全 文 ：一 ]57 4一 药物分析杂志 C hi n J Pha rTn Aa n l Z) (X 6, 2 6 ( 11 )
木香 、 川木香 、 土木香的高效液相色谱指纹图谱鉴别 ’
刘圆 , 彭镰心 , 刘超 , 尚远宏 , 孟庆艳
(西南民族大学少数民族药物研究所 ,成都 61 004 1)
摘要 目的 : 建立鉴别木香 、 川木香 、土木香的方法 。 方法 : K r o m as il C l 。柱 ( 250 m m x 4 . 6 m m , 5 林m ) , 甲醇 一 水梯度洗脱 ,检测
波长为 254 n m , 流速为 1 m I J · m in 一 ’ , 柱温为 30 ℃ 。 结果 :在选定色谱条件下 , 建立了稳定可控的高效液相色谱图 ;应用主成
分分析法 、 系统聚类分析法将药材分成三类 ,并计算相似度 。 结论 :应用高效液相色谱法鉴别木香 、 川木香 、土木香是可行的 。
关键词 :高效液相色谱指纹图谱法 ;木香 ;)l }木香 ;土木香 ;系统聚类法 ;主成分分析
中图分类号 : gR l7 文献标识码 :A 文章编号 : 0 254 一 17 93 ( 2 0 06 ) n 一 1 5 74 ~ 04
T h e H P L C if n g e r P r i n t s t u d y o f R a d i x A u c kl a n d i a e
,
R a d i x V l a d im i r i a e a n d R a d i x I n u l a e
*
L IU Y u a n
,
P E N G U a n 一 x in , l U Ch a o
,
S H A N G Y u a n 一 h o n g , M E N G Qi n g 一 y a n
( E t h n i e p hamr ac
e u t i e a l I n s t i t u t e o f So u t h w e s t U n i v e sr i t y fo r N at i o n al i t i e s
,
Ch e n目 u 6 10 04 1 , Ch i n a )
A b st r a c t O bj e
c it v e : T o id e n t i fy R
a d ix A u e k l a n d i a e
,
R a d ix V la d im i ir a e a n d R a d ix In u l a e
.
M e ht o d
: T h e if n g e r
-
p ir n ts w e er o b t a i n e d for m W
a t e r s 2 6 9 5 i n s t ur m e n t
,
t h e H PL C w a s p e for mr
e d o n a K
r o m a s i l C
l :
( 2 5 0 m m
x 4
.
6 m m
,
5 林m ) a n a l y t i e a l e o l u m n g ar d i e n t e lu t e d w i t h m e t h a n o l 一 w a t e r a t t h e fl o w r a t e of 1 m L
·
m i n
一 ’ .
T h e t e m p e r a t u r e of
e o l u m n w a s 3 0 ℃ . T h e U V d e t e e t i o n w a v e l e n gt h w a s 2 54 n m . R e su l t : P ir n e i P a l e o m p o n e n t s a n a ly s i s a n d e l u s t e ir n g
a n a ly s i s w e er u s e d i n t h e id e n ti if e a t i o n o f th e s a m p l e s
, a n d th e s i m i l i t u d e w a s e o m p u te d b y e o m p u t e
r
.
C o n c l u s i o n :
T h e m e t h o d e a n i d e n ti fy R
a d i x A u e k l a n d i a e
,
R a d i x V l a di m iir a e a n d R a d i x In u l a e
.
K e y w o r d s : H P LC if n g e pr ir
n t : R a d i x A u e k l a n d i a e ; R a d i x V la d i m iir a e : R a d i x I n u l a e ; e l u s t e ir n g a n a l y s i s ; p ir n e ip a l
e o m P o n e n t s a n a l y s i s
木香 、 川木香和土木香均为菊科植物 。 2 005 年
版中国药典收载 的木香为云木香属植物木香 A cu k -
al n id a l俘pp a D ce ne . 的干燥根 , 为常用中药 , 别名广
木香 、 云木香 ,功效行气止痛 、健脾消食 ,用于胸院涨
痛 、泻痢后重 、 食积不消 、不思饮食洲木香为川木香
属川木香 砚a d i m i r i a s o u l ie i ( Far n e h . ) L i n g 和灰毛川
木香 砚a d im iir a s o u l ie i ( F r a n e h . ) L i n g v a r . e i n e ar L i n g
的干燥根 ,为习用品 ,功效行气止痛 ,用于胸肮涨痛 、
肠鸣腹泻 、里急后重 、两胁不舒 、肝胆疼痛等症 ;土木
香为旋复花属植物土木香 nI ul a he le in u m L . ,为较少
使用的中药 ,但为常用藏药 ,别名藏木香 、祁木香 ,功
效健脾和 胃 、调气解郁 、止痛安胎 ,用于胸胁 、腕腹胀
痛 、 呕吐泻痢 、胸胁挫伤 、 岔气作痛 、胎动不安 。
20 0 年版中国药典土木香还收载 了总状土木
香 nI u la acr e lnD sa H o k
.
f
. 的干燥根 。 由于木香类药
材称谓比较复杂 ,在药材商品流通和临床使用 时很
容易混淆 ,有关 3 种木香的鉴别以及含量测定有报
道 「` 一 4」 ,但目前未查阅到用高效液相色谱指纹图谱
法鉴别该类药材 。 近年来聚类分析 c( lu st ier gn a an 卜
y is s )越来越多地应用于药物分析领域 ,这是利用数
学手段对一群事物按其 “ 属性 ” 进行分类的方法 。
聚类分析作为一种定量方法 ,从数据分析的角度给
出了一个更准确细致的分类工具 〔’ 〕 。 主成分分析
法是一种降维的分析方法 , 目前在药物分析领域也
得到广泛的应用 ,主成分分析结合系统聚类分析 ,往
往得到满意的分析结果 。
为了更好地指导临床正确 、 有效和科学地使用
该类药材 ,本实验采用高效液相色谱法结合主成分
四川省科技攻关项 目 ( N O . 2 0 0 4 )
第一作者 介 l : ( 0 2 8 ) 8 5 5 2 22 6 3 , 13 8 0 80 9 26 09 ; E 一 m a i l : 州 an l j u 3 2 ! @ 12 6 . e o m
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2006. 11. 017
药物分析杂志 Ch in J P h r am An al2 0 0 6
,
2 6 ( 1 1 ) 一 15 7 5 一
分析法 、 系统聚类分析法鉴别 2 0 05 年版中国药典收
载的木香 、 川木香和土木香 3 种药材 ,为木香类药材
的鉴别提供新方法 。
1 仪器与试药
W at e sr 26 95 高效液相色谱仪 , W at e sr 26% 检测
器 , E m oP w er orP 色谱工作站 , 甲醇为色谱纯 ,水为二
次蒸馏水 ,其他试剂均为分析纯 。 木香烃内醋对照
品 、 土木香对照药材由中国药品生物制品检定所提
供 ;实验用药材来源见表 1 , 药材均经刘圆副教授鉴
定 。
表 1 药材来源
T a b 1 T h e s o u cr e Of sam P l
e s
序号 ( N o . ) 样品名称 ( s am p ]e ) 来源 ( s o u二 e )
脱 ,梯度洗脱程序表见表 2 , 检测波长 254 n m ;流速
1 m L
·
m in
一 ’ ,柱温 30 ℃ ;进样量 10 林;L 理论塔板
数以木香烃 内醋计不小于 50 0 , 所有组分均在 60
m in 内被检测完毕 。
表 2 梯度洗脱程序表
T a b 2 T h e s k ed of t h e g
r a d i e n t
时间
(
l i m e ) / m i
n
梯度曲线
(
e u vr e o f g ar d s )
木香药材 ( R a d l x A u e k
lan d i
a e , m e d i e al m a t e ir 司 }
四川成都 ( C h e n g d u , S j e h u an )
木香饮片 ( R a d 以 A u c k -
lan d i
a e , c u t c ru d
e d ru g )
四川西昌 ( x i e han g , S i e h u a n )
云南大理 ( D目 i , Y u n n an )
四川成都 ( C h e n g d。 , S i e h u an )
云南大理 ( D al i , Y u n n an )
四川阿坝州 ( A b a , S i e h u an )
四川成都 ( C h e n g d u , s i e h u a n )
1 1
,
12 土木香药材 ( R。 ] i x In 一 青海 (Q i n g h a i )
u l a e
,
m e d l、 al m a t e ir al )
13 一 5 西藏 ( X i z a n g )
16 河南 ( H e n a n )
17 土木香对照 药材 ( R a( h x 中国药品生物制品检定所 ( aN it on
In u l a e
, r e fe er n e e m e d i e al 目 In s t i t u t e fo r C o n t or l o f Ph
amr
a e e u
m a t e ir al ) t i
e al a n d B i o l o g e al Por d u e ts )
18 土 木香饮 片 ( R a d i x In 一 四川阿坝 ( A b a , S i o h u an )
u l a e
, 。 u t 。 ru d e d ru g )
1 9
.
2 0
四川成都 ( C h e n g d u , S i e h u an )
2 1 一 23 Jl }木香药材 ( R ad i x V l a d一 四川阿坝 ( A b a , S i e h u an )
i m i ir a e
,
m e d i e al m a te ir 日 )
24
,
2 5
26
.
27
川木香饮片 ( R a di x v l a d -
im i ir a e
, e u t e ru d e d ru g )
四川成都 ( C h e n g d u , S i e h u an )
云南大理 ( D al i , Y u n n an )
云南大理 ( D a ] i , Y u n an )
29
,
30 四川成都 ( C h e n g d u , S i e h u an )
数据处理软件 : 中药色谱指纹图谱相似度评价
系统 A 版用于对样品进行相似度评价 , S sP s H . 5 统
计软件用于主成分分析与系统聚类分析 。
2 色谱条件与系统适应性
色谱柱为 K or m a s i l C : 8柱 ( 2 5 0 m m x 4 . 6 m m ,
5 林m ) , 甲醇为流动相 A ,水为流动相 B 进行梯度洗
3 溶液的配制
3
.
1 对照品溶液 精密称取木香烃内醋对照品 ,加
甲醇制成 0 . 1 m g · m L 一 ’ 的溶液 , 即得 。
3
.
2 供试品溶液 取 以上各样品 (过 40 目筛 )约
0
.
2 9
,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精密加人甲醇 25
m L
,密塞 ,称定重量 ,放置 12 h , 超声处理 (功率 2 50
w
,频率 50 k H z ) 30 m in , 放冷 , 再称定重量 ,用 甲醇
补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液 , 即得 。
4 方法学考察
4
.
1 运行时间 考察了样品 Z h 的色谱记录图 ,发
现 60 m in 后无色谱峰出现 , 因此确定样品运行时间
为 6 0 m i n o
4
.
2 精密度 、 重复性与稳定性 取 10 号样品粉末
(川木香药材 , 四川西昌 ) ,按上述 “ 3 . 2 ” 项下方法制
备供试品溶液 , 按上述色谱条件重复进样 5 次 ,记录
色谱图 , 以中国药典委员会主持开发的中药色谱指
纹图谱相似度评价系统 A 版进行相似度评价 ,结果
相似度均大于 0 . 9 ,说明仪器精密度良好 。 另取 10
号样品粉末 5 份 , 同法制备供试品溶液 ,按上述色谱
条件进样 ,记录色谱图 ,用相似度评价软件评价相似
度 , 结果相似度均大于 0 . 9 ,说明方法重复性良好 。
取 10 号样品粉末 , 同法制备供试品溶液 ,分别于 0 ,
4
,
8
,
16
,
24
,
48 h 进样 ,记录色谱图 ,用相似度评价软
件评价相似度 ,结果相似度均大 于 0 . 9 , 说明供试
品溶液在 48 h 内稳定 。
5 指纹图谱分析
5
.
1 样品测定 取以上各样品粉末 , 按 “ 3 . 2 ” 项下
方法制备供试品溶液 ,按上述色谱条件进样 ,色谱图
见图 1 。
5
.
2 峰信息的提取 在选择量化指标 (色谱峰数
目 )时 , 以 “ 对分类决策有影响的信息应尽量保留 ,
对分类决策无影响的信息应尽量舍弃 ” 的原则筛选
了 2 3 个色谱峰 , 以峰面积归一化法计算的每个峰的
15 7 6一 药物分析杂志 C hi n J p ha m rA na l 2 0 06
,
2 6 ( 1 1 )
图 1 30 批样品的叠加 图
r ig 1 T h e t h i rt y s a m p l e s
面积百分比作为 H P LC 数量化特征 。
5
.
3 相似度评价 用 中药色谱指纹 图谱相似度评
价系统 A 版对 or 批样 品进行相似度评价 , 结果同
种药材之间的相似度达到 0 . 9 以上 , 若与 3 种木香
的共有模式生成的指纹 图谱作相似度评价 , 云木香
的相似度约为 0 . 6 ,木香与川木香的相似度较高 ,结
果见表 3 。
表 3 3 0 批样品的相似度计算结果
T a b 3 T h e 5 1而 li ut d e of t h e t e n s am Pl e s
样品号 相似度 样品号 相似度 样品号 相似度
(
, 川 l p l e No
.
) (
、 im “ j t u d e ) ( s an l “` 附 ) ( s i n : il i t u女 ) (~ 钊e 酝
.
) (
5 1耐 i t u de )
】 0 . 809 1 1 0 . 6 1 2 2 ] 0 . 86 8
2 0
.
82 5 12 0
.
6 2 3 2 2 0
.
906
图 2 主成分分析图 ( A ) 和聚类分析图 ( B)
F ig 2 T h e
r e s 己 t o f p ir n e ip al e o m p o n e n t s a n a ly s i s ( A ) a n d ht e , s u l t o f
c lu s t e ir n g a n al y s i。 ( B )
2379649
óXC凡R4 S0
.
8 93
1 3
l 4
23
24
5 0
.
8 12
6 0
.
8 4 5
l 5
l 6
25
26
7 0
.
8 19
8 0
.
84 7
l 7
l 8 65 3
657
27
28
29 0
.
90 5
30 0
.
9 1 2
离法 ,欧氏距离 ) ,结果见图 2 一 B 。
6 讨论
6
.
1 提取溶剂与方法的考察 供试品溶液的制备
过程 中考察了不同提取溶剂和方法 ,如考察了氯仿 、
乙酸 乙醋 、 甲醇为提取溶剂进行提取 ,考察了冷浸提
取 、超声提取 、冷浸后超声提取等方法 ,最后确定用
甲醇冷浸后超声提取 30 m in 效果最好 , 且方法简
便 。
6
.
2 色谱条件的优化 在色谱条件优化过程中 ,流
动相分别比较了甲醇 一 水 、 甲醇 一磷酸水 、 乙睛 一 水
3 种系统 ,最后选择了甲醇 一 水系统进行梯度洗脱 ,
因木香类组分 k ’ 分布区域较广 , 因此采用曲线梯度
洗脱 ,柱温分别考察了 25 , 30 , 35 ℃ , 流速分别考察
了 0 . 8 , 1 , 1 . 2 m L · m i n 一 ’ ,最后发现柱温 、 流速对色
谱行为影响不大 ,综合考虑 ,最后选择柱温为 30 ℃ ,
流速为 1 m L · m in 一 ’ 。 选择波长时 ,参考 3 D 色谱图
进行选择 ,并提取不同波长通道进行比较 ,最后确定
2 5 4 n m 时色谱图峰较多 , 丰度较好 , 不同波长的色
谱图比较见图 3 。
l9209`
1
60R9 0
10 0
5
.
4 主成分分析 主成分分析是一种降维 的数学
分析方法 ,在数学上 的处理 ,是将原来 p 个指标作线
性组合 ,作为新的综合指标 , 主成分个数的确定 , 从
理论上讲 , 有多少原始变量就有多少主成分 。 保留
多少个主成分取决于保留部分的累积方差在方差总
和中所占的百分比 ,根据累计贡献率的大小 ,一般就
取前 2 、 3 个主成分代替原来 p 个变量的信息 , 应用
sP s l
·
5 统计软件对取得的 H P LC 数量化特征进行
主成分分析 , 前 2 个主 成分 的 累计 贡献率大于
80 %
, 主成分分析见图 2 一 A 。
5
.
5 系统聚类分析 应用 S sP s n . 5 统计软件对取
得的 H P L C 数量化特征进行系统聚类分析 (组间距
药物分析杂志 C hi n J P hm a rA na l Z) (X 6
,
26 ( 1 1 ) 一 1 57 7 一
6
.
5 待收集更多确定品种和来源的样品后 ,可建立
木香 、土木香和川木香的判别函数 ,用以确定未知样
品的归属 ,或建立人工神经网络模型 ,以更好地区分
3 种木香 , 以后的研究中将会结合气相色谱的指纹
图谱研究 , 以提高 3 种木香辨别的准确性 ,更好地应
用于中成药的质量标准控制 。 本文所建方法简便 、
灵敏 ,为 3 种木香的鉴别提供了新的方法 。
0 1 0 2 0 3 0 4 0
图 3 不同波长色谱图 比较
F ig 3 C o m p明 s o n o f d ife er n t w a v e l e n gt h
5 0 亡/口 i n
6
.
3 相似度评价结果分析 从相似度评价结果可
以看出 ,土木香与木香 、 川木香有较大差异 , 而木香
和川木香较相似 。 比较三者色谱图 , 发现在保留时
间约为 14 、 0 m in 和 34 . 3 im n( 木香烃内酷 )时 , 土木
香基本上没有组分流 出 , 与木香和川木香有明显差
异 , 比较木香和川 木香 , 直观上较难看出两者的差
异 , 因此必须从量化指标对两者进行进一步比较 。
从主成分投影图上可看出木香 、川木香和土木香能
较好地分开 。
6
.
4 聚类分析结果 本研究以 23 个色谱峰为量化
指标进行聚类分析 , 土木香 、 川木香各 自归为一类 ,
与预期 目标一致 , 而 21 号木香 ( 四川阿坝州 )和川
木香归为一类 。 其原因可能是引种在四川的木香由
于气候等各方面的原因使得其与川木香更接近 ,待
收集更多栽培于四川 的木香和川木香后 ,作进一步
比较 ,将会得出更多和更为准确的信息 。
参考文献
1 WA N G Yo n g 一 bi n g ( 王永兵 ) , X U H u a (许华 ) , W A N G Qi a n g (王
强 ) . D et e rm in iat o n Of e o s tu n ol id e an d d e h 》 do e o st u s lac t o n e i n R a dix
v l a d im i` a e b y 即 一 H PL e ( R p 一 H p L C 法测定川木香中木香烃内
酷和去氢木香内酷的含量 ) . oN 八h、 est hP a rnT (J 西北药学杂志 ) ,
20 0 0
,
15 ( 6 ) : 25
2 S H A O C a i 一 ” n (邵彩云 ) , L I U Y o n g 一 x i (刘永喜 ) . D e t e rm i n at i o n
o f 目 a n t o l a e t o n e i n Ra d i x I n u la e b y G e (气相色谱法测定土木香中
土木香内醋的含量 ) . 了Me d hP a 7nI hC in 从no irt 心 (中国民族医药
杂志 ) , 2X() 3 , 9 ( l ) : 37
3 Z H U Y o n g 一 而 n g (朱永明 ) . Id e n t i if e a t i o n o f R a d i x A u e k l a n d i a e an d
R a d i x In u l
a e
(木香及其混淆品一土木香的鉴别 ) . 五“ C ins h e n (人
参研究 ) , 2仪旧 , 12 ( 2 ) : 3 7
4 H u x i a 。 一 w e i (胡晓炜 ) , X U A i 一 re n (徐爱仁 ) . ld e n t讯e a t i o n of
R a di x A u e k lan d iae
,
R ad i x V l a d iim it
a e a n d R a di x I n u l a e b y G C w i t h
d us te ir ng an al ys i
s ( 3 种木香的气相色谱法鉴别与系统聚类分
析 ) . hC in J Mo d 了l1P , l 尸ha 。 (中国现代应用药学 ) , 20 5 , 2 ( 3 ) :
24 9
5 R EN R u o 一 e n (任若恩 ) , w A N G H u i 一 w e n ( 王 惠文 ) . M u l t i 一 d i -
m e n s i o n al S t a t i s t i e al D at a A n al y s i s一T ll e o ry , M e ht o d , E x am p le (多元
统计数据分析 一 理论 、方法 、 实例 ) . Be ij gn (北京 ) : Niat on al eD -
fe n s e P u b l i s h i n g C o m p an y (国防工业出版社 ) , 19 9 7 . 56
(本文于 2以 )6 年 4 月 21 日收到 )