全 文 ：三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察
鄢又玉1，2，夏婷2，张育2，游元2，赵春芳1，余龙江1，*
（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，
湖北武汉 430023）
摘 要：探讨以芦丁作为对照品，建立三氯化铝（AlCl3）比色法测定火棘总黄酮含量的最优条件。系统考察了对照
品、光照、反应时间及温度、显色剂 AlCl3浓度及用量、体系 pH、缓冲液用量等因素对总黄酮与 AlCl3显色反应的影
响。结果表明，AlCl3比色法测定火棘总黄酮含量的最优条件为：1 mL适宜浓度的火棘提取液，依次加入 2 mL pH5.4
的醋酸-醋酸钠缓冲液，1 mL质量浓度 2 % AlCl3液，70 %乙醇定容至 10 mL并混匀，不避光条件下 30℃反应 12 min，
285 nm测定吸光度。该测定方法具有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率。
关键词：火棘；总黄酮；芦丁；AlCl3比色法
Systematic Investigation on AlCl3 Colorimetric Determination of Total Flavonoids from
Pyracantha Fortuneana Fruit
YAN You-yu1，2，XIA Ting2，ZHANG Yu2，YOU Yuan2，ZHAO Chun-fang1，YU Long-jiang1，*
（1. School of Life Science & Technology，Huazhong University of Science & Technology，Wuhan 430074，
Hubei，China；2. School of Biological & Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan
430023，Hubei，China）
Abstract：Rutin was taken as reference substance and the optimal condition of aluminum chloride colorimetric
assay affecting the determination of total flavonoids from Pyracantha fortuneana extract was established. Several
parameters， such as the standard substance， light， reaction time and temperature， concentration and the
amount of chromogenic agent， pH and buffer dosage that affecting the color reaction of total flavonoids were
investigated systematically. The results indicated the appropriate reaction conditions were as the following：2 mL
2 %（m/m） Aluminum chloride was added to 1 mL pyracantha extract with specific concentration， after being
blended the reaction was carried out at 30 ℃ for 12 min， then absorbance was measured at 285 nm. As a result，
Statistical analysis showed the method had good repeatability， stability， reproducibility and high recovery rate.
Key words：Pyracantha Fortuneana； total flavonoids； rutin； aluminum chloride colorimetric method
作者简介：鄢又玉（1975—），女（汉），讲师，博士，研究方向：天然
药物。
*通信作者
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 3月
第 36卷第 5期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.023
火棘（Pyracantha fortuneana）属于蔷薇科苹果亚科
（Maloideane），是一种药食两用常绿野生灌木，在我国
共有 7个种属，广泛分布于东南、西南和西北部，尤以
湖北神农架地区资源最丰富，年均产量在 5万 t以上[1]。
火棘富含黄酮类[2]等天然抗氧化成分，研究表明，黄酮
类化合物具有增强记忆[3]、抗衰老[4-5]、抗疲劳[6]、消食健
脾[7]、通便润肠、降血脂[8]、抗菌 [9]、改善脂蛋白、保护心
肌及抗糖尿病等[10]功效。目前，火棘资源在日本、韩国
等已开发得相当成功，广泛应用于食品、药品及化妆
品[11]等领域，而在中国大陆火棘整体开发力度不够，仅
以盆景，果酒[12]，果醋[13]以及果实粗提物低端应用及出
口，具有极大的开发潜力，市场前景相当广阔。植物总
黄酮的含量测定一般采用直接分光光度法、比色法、
高效液相色谱（HPLC）法等[14-18]。直接分光光度法灵敏
度低，比色法能提高测定灵敏度，是被《中国药典》所
采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以 NaNO2-
Al（NO3）3- NaOH比色法最常用，但 NaNO2-Al（NO3）3-
NaOH比色法不能排除邻二酚羟基非黄酮类物质的
干扰[19-20]，而火棘中已经报道的很多非黄酮成分如鞣
检测分析
89
酸、山奈酚及反式肉桂酸等均具有邻二酚羟基 [21]，因
此，使用该方法专属性不强，不适合于火棘总黄酮的
测定。HPLC法测得的结果相对准确，但其所需单体不
易得到且所用仪器费用较高，难以满足一般产业化的
需求。黄荣[22]及甘秀海[23]等学者对火棘总黄酮含量测
定进行了相关研究，前者粗略比较了亚硝酸钠-硝酸
铝比色法与 AlCl3比色法，且只对 AlCl3比色法中体系
pH对测定结果的影响进行了初步探讨，并未展开系统
而深入的研究；后者肯定了以 AlCl3-NaAc为显色体系
的紫外分光光度测定法，却对影响含量测定的相关因
素只字未提，两篇文章均未给出火棘总黄酮测定的最
优参数条件。因此，本课题在他们研究的基础上，采用
AlCl3比色法测定火棘总黄酮含量，并对影响测定的相
关因素如对照品、体系 pH、显色剂浓度及用量、反应时
间及温度等展开系统而深入的考察，最终建立了火棘
总黄酮含量测定的最优条件。该方法简便可行，具有
良好的重现性及稳定性，可作为工业化大规模生产火
棘总黄酮含量测定的首选方法之一。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
火棘果，2012年 11月中旬采自湖北恩施来凤地
区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘火棘
（Pyracantha atalantioides（Hance）Stapf）。去离子水，无水
乙醇，无水氯化铝，结晶乙酸钠，醋酸等均为分析纯；芦
丁对照品，槲皮素对照品：中国药品生物制品检定所。
万分之一分析天平：上海民桥精密科学仪器有限
公司；PE-Lambda 25紫外-可见光光度计：美国 PE公
司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪
器厂。
1.2 方法
1.2.1 火棘提取物制备
取过 20目筛、干燥去籽的火棘果粉末 50 g，加入
70 %乙醇，料液比 1 ∶ 10（g/mL），80 ℃水浴加热回流提
取 2 h，过滤离心后取上清液，以 70 %乙醇定容至
500 mL，稀释 10倍后作为储备液待用，此时火棘提取
物浓度记为 10 mg/mL。
1.2.2 对照品的选择及最大吸收波长的确定
分别吸取折算后实际浓度 0.05 mg/mL芦丁、槲皮
素溶液各 5 mL，置于 25 mL具塞比色管中，依次加入
2 mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，2 % AlCl3溶液（2 g
无水 AlCl3，以 70 %乙醇定容至 100 mL）10 mL，70 %
乙醇定容，快速混匀后室温静置 12 min。同时做空白试
验，在 200 nm~700 nm范围进行全波段扫描，谱图参见
图 1。
1.2.3 标准曲线的绘制
分别取 0.15mg/mL 芦丁对照品液 0.6、1.0、1.4、
1.8、2.2、2.6、3.0 mL于 10 mL具塞比色管中，依次加入
2 mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1 mL 2 % AlCl3溶
液，70 %乙醇定容混匀后，30℃静置 12 min。以不加对
照品的溶液作空白对照，在 285 nm测吸光度，以芦丁
样液浓度 C（mg/mL）对吸光度值（A）进行线性回归，绘
制标准曲线。
1.2.4 AlCl3法测定火棘总黄酮的影响因素考察
1.2.4.1 显色剂用量
准确移取 1mL样品液置于 10 mL具塞比色管中，
分别加入不同量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）1 %
AlCl3溶液，混匀，30℃显色反应 8 min，70 %乙醇定容
待测；同时作空白对照，在 285 nm测吸光度，每个样品
重复测 3次，取平均值（以下所有测定均同上操作）。
以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图 2。
1.2.4.2 显色剂浓度
准确移取 1mL样品溶液于 10 mL具塞比色管中，
分别加入 1 mL 1 %、2 %、3 %及 4 % AlCl3液，其他操
作同 1.2.4.1，以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见
图 3。
1.2.4.3 显色时间
准确移取 1mL样品溶液于 10 mL具塞比色管中，
加入 1 mL 1 %AlCl3溶液，室温分别放置 4、8、12、16、
20 min，70 %乙醇定容待测，其他同上操作。以吸光度
值对显色剂用量作图，结果参见图 4。
1.2.4.4 反应温度
准确移取 1 mL样品溶液于 10 mL具塞比色管中，
加入 1 mL AlCl3溶液，分别在 15、20、25、30、35、40 ℃
下反应 12 min，70 %乙醇定容待测，其他同上操作。以
吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图 5。
1.2.4.5 体系 pH
准确移取 1 mL样品液于 10 mL具塞比色管中，
加入 1 mL 1 %AlCl3溶液，分别加入 pH为 3.8、4.2、4.6、
5.0、5.4、5.8、6.2、6.6的缓冲液 2 mL，室温放置 12 min，
70 %乙醇定容待测，其他同上操作，以吸光度值对 pH
作图，结果参见图 6。
1.2.4.6 缓冲液用量
准确移取 1 mL样品溶液于 10 mL具塞比色管中，
加入 1 mL 1 %AlCl3溶液，分别加入 pH为 5.4的缓冲
液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 室温放置 12 min，70 %
乙醇定容待测。其他同上操作，以吸光度值对缓冲液
用量作图，结果参见图 7。
检测分析鄢又玉，等：三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察
90
1.2.5 测定方法评价
1.2.5.1 火棘提取液标准曲线的建立
分别量取浓度梯度为 2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL
的火棘提取液 1 mL至 10 mL具塞比色管中，加入 2 mL
pH5.4 的醋酸-醋酸钠缓冲液，1 mL 2 % AlCl3溶液，
70 %乙醇定容混匀，30℃反应 12 min后测定，同时作
空白对照，依 1.2.3操作，从而确定待检火棘提取液的
线性浓度范围。
1.2.5.2 方法重复性考察
取 2及 10 mg/mL火棘提取液各 1 mL，置于 10 mL
具塞比色管中，依次加入 2 mL pH5.4的醋酸-醋酸钠
缓冲液，1 mL 2 % AlCl3溶液，70 %乙醇定容混匀，30℃
反应 12 min，测定 A285，共测定 5次。此测定在相同条
件下由同一分析人员独立完成。
1.2.5.3 方法稳定性考察
取 2及 10 mg/mL火棘提取液各 1 mL，置于 10 mL
具塞比色管中，加入 2 mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲
液，1 mL 2 % AlCl3溶液，70 %乙醇定容混匀，30 ℃反
应，每隔 20分钟测定一次 A285，连续测定 5次。测定结
果之间的精密度称为稳定性。
1.2.5.4 方法重现性考察
取质量浓度为 2及 10 mg/mL火棘提取液各 1 mL，
置于 10 mL具塞比色管中，依次加入 2 mL pH5.4的醋
酸-醋酸钠缓冲液，1 mL 2 % AlCl3溶液，70 %乙醇定容
混匀，30℃反应 12 min，测定 A285，共测定 5次。此测定
在不同实验室，由不同分析人员完成，测定结果之间
的精密度称为重现性。
1.2.5.5 加样回收率考察
取 2 mg/mL火棘提取液 1 mL，置于 10 mL具塞比
色管中，加入 2 mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1 mL
2 % AlCl3溶液，70 %乙醇定容混匀，30 ℃反应 12 min，
同时做空白对照，测定火棘提取液中总黄酮含量。再
取 2 mg/mL火棘提取液 1 mL置于 10 mL具塞比色管
中，加入 0.015 mg/mL芦丁对照品 1 mL，按上述相同方
法测定溶液中总黄酮含量，重复测定 5次，计算回收率。
回收率/% =（加入芦丁后火棘提取液总黄酮量 -
原火棘提取液中总酮量）/加入芦丁量 × 100 %
2 结果与讨论
2.1 对照品的选择及最大吸收波长的确定
按照 1.2.2设计，结果见图 1。
分析可知，同样测试条件下，样品，芦丁和槲皮
素在 280 nm 附近的吸收峰依次分别为 285、274 及
275 nm；样品在 360 nm~380 nm处无明显吸收峰，芦丁
及槲皮素在 360、374 nm处有吸收峰。显然，芦丁作为
对照品，显色后紫外光谱图更接近样品；另外，火棘果
中芦丁含量相对槲皮素而言更高，故选择芦丁作为对
照品更具有代表性，相对更合适。因此，选择芦丁作为
对照品，测定最大吸收波长 285 nm。
2.2 标准曲线的绘制
按照 1.2.3设计，可得芦丁样液浓度 C（mg/mL）对
吸光度值（A）的线性回归方程为 A=11.22 0C+0.049 2
（R2=0.998 3，n=7），结果表明芦丁浓度在 0.009 mg/mL~
0.045 mg/mL范围内线性关系良好。
2.3 AlCl3法测定火棘总黄酮的影响因素
2.3.1 显色剂用量
按照 1.2.4.1设计，结果见图 2。
分析可知，待测样品加入 AlCl3液显色后溶液的
吸光度值随着 AlCl3用量的增加先快速增加，加入量
为 1 mL时吸光度值达到最大，继续增大 AlCl3用量，
吸光度值逐渐下降至最后持平状态，此时，空白对照
液颜色发生明显变化，故选择 AlCl3用量 1 mL较合适。
2.3.2 显色剂浓度
按照 1.2.4.2设计，结果见图 3。
分析可知，固定 AlCl3加入量为 1 mL，随其浓度增
加，火棘提取液与之显色反应后溶液吸光度先快速增
加，AlCl3浓度为 2 %时吸光度值达到最大，后随着
AlCl3浓度继续增加而缓慢降低。因此在保证测试灵敏
度高及空白对照液颜色不发生改变的前提下，选择 2 %
AlCl3较合适。
图 1 样品、芦丁及槲皮素标样紫外扫描图
Fig.1 UV spectrogram of sample，rutin and quercetin standard
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
吸
光
度
A
200 250 600
nm
300 350 400 450 500 550
槲皮素样品
芦丁
图 2 显色剂用量影响
Fig.2 Effect of the dosages of aluminum chloride
0.366
0.364
0.362
0.360
0.358
0.356
0.354
0.352
吸
光
度
A
0 0.5 4.0
三氯化铝用量/mL
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
检测分析 鄢又玉，等：三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察
91
2.3.3 显色时间
按照 1.2.4.3设计，结果见图 4。
分析可知，火棘提取物与 AlCl3显色反应后溶液
的吸光度随着显色时间的增加先快速增加，后缓慢降
低，在显色反应 12 min时吸光度值达到最大。因此在
保证较高的测试灵敏度及空白对照液颜色不发生颜
色改变的前提下，显色时间定为 12 min较合适。
2.3.4 反应温度
按照 1.2.4.4设计，结果见图 5。
分析可知，火棘提取液与 AlCl3显色反应后溶液
的吸光度随着反应温度的增加先快速增加，后增幅渐
缓，在 30℃时吸光度值达到最大，继续提高反应温度，
吸光度快速降低。因此选择显色温度 30℃较合适。
2.3.5 体系 pH
按照 1.2.4.5设计，结果见图 6。
分析可知，火棘提取液与 AlCl3显色反应后溶液
的吸光度值随着体系 pH的增加先快速增加，在 pH=
5.4时吸光度值达到最大，此后，随 pH增加，吸光度值
缓慢下降，且空白对照液颜色发生改变，因此在保证
较高的测试灵敏度及空白对照液颜色不发生改变的
情况下，体系 pH选定为 5.4较合适。
2.3.6 缓冲液用量
按照 1.2.4.6设计，结果见图 7。
分析可知，火棘提取液与 AlCl3显色反应后溶液
的吸光度值随着缓冲液用量的增加先快速增加，在
2 mL时吸光度值达到最大，后缓慢降低。故选 2 mL缓
冲液较合适。
2.4 测定方法评价
2.4.1 火棘提取液标准曲线关系的建立
按照 1.2.5.1设计，以吸光度值 A与火棘提取液浓
度 C（mg/mL）作回归方程为：A= 0.050 0C-0.006 2（R2 =
0.993 0，n=9）。分析可知火棘提取液浓度在 2 mg/mL~
10 mg/mL范围内线性关系良好，这为之后方法评价待
测提取液浓度范围选择提供了依据。
2.4.2 方法重复性考察
按照 1.2.5.2设计，记录相关数据，求出相对标准
偏差 RSD（%），实验结果见表 1。
由表 1 可知，此测定方法的标准偏差分别为
0.000 9和 0.000 3，相对标准偏差分别为 0.188 4 %和
0.293 8 %，重复性很好。
2.4.3 方法稳定性考察
按照 1.2.5.3设计，记录相关数据，求出相对标准
偏差 RSD（%），实验结果见表 2。
图 3 AlCl3浓度影响
Fig.3 Effect of the concentration of aluminum chloride
0.385 0
0.380 0
0.375 0
0.370 0
0.365 0
0.360 0
吸
光
度
A
1 2 5
三氯化铝浓度/%
2 3 3 4 4
图 4 显色时间的影响
Fig.4 Effect of reaction time
0.440 0
0.430 0
0.420 0
0.410 0
0.400 0
0.390 0
0.380 0
吸
光
度
A
0 5 25
反应时间/min
10 15 20
图 5 显色温度的影响
Fig.5 Effect of reaction temperature
0.390 0
0.380 0
0.370 0
0.360 0
0.350 0
0.340 0
0.330 0
0.320 0
0.310 0
0.300 0
吸
光
度
A
10 15 45
反应温度/℃
20 25 30 35 40
0.440 0
0.430 0
0.420 0
0.410 0
0.400 0
0.390 0
0.380 0
吸
光
度
A
3.5 4.0 7.0
体系 pH
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
图 6 醋酸-醋酸钠缓冲体系 pH的影响
Fig.6 Effect of pH of HAc-NaAc buffer system
0.366
0.364
0.362
0.360
0.358
0.356
0.354
0.352
吸
光
度
A
0 0.5 4.0
三氯化铝用量/mL
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
图 7 缓冲液用量的影响
Fig.7 Effect of dosage of HAc-NaAc buffer system
检测分析鄢又玉，等：三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察
92
0.003 和 0.001，相对标准偏差分别为 0.630 2 %和
0.961 5 %，因此该方法重现性好。
2.4.5 回收率考察
按照 1.2.5.5设计，记录相关数据，求出相对标准
偏差 RSD（%），实验结果见表 4。
由表 4 可知，该方法测定总黄酮的回收率为
100.13 %，相对标准偏差为 0.016 6 %。说明采用该方
法用于测定火棘总黄酮具有较高的回收率，精密度
良好。
3 讨论与结论
本实验采用 AlCl3显色法测定了火棘提取液中总
黄酮的含量，分别考察了对照品、显色剂浓度及用量、
反应温度及时间、体系 pH、缓冲液用量等因素对 AlCl3
显色反应的影响。结果表明，AlCl3显色法测定火棘提
取物中总黄酮含量的最适条件为：1mL适宜浓度的火
棘提取液，加入 1 mL质量浓度 2 % AlCl3，2 mL pH5.4
的醋酸-醋酸钠缓冲液，70 %乙醇定容至 10 mL并混
匀，不避光条件下 30 ℃显色反应 12 min后，以芦丁为
对照品，于波长 285 nm处测定吸光度。该测定方法具
有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率较高。
参考文献：
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表 1 重复性实验
Table 1 Repeatability test of the determination results
质量浓度/（mg/mL） 吸光度 A1 吸光度 A2 吸光度 A3 吸光度 A4 吸光度 A5 平均值 A 标准偏差 SD 相对标准偏差 RSD/%
10
2
0.477 8
0.102 6
0.478 2
0.102 0
0.478 5
0.102 4
0.476 0
0.101 7
0.478 1
0.101 9
0.477 7
0.102 1
0.000 9
0.000 3
0.188 4
0.293 8
由表 2 可知，此测定方法的标准偏差分别为
0.000 2和 0.000 7，相对标准偏差分别为 0.014 9 %和
0.684 9 %，因此在溶液显色反应 120 min以内，此测定
方法均呈现良好的稳定性。
2.4.4 方法重现性考察
按照 1.2.5.4设计，记录相关数据，求出相对标准
偏差 RSD（%），实验结果见表 3。
由表 3 可知，此测定方法的标准偏差分别为
质量浓度/
（mg/mL）
吸光度 A1 吸光度 A2 吸光度 A3 吸光度 A4 吸光度 A5 吸光度 A6 吸光度 A7 平均值 A
标准偏差
SD
相对标准偏
差 RSD/%
10
2
0.477 6
0.102 6
0.477 5
0.103 3
0.477 4
0.102 4
0.476 9
0.101 8
0.477 0
0.101 1
0.476 4
0.102 5
0.477 3
0.101 5
0.477 2
0.102 2
0.000 2
0.000 7
0.014 9
0.684 9
表 2 稳定性实验
Table 2 Stability tests of the determination results
表 3 重现性实验
Table 3 Reproducibility tests of the determination results
质量浓度/（mg/mL） 吸光度 A1 吸光度 A2 吸光度 A3 吸光度 A4 平均值 A 标准偏差 SD 相对标准偏差 RSD/%
10
2
0.471
0.102
0.478
0.104
0.475
0.105
0.479
0.106
0.476
0.104
0.003
0.001
0.630 2
0.961 5
表 4 总黄酮回收率
Table 4 Recovery tests of total flavonoids
火棘提取物
吸光度 A
总黄酮原
有量/mg
芦丁加
入量/mg
总黄酮终
测量/mg
回收
率/%
平均
值/%
相对标
准偏差
RSD/%
0.271 4 0.019 4 0.015
0.015
0.015
0.015
0.015
0.034 5
0.034 6
0.034 2
0.034 5
0.034 3
100.67
101.33
98.67
100.67
99.33
100.13 0.016 6
检测分析 鄢又玉，等：三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察
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收稿日期：2014-09-20
HPLC法测定浓缩果汁多菌灵含量的
不确定度评定
刘胜男，巩卫东，张国庆，卫星，帅瑾
（三门峡出入境检验检疫局，河南三门峡 472000）
摘 要：根据方法 SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁中噻菌灵、多菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》，建立高效
液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定浓缩果汁中多菌灵含量不确定度的数学模型，通过
对整个测定过程中各种不确定度因素的研究，分析该测定方法不确定度的来源并对其进行评定，确定不确定度分量，
合成不确定度。结果表明：当多菌灵含量为 0.045 mg/kg时，其扩展不确定度为 0.004 4 mg/kg（k=2）。其中标准溶液的配
制、样品处理操作过程对测量不确定度影响较大。通过对测量不确定度的评定，为有效地控制浓缩果汁中多菌灵含量
的检测质量提供可靠的理论依据。
关键词：不确定度；多菌灵；高效液相色谱（HPLC）；浓缩果汁
Uncertainty Evaluation for the Determination Results of Carbendazim in
Concentrated Fruit Juice by HPLC
LIU Sheng-nan，GONG Wei-dong，ZHANG Guo-qing，WEI Xing，SHUAI Jin
（Sanmenxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R. China，Sanmenxia 472000，Henan，China）
Abstract：Based on SN/T 1753-2006，a mathernatical model of uncertainty evaluation for the determination
作者简介：刘胜男（1987—），女（汉），硕士研究生，主要从事进出口食品检测。
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 3月
第 36卷第 5期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.024
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检测分析
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