A3组分的分子量。
2.2.2 理化性质分析
碘-碘化钾反应;茚三酮反应;斐林试剂反应;硫
酸-咔唑反应;三氯化铁反应;十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB)络合反应;紫外吸收光谱;红外吸收光谱。
2.2.3 单糖组分分析
采用气相色谱法对单糖组分进行分析。将上述
20mg多糖样品水解物、标准单糖各 10mg及 10mg
混合标准单糖在五氧化二磷干燥器中干燥 24h,以
0.2mL吡啶溶解,加六甲基二硅胺烷-三甲基氯硅烷
(2∶1)0.2mL,于60℃烘箱中放置10min,离心除去沉
淀,进样。气相色谱条件是:OV-17毛细柱,FID检测器,
气化温度180℃～250℃(5℃/min),检测器温度300℃,
进样口温度155℃,N2为载气流速46mL/min,进样量
1μL。
2.2.4 氨基酸分析
多糖样品用6.0mol/LHCl溶液110℃真空充氮封
管水解24h,利用Beckman121MB型氨基酸自动分析
仪分析氨基酸含量。
3 结果与分析
3.1 分子量
蓝色葡聚糖 T-2000测得 SephadexG-200柱
(1.1cm×120cm)的外水体积 Vo为 49mL,葡聚糖标
准品 DextranT-500、T-70、T-40、T-10的洗脱体积 Ve
分别为 50mL、78mL、91.5mL、112mL,按 Ve/Vo-LgMr
关系作图得分子量测定标准曲线,如图1。
根据多糖 PP-A3在 SephadexG-200柱(1.1cm×
120cm)上的洗脱体积为93mL,可计算出其相对分子
质量约为210000。
3.2 理化性质
火棘多糖PP-A3组分的理化性质测试结果见表1。
由表1可知,PP-A3与碘-碘化钾反应不显蓝色,
说明它是非淀粉类多糖;其斐林试剂反应、三氯化铁反
应均为阴性,硫酸-咔唑反应、十六烷基三甲基溴化铵
络合反应均为阳性,表明它不含单糖、多酚类物质,都
含有糖醛酸、且均为酸性多糖类物质;茚三酮反应和紫
外吸收光谱表明PP-A3中含有蛋白质。
图1分子量标准曲线
Fig.1 Standardcurveofmolecularweight
PP-A3红外吸收光谱见图2: 由红外光谱分析结果可知,PP-A3在 3422cm-1、
3410cm-1、2931cm-1、1653cm-1、1617cm-1、1423cm-1、
1397cm-1、1123cm-1、1039cm-1、994cm-1和843cm-1左右
有很强的吸收峰,3422cm-1、3410cm-1吸收峰是多糖
上的羟基及样品中含有的水分产生的,2931cm-1附近
的肩峰是-CH、-CH2的伸缩振动信号,1617cm-1、
1653cm-1是糖醛酸残基中羧基的特征吸收,1423cm-1、
1397cm-1附近的吸收峰也表明-CH的存在,1123cm-1、
1039cm-1表明其中含有吡喃环,994cm-1和 843cm-1
的特征吸收,表明其中含有β-糖苷键和少量 α-糖苷
键(840cm-1附近)。
Wavenumbers/cm-1
图2 PP-A3红外光谱图
Fig.2 InfraredspectrumofPP-A3
Tr
an
sm
it
ta
nc
e/
%
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图4 气相图谱
Fig.4 GaschromatogramofPP-A3
图3 混合标准单糖气相图谱
Fig.3 Gaschromatogramofmixedstandardmonosaccharides
3.3 单糖组分分析
标准混合单糖气相图谱和 PP-A3的气相图谱分
别如图3、图4所示。
与单一标准单糖的气相色谱保留时间对照,可知
图3中各峰所代表的单糖组分,结果如表2。
表2 混合标准单糖气相色谱图解析
Table2 Analysisforgaschromatogramofmixedstandardmonosaccharides
保留时间
Retentiontime/min
4.404
4.517
5.326
6.616
单糖组分
Monosaccharides
阿拉伯糖
鼠李糖
木糖
果糖
峰面积
Peakarea(pA*s)
2169.67
1397.62
854.32
峰#
Peak#
10
11
12
13
保留时间
Retentiontime/min
7.068
7.17
7.532
7.71
峰#
Peak#
1
2
5
9
单糖组分
Monosaccharides
半乳糖
山梨糖
葡萄糖
甘露糖
峰面积
Peakarea/(pA*s)
979.94
1048.29
1839.02
1675.28
注:未标明的峰不是所测单糖的特征峰。阿拉伯糖和鼠李糖各自峰面积几乎相同,之和为2169.67。
通过对比图4和图3,根据表3可确定PP-A3主
要是由阿拉伯糖组成的,其中含有少量的葡萄糖和果
糖。图4中保留时间为8.696min的峰(葡萄糖衍生副
产物)显得很大,是由于 PP-A3水解物衍生后的气相
色谱分析效果很差,FID的响应值很小,此图是经过放
大的。PP-A3水解物衍生后的气相色谱分析效果很差
可能是由于其中含有蛋白质的缘故。气相色谱图谱分
析结果同时表明 PP-A3中各糖残基物质的量的比大
约为:阿拉伯糖∶葡萄糖∶果糖=1.62∶1∶1.59。
3.4 氨基酸含量
氨基酸含量分析结果见表3。
由表3可知,虽然使用了蛋白酶-Seveg法脱蛋白,
达到了比较好的效果,粗多糖溶液在280nm处已经没
有了特征吸收[6-7];然而经过两次不同的柱层析后得到
的PP-A3经紫外扫描,在280nm处仍有特征吸收,其
蛋白含量大约为0.5%。这可能是由于柱层析不仅分离
纯化了多糖,同时对其中的蛋白质进行了富集。另一方
面可能是因为脱蛋白后进行的紫外扫描只是个定性分
析,并没有测多糖含量,也许是分析时样品浓度太低所
致的误差。
4 结论
通过对火棘多糖经分离纯化得到的组分之一PP-
A3进行理化性质研究,表明PP-A3的相对分子质量
约为 210000,其主要是由阿拉伯糖组成的,其中含有
少量的葡萄糖和果糖,以及约0.5%的蛋白质。各糖残
基物质的量的比大约为:阿拉伯糖∶葡萄糖∶果糖=1.62∶
1∶1.59。
火棘多糖其它级分的理化性质有待进一步研究。
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Table3 AminoacidcontentsofPP-A3
(Asp)
(Thr)
(Ser)
(Glu)
(Pro)
(Gly)
(Ala)
(Val)
(Cys)
含量
Content/
(mg/100g)
51.22
26.92
27.12
0.62
29.2
28.56
27.07
24.58
0
氨基酸
Aminoacid
蛋氨酸
异亮氨酸
亮氨酸
酪氨酸
苯丙氨酸
赖氨酸
组氨酸
精氨酸
色氨酸
(Met)
(Ile)
(Leu)
(Tyr)
(Phe)
(Lys)
(His)
(Arg)
(Trp)
含量
Content/
(mg/100g)
23.33
44.34
53.4
39.46
35.18
39.07
9.802
27.66
未测
氨基酸
Aminoacid
天冬氨酸
苏氨酸
丝氨酸
谷氨酸
脯氨酸
甘氨酸
丙氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
科学研究
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食品科学,2005,21(1):157-160
收稿日期:2006-12-30
基金项目:武汉市重大攻关项目(2002600513422)
作者简介:姚晓玲(1962-),女(汉),副教授,主要从事食品加工新技
术研究工作。
脑血栓、肺血栓、急性心肌梗塞等血栓性疾病正严
重危害着人类健康。高效、廉价、无副作用的溶栓药物
的研究一直是医学界的关注热点。
溶栓酶(Plasmin)是一种催化纤维蛋白水解并导
致血管内血凝块溶解的蛋白水解酶,广泛存在于生物
体中,动物如虻虫纤溶酶、蚯蚓纤溶酶;植物如蒲黄纤
溶酶;微生物如纳豆激酶、豆豉溶栓酶等。
微生物发酵法生产的溶栓酶不仅具有很好的溶
栓效果,还具有产量大、成本低、周期短的优点,是目
前生物医学研究的一个重要方向。本研究是在从豆
豉中筛选到一株溶栓酶高产菌基础上[1-2],对豆豉溶
栓酶的 15L发酵罐发酵液进行提取纯化和测定分子
量研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
枯草芽孢杆菌HGD107(BacilussubtilisHGD107),
湖北省工业微生物重点实验室筛选。
1.2 主要试剂
SephadexG-100:上海华美生物工程公司;D392树
脂:天津南开大学树脂厂;717树脂:上海振光树脂厂;
SDS-PAGE标准蛋白:美国Sigma。其他试剂均为进口
或国产分析纯。
姚晓玲,孟凡涛,吴思方
(湖北工业大学生物工程学院,湖北 武汉 430068)
豆豉溶栓酶提取纯化研究
摘要:对豆豉溶栓酶发酵液进行提取、脱色,盐析,超滤脱盐,冷冻干燥等纯化研究,制得的豆豉溶栓酶干品,其比活
力为530.6U/mg,纯化倍数为11.0,活性回收率为65.7%。溶栓酶干品经SephadexG-100柱层析,SDS-PAGE法测定
分子量为31.0ku。
关键词:豆豉溶栓酶;纯化;比活力
STUDYONEXTRACTIONANDPURIFICATIONOFDOUCHIFIBRINOLYTICENZYME
YAOXiao-ling,MENGFan-tao,WUSi-fang
(DepartmentofBiologicalEngineering,HubeiPolytechnicUniversity,Wuhan430068,Hubei,China)
Abstract:Theextractionandpurificationthroughdecolorizing,salting-out,desaltingbyultrafiltrationand
freezing-dryofDouchifibrinolyticenzymefromfermentingliquorwereinvestigated.Theenzymaticactivity
reached530.6U/mg.Thepurificationratiowas11.0moretimesthanbefore,andthereclaimratiowas65.7%.
Throughsephadex-100columnchromatography,themolecularweightofdryDouchifibrinolyticenzymewas
31.0KDdeterminedbySDA-PAGE.
Keywords:DouchiFibrinolyticEnzyme(DFE);purification;specificactivity
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
科学研究
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