全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(81160539)
作者简介:金爱花，女，医师 研究方向:中药药理学 * 通讯作者:全吉淑，女，教授 研究方向:中药药理学 Tel:(0433)2435150
E-mail:quanjs@ ybu. edu. cn
祁州漏芦对小鼠 H22 移植瘤血管生成及细胞凋亡的影响
金爱花1，高峰2，许惠仙1，全吉淑2* (1. 延边大学附属医院，吉林 延吉 133000;2. 延边大学医学院，吉林 延吉 133002)
摘要:目的 探讨祁州漏芦提取物(Ｒhaponticum uniflorum extract，ＲUE)对小鼠 H22移植瘤血管生成及细胞凋亡的影响。方法
建立 H22肝癌皮下移植瘤小鼠模型，随机分为模型组、祁州漏芦提取物高、中、低剂量组和氟尿嘧啶组。连续干预 10 d。采
用苏木素-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织病理学变化，采用 DNA ladder法检测肿瘤细胞凋亡情况，采用免疫组织化学法检测
肿瘤组织内微血管密度(microvessel density，MVD)，采用免疫印迹法检测肿瘤组织血管内皮生长因子(vascular endothelial
growth factor，VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体 2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFＲ2)和缺氧诱导因子-1α
(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的蛋白表达。结果 与模型组比较，祁州漏芦提取物组肿瘤细胞生长受抑，坏死程度较
严重;DNA梯形条带显著增多;肿瘤组织微血管密度显著降低;血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体 2 和缺氧诱导因
子-1α蛋白的表达均显著降低。结论 祁州漏芦提取物对 H22移植瘤小鼠具有抑制血管生成和诱导细胞凋亡作用，其抗血管
生成作用可能与下调移植瘤组织血管内皮生长因子、缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子受体 2 的蛋白表达有关。
关键词:漏芦;H22;抗血管生成;诱导细胞凋亡
doi:10. 11669 /cpj. 2016. 04. 007 中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2016)04 － 0280 － 04
Effects of Ｒhaponticum uniflorum on Angiogenesis and Apoptosis of H22 Transplanted Tumor Tissue in Mice
JIN Ai-hua1，GAO Feng2，XU Hui-xian1，QUAN Ji-shu2(1. Yanbian University Hospital，Yanji 133000，China;2. Yanbian
University Medical College，Yanji 133002，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To investigate the effects of Ｒhaponticum uniflorum extract (ＲUE)on angiogenesis and apoptosis of
H22 transplanted tumor tissue in mice. METHODS Mice bearing H22 hepatoma cells were randomly assigned into 5 groups:model，
high，medium and low dose ＲUE，and 5-fluorouracil (5-Fu)group. The intervention was lasted for 10 d. The pathological changes
were detected with hematoxylin ＆ eosin (HE)staining，the apoptosis of hepatoma cells were determined by DNA laddering method，
the microvessel densities (MVD)were detected using immunohistochemical assay，and the protein expression of vascular endothelial
growth factor (VEGF)，vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFＲ2)and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)were de-
tected by Western blot method. ＲESULTS ＲUE treatment reduced the cell proliferation，aggravated the necrosis of transplanted
tumor tissue，reduced DNA fragmentation of H22 hepatoma cells，decreased MVD of tumor tissue，and down-regulated the protein ex-
pression of VEGF，VEGFＲ2 and HIF-1α of the transplanted tumor tissue，as compared with the model group. CONCLUSION ＲUE
could exhibit anti-angiogenic and pro-apoptotic effects against H22 hepatoma cells in mice，and its anti-angiogenic mechanism is proba-
bly related to down-regulation of VEGF，VEGFＲ2 and HIF-1α proteins.
KEY WOＲDS:Ｒhaponticum uniflorum;H22;anti-angiogenesis;pro-apoptosis
漏芦为菊科漏芦属植物祁州漏芦［Ｒhaponticum
uniflorum(L. )DC.］的干燥根，广泛分布于我国华
北、东北和西北诸省，药源丰富［1］。漏芦苦寒，归胃
经，有清热解毒，消肿排毒，舒筋通脉的作用;可治乳
痈肿痛，痈疽发背，瘰疬疮毒，乳汁不通，湿痹拘挛、
风湿痛［1-2］。研究发现，漏芦能增强机体免疫功能，
具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗衰老等作用［3-4］。我
们前期研究已证实，漏芦提取物对小鼠 H22移植瘤
具有明显的抑制作用，抑癌率约为 38%［5-6］。本实
验通过小鼠 H22肝癌移植瘤模型来评价漏芦抑制小
鼠 H22移植瘤血管生成和诱导细胞凋亡作用，用
DNA ladder 法检测瘤细胞凋亡，用免疫组化法检测
瘤组织内微血管密度(microvessel density，MVD)，
用免疫印迹法检测瘤组织血管生成相关蛋白，旨在
对漏芦的抑瘤机制进行深入探讨。
1 材 料
1. 1 ＲUE的制备
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将祁州漏芦切碎，加水煎煮，滤液经减压蒸馏即
得 ＲUE，得率为 9. 5%［5-6］。
1. 2 动物和细胞株
昆明小鼠，18 ～ 22 g(延边大学实验动物中心)。
小鼠 H22肝癌细胞株(延边大学医学院预防医学教
研室韩春姬教授惠赠)。
1. 3 试剂
氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu，上海旭东海普
药业有限公司);细胞凋亡-DNAladder 抽提试剂盒
(离心柱式，碧云天生物技术研究所);兔 CD34 单克
隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司);兔 VEGF
单克隆抗体(美国 Santa Cruz 公司);兔 VEGFＲ2 单
克隆抗体(美国 Cell Signaling 公司);小鼠 HIF-1α
单克隆抗体(美国 Abcam 公司);二抗(羊抗小鼠
IgG-HＲP，南京凯基生物有限公司);二抗(羊抗兔
IgG-HＲP，南京凯基生物有限公司)。
1. 4 仪器
OLYMPUS倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会
社);3 － 30K型离心机(Sigma 公司);小型垂直电泳
槽及 Trans-Blot转印槽(美国伯乐公司);UVP 凝胶
成像分析仪(美国 UVP公司)。
2 方 法
2. 1 建立 H22小鼠肝癌移植瘤模型及分组处理
［5-6］
常规复苏 H22肝癌细胞，调细胞至 2 × 10
6个·
mL －1，注射到小鼠腹腔内传代。取第 2 代腹水，调
细胞至 1 × 107个·mL －1，取 0. 2 mL 接种到小鼠的
右腋下［5-6］。第 2 天，随机分成模型组、5-Fu 组(阳
性对照)和 ＲUE高、中、低剂量组，每组 10 只。5-Fu
组按 25 mg·kg －1·d －1剂量隔日腹腔注射 1 次，共
5 次;ＲUE高、中和低剂量组分别按 400、200 和 100
mg·kg －1·d －1剂量每日灌胃 1 次，共 10 次;模型组
则等体积生理盐水灌胃。第 10 天末次给药 16 h
后，处死动物。
2. 2 肿瘤组织病理学检查
取各组瘤体常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红
(HE)染色，在光镜下观察肿瘤组织病理学变化。
2. 3 DNA ladder法检测瘤细胞凋亡［5］
严格按试剂盒上操作步骤提取肝细胞 DNA，上
琼脂糖凝胶电泳，检查 DNA 梯状条带(DNA lad-
der)。
2. 4 免疫组化法检测瘤组织内 MVD
各组肿瘤组织以石蜡包埋切片，脱蜡水化，以
CD34 标记血管内皮细胞，阳性结果以胞浆呈现棕黄
色染色。按参照 Weidner［7］评判标准，在低倍镜下
寻找“热点”，观察棕染的微血管密集区，高倍镜下
计数 3 个视野被 CD34 染成棕黄色的血管数，取其
平均值作为肿瘤的 MVD值［8］。
2. 5 免疫印迹法检测瘤组织内 VEGF、VEGFＲ2、
HIF-1α表达水平
将肿瘤组织裂解，并提取总蛋白。总蛋白加热
变性后，加样，电泳后转移至 PVDC膜。用脱脂奶粉
封闭，加入相应一抗，在 4 ℃孵育过夜。洗膜，加二
抗，在室温孵育 2 h。加 ECL 化学发光显色液，在
UVP 凝胶成像分析仪中显色并进行相对灰度比值
分析。
2. 6 统计学处理
数据以均值 ±标准差(珋x ± s)表示，用 SPSS19. 0
统计软件包，以 Turkey s 多因素 t 检验进行多组数
据间比较，以 P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结 果
3. 1 ＲUE对肿瘤组织病理学的影响
模型组肿瘤细胞密集，细胞体积大，核染色深且
大小形态不一，瘤细胞异型性明显，病理性核分裂象
多，细胞质丰富，坏死范围较小，少见核固缩、核碎裂
等凋亡形态学改变。5-Fu 组肿瘤细胞排列疏松，细
胞体积减小，核固缩，染色质变深，核分裂象明显少
于模型组，炎性反应较明显，可见大面积片状坏死
区。与模型组比较，ＲUE 各剂量组肿瘤细胞排列疏
松，瘤细胞异型性降低，肿瘤细胞数目减少，核分裂
象减少，可见散在的及片状的坏死灶。见图 1。
3. 2 ＲUE对肿瘤细胞凋亡的影响
核染色质 DNA 断裂成 180 ～ 200 bp 或者其多
聚体组成的寡核苷酸片段是细胞凋亡的标志特
征［5］。结果见图 2，模型组肿瘤细胞中 DNA 梯形条
图 1 各组移植瘤组织病理学观察结果
Fig. 1 Pathological observation of the transplanted tumor tissue
sections
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中国药学杂志 2016 年 2 月第 51 卷第 4 期 Chin Pharm J，2016 February，Vol. 51 No. 4
带很少，其余各给药组肿瘤细胞中 DNA梯形条带显
著增多(P ＜ 0. 05)。
3. 3 ＲUE对肿瘤组织 MVD的影响
模型组内皮细胞 CD34 表达比较多，尤其在肿
瘤组织与正常组织的交界处即肿瘤组织边缘明显表
达增多。5-Fu 组也可见内皮细胞 CD34 表达，但总
体上明显少于模型组;可以看出肿瘤组织边缘处有
CD34 表达，而肿瘤组织坏死区 CD34 阳性的微血管
慢慢消失至完全消失。ＲUE 各剂量组内皮细胞
CD34 表达明显减少，少量在肿瘤组织边缘中表达。
与模型组比较，ＲUE 组和 5-Fu 组肿瘤组织内 CD34
阳性染色的微血管数量显著减少，提示 ＲUE和 5-Fu
干预可减少实体瘤组织 MVD(P ＜ 0. 05)。结果见
图 3，表 1。
3. 4 ＲUE 对肿瘤组织 VEGF、HIF-1α、VEGFＲ2 表
达的影响
肿瘤组织标本中 VEGF、HIF-1α、VEGFＲ2 蛋白
均有大量表达;而 ＲUE 各剂量组和 5-Fu 组的 3 种
蛋白表达均显著低于模型组(P ＜ 0. 05)，见图 4。
图 2 各组移植瘤组织 DNA ladder检测结果
M －Marker;1 － 5-Fu;2 － Model;3 － ＲUE 100;4 － ＲUE 200;5 － ＲUE 400
Fig. 2 DNA Laddering observation of the transplanted tumor
tissues
M － Marker;1 － 5-Fu;2 － Model;3 － ＲUE 100;4 － ＲUE 200;5 － ＲUE 400
图 3 移植瘤组织 CD34 免疫组化结果(× 100)
Fig. 3 Immunohistochemical observation of CD34 in the trans-
planted tumor tissues (× 100)
表 1 ＲUE对肿瘤组织 MVD的影响． n = 3，珋x ± s
Tab. 1 Effect of ＲUE on MVD of tumor tissues． n = 3，珋x ± s
Group Dose /mg·kg － 1 MVD
Model － 43. 0 ± 5. 29
5-Fu 25 24. 8 ± 4. 201)
ＲUE 100 33. 2 ± 4. 141)
200 32. 6 ± 4. 821)
400 31. 0 ± 4. 851)
注:与模型组比较，1)P ＜0. 05
Note:1)P ＜0. 05，vs the model group
图 4 各组移植瘤组织 VEGF、HIF-1α、VEGFＲ2 蛋白的表
达． n = 4，珋x ± s
与模型组比较，1)P ＜0. 05
Fig. 4 Expression of VEGF，VEGFＲ2 and HIF-1α proteins in
the transplanted tumor tissue． n = 4，珋x ± s
1)P ＜0. 05，vs the model group
4 讨 论
祁州漏芦为传统中药，其抑癌作用研究已有一
定积累［5-6］。我们的前期工作已证实，漏芦提取物抑
制小鼠 H22肝癌移植瘤生长，改善荷瘤小鼠的免疫
抑制状态［5-6］。本实验 HE染色结果也显示，ＲUE治
疗使肝癌细胞生长受抑，排列较疏松，瘤细胞异型性
降低，坏死严重，浸润程度减轻。同时，琼脂糖电泳
结果显示，ＲUE明显增加移植瘤细胞中凋亡特征型
结构———DNA ladder 的形成，提示，ＲUE 促进肿瘤
细胞凋亡。
肿瘤血管生成在肿瘤的生长和转移中起着重要
的作用，因此，抑制肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗的
一种新方法［9］。反映肿瘤组织血管生成能力的主
要指标是 MVD，可通过测定 MVD 评价抗肿瘤药对
肿瘤血管生成的影响［10］。本实验以肿瘤组织血管
内皮细胞 CD34 的阳性表达来计算微血管密度。结
果显示，ＲUE 可显著降低实体瘤组织的 MVD，抑制
·282· Chin Pharm J，2016 February，Vol. 51 No. 4 中国药学杂志 2016 年 2 月第 51 卷第 4 期
移植瘤血管生成。
HIF-1α是近年来备受重视的血管形成和生长
有关的转录因子，被认为是实体肿瘤血管新生的关
键因素，可通过调节其下游基因 VEGF 等的表达发
挥促血管新生作用［5］。VEGF 是 HIF-1α 的靶蛋白
之一，也是目前已知促进血管生成作用最强的血管
生长因子之一，它的表达在肿瘤生长、转移中处于重
要地位，其表达能反映血管形成的能力［5，10］。VEGF
选择性作用于血管内皮细胞膜上 VEGF 受体，介导
内皮细胞增殖、分裂、迁移;并增加血管尤其是微小
血管的通透性，为肿瘤细胞的生长和新生血管网的
建立提供营养，并为肿瘤细胞的远处转移提供管
道［10］。VEGF 受体主要有 3 种，VEGFＲ1(Flt-1)、
VEGFＲ2(KDＲ /Flk-1)和 VEGFＲ3，其中只有 VEG-
FＲ2 与内皮细胞增殖和血管生成有关［5］。结果表
明，ＲUE治疗使肿瘤组织中 VEGF、HIF-1α、VEGFＲ2
蛋白表达降低，提示漏芦提取物可通过抑制移植瘤
组织血管生成，干扰肿瘤组织的养分吸收，引起肿瘤
细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
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