全 文 ：中国药物与临床 2014 年 7 月第 14 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2014,Vol.14,No.7
多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）又称浆细胞骨髓
瘤， 是浆细胞恶性克隆大量增生， 出现以广泛溶骨病变和
（或）骨质疏松、肾功能损害为特征的恶性肿瘤［1］。瘤细胞增殖
比例低（通常＜1．5%）、多药耐药，且治疗反应差，最终因多药
耐药而复发。迄今，MM 作为一种不可治愈的恶性肿瘤正严重
地危害着人们的健康，因此，寻找新的植物来源的药物显得
非常必要。
禹州漏芦（radix echinopsis）为菊科植物蓝刺头（Echinops
latifolius Tausch）或华东蓝刺头（Echinops grijisii Hance）的干
燥根，主产于我国华北及华东地区。 禹州漏芦味苦、性寒，归
胃经，具有清热解毒、排脓止血、消痈下乳的功效。 现代药理
学研究表明，禹州漏芦中噻吩类化合物具有体外抗肿瘤活性
［2-5］。但是禹州漏芦提取物作用于多发性骨髓瘤的研究目前尚
无报道。本实验通过血清药理学的方法［6］，观察含药血清作用
后 U266 细胞株 α-微管蛋白、热休克蛋白（HSP）90 乙酰化水
平，探讨其与浓度的依赖性及诱导凋亡的机制。 为多发性骨
髓瘤的治疗寻找有效低毒的中草药抗肿瘤制剂，为新药的开
发和应用提供理论依据。
“血清药理学”的方法最早是日本的 Hiroko［7］在 1984 年
提出，该方法比较接近药物在体内环境中产生药理效应的真
实过程，避免体外实验得出的错误结论，它的出现在很大程
禹州漏芦含药血清对人多发性骨髓瘤细胞株 α-微管
蛋白乙酰化水平 热休克蛋白90分子
伴侣功能影响的研究
康 影 马 兰 倪 艳 吕 红 马艳萍
本次调查 8～11 月龄儿童接种首剂次麻风疹疫苗的抗体阳性
率 77．4％，表明 18～24 月龄接种第 2 针麻风（麻腮风）疫苗的
免疫措施是十分必要的， 结合我省小年龄组发病的特点，所
以需要尽早接种麻风疫苗第一剂和第二剂麻风 （麻腮风）疫
苗。 1～6 岁风疹抗体阳性率较高，且年龄组间无差别，与 2008
年我省将麻风疫苗纳入免疫规划有关系。
本研究共调查 43 名育龄期和 103 名非育龄期女性，育
龄期风疹抗体阳性率 90．7％，有 10％的育龄期妇女对风疹病
毒易感，与文献［3，4］报道基本一致。 文献［5］报道，在非风疹
流行期间， 孕妇的感染率为 0．1％~0．2％，而在流行期间孕妇
感染率上升为 3．1％，孕妇在怀孕早期一旦感染上风疹，对胎
儿有很强的致流产、死产和致畸胎作用，导致新生儿先天性
风疹综合征（CRS），给家庭和社会带来巨大的痛苦和负担。另
外，结合我省风疹发病率的特点，20~岁组和 30~岁组呈现一
个小高峰，因此对如果计划怀孕的育龄期妇女，接种风疹疫
苗还是十分必要的， 风疹疫苗接种后要间隔一个月怀孕，此
期间补种的意义不是为了提高婴儿的抗体水平，因为婴儿抗
体衰减较快，控制婴幼儿麻疹发病的作用也有限。
本次调查显示有免疫史的风疹抗体水平较无免疫史和
免疫史不详的抗体阳性率高，说明麻风疫苗的接种是切实有
效的。
参 考 文 献
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（收稿日期：2014-04-23）
表 3 0～6 岁儿童有无免疫史风疹抗体水平比较
免疫史 人数 风疹 GMC（95％CI，mU/ml）
是 137 133 97．1 1 270．52（789．49～1 751．55）
否 43 15 34．9 670．29（-60．47～1 401．05）
不详 3 3 100．0 1 739．41（-4 490．95～7 969．76）
合计 183 151 82．5 1 137．17（737．78～1 536．57）
抗体阳性
人数 百分率（％）
DOI：10.11655/zgywylc2014.07.017
作者单位：030001 太原， 山西医科大学研究生学院 （康影、吕
红）；山西省儿童医院妇幼保健口腔科（马兰）；山西省中医药研究院
（倪艳）；山西医科大学第二医院血液科（马艳萍）
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中国药物与临床 2014 年 7 月第 14 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2014,Vol.14,No.7
表 1 禹州漏芦不同浓度粗提药中 α-三联噻吩的含量
样品量（ml） α-三联噻吩（mg/g）
0．5 0
0．5 10．32
0．5 19．21
0．5 23．28
样本 样本数
空白对照组 3
1 g/ml 浓度粗提药物组 3
2 g/ml 浓度粗提药物组 3
4 g/ml 浓度粗提药物组 3
度上克服了中药复方及粗提物在体外研究时的不便，具有可
控性好、重复性高，可以减少体内外各种干扰因素的影响。 本
课题将采用血清药理学的方法，研究中药禹州漏芦的抗骨髓
瘤作用及机制。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
人多发性骨髓瘤细胞株 U266 由石家庄白求恩国际和平
医院提供， 胎牛血清为北京四季青公司产品，RPMI 1640 培
养基购自美国 Gibco BRL 公司，PMSF 及培养细胞蛋白抽提
剂购自武汉博士德公司，Acetylated αTubulin、HSP90 抗体及
protein A/G PLUS-Agarose 购自 Santa Cruz Biotechnology 公
司，Purified Anti-Acetylated Lysine 购自 Biolegend 公司， 山羊
抗小鼠 IgG 购自北京康为世纪生物科技有限公司，α-三联噻
吩对照品购自上海酶联生物科技有限公司。
1．2 药物制备
禹州漏芦干燥根购自安徽亳州，经山西省中医药研究院
药理实验室检验证实为禹州漏芦后， 取干燥根 5 kg 粉碎，用
95％的乙醇（5 kg×8 倍量）热提 3 次，每次 3 h，回收乙醇，合
并、抽滤、减压、浓缩得到粗提物，控制溶液含生药量 4 g/ml，2
g/ml，1 g/ml 3 种浓度梯度的含药浸膏，4 ℃冰箱储存备用。
1．3 含药血清的制备
取健康大鼠 40 只，雄性，体质量 190~240 g，随机分成空
白血清组 10 只，高、中、低浓度含药血清组各 10 只。 含药血
清组每日分别给予禹州漏芦粗提液 4、2、1 g/ml 浓度 4 ml/d
灌胃，每日 1 次，对照组每日给予等量生理盐水灌胃（灌药前
禁食 12 h，不禁水），于给药第 6 天，最后 1 次灌胃后 1 h 腹
主动脉无菌采血，室温下 3 000 r/min，离心 10 min，无菌分离
血清， 经 56 ℃、30 min 灭活处理，同组混合，分装小瓶，置-20
℃冰箱保存备用（2 个月内使用）。
1.4 实验方法
1.4．1 细胞培养: 人多发性骨髓瘤细胞 U266 培养于含 10％
胎牛血清及青霉素 、链霉素 （100 U/ml）的 RPMI 1640 培养
液，置 37 ℃、5％ CO2细胞培养箱中传代培养。每 2 d 换液，取
对数生长期的细胞进行实验。
1.4．2 分组及给药量：①空白对照组：培养液为 10％胎牛血
清及青霉素、链霉素（100 U/ml）的 RPMI1640 培养液；②10％
高浓度（4 g/ml）大鼠血清组：培养液中加入了 10％高浓度大
鼠血清；③10％中浓度（2 g/ml）大鼠血清组：培养液中加入了
10％中浓度大鼠血清；④10％低浓度（1 g/ml）大鼠血清组：培
养液中加入了 10％低浓度大鼠血清。 加药后 24 或 48 h 时收
集细胞并洗涤，进行相关检测。
1.4．3 高效液相色谱法（HPLC）测定禹州漏芦原药中 α-三联
噻吩含量：精密吸取血清标本（对照组及实验组）0．5 ml 置 14
ml 塑料具塞离心管中； 加入 5 μg/ml 苯丙醇胺内标溶液 0．1
ml，加入混合碱溶液（1 000 ml 水中含有 10 g 氢氧化钠和 40
g 碳酸钠）0．5 ml，旋涡混旋 1 min；加入提取溶剂乙醚-正己烷
（蒸）5．0 ml，台式旋转振荡器旋转振荡 30 min 后，4 000 r/min
离心 10 min，取上层有机相置含有 0．1 ml 盐酸（重蒸）（6 mol/
ml）的 10 ml试管中，65 ℃水浴中用高纯氮气挥干。 残渣于进
样前用 100 μl 流动相溶解， 取上清液置自动进样器微量瓶
中，进样 40 μl进行 HPLC 分析测定。 上述实验重复 3 次。
1．4.4 免疫印迹技术检测禹州漏芦含药血清作用后 HDAC6
特异底物 α-微管蛋白乙酰化水平： ①取对数生长期细胞，制
备 3×105个/ml 的细胞悬液，均匀接种于 6 孔板中，加入不同
浓度含药血清共培养 24 h。 重悬于裂解缓冲液（1 ml裂解液加
入 100 mmol/L PMSF 10 μl）中，冰上静置 1 h；冰浴中超声破
碎 20 s（每次 5 s，间隔 5 s）；4 ℃15 000 r/min 离心 30 min，54
000 r/min，4 ℃再离心 30 min；吸取上清，采用 Bradford 法测
定蛋白含量。②蛋白印迹法：等量蛋白行 100 g/L SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳。 电转移后将聚偏氟乙烯（PVDF）膜放入密闭
盒中，立即加入一抗（鼠源乙酰化丝氨酸抗体）1∶500 稀释，4
℃过夜。 用辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗 （稀释度 1∶10
000），检测蛋白表达。结合抗 Acetylated-α-tubulin 单克隆抗体
检测乙酰化的 α-微管蛋白。 ECL 底物化学发光显色，扫描。
上述实验重复 3 次，α-微管蛋白乙酰化与 β 肌动蛋白条
带的灰度值之比作为 α-微管蛋白乙酰化的相对表达水平。
1.4．5 免疫沉淀 （IP） 法检测禹州漏芦含药血清作用后
HSP90 乙酰化水平：①收集细胞：收集经不同浓度的禹州漏
芦含药血清作 24 h 后的 U266 细胞。 ②裂解细胞：加入适量
细胞 IP 裂解缓冲液 （含蛋白酶抑制剂），4 ℃裂解 30 min，12
000 g 离心 30 min 后取上清。 ③预清除非特异性结合蛋白：
取少量裂解液置于 0．5 ml 离心管中， 以备蛋白印迹法分析，
剩余裂解液分别加入 HSP90 抗体和 50 μl protein A/G-
beads，纯化、富集 HSP90 蛋白。 ④免疫共沉淀：4 ℃缓慢摇晃
孵育过夜，4 ℃ 3 000 g 离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心
至管底。 沉淀用 0．5 ml裂解缓冲液洗涤 4 次，3 000 g 离心 2
min。 ⑤免疫检测：加入 15 μl 的 2×SDS 加样缓冲液，沸水煮
沸 10 min，重悬沉淀，离心，吸出上清，再加入 1×SDS 加样缓
冲液，沸水煮沸 10 min，离心，吸出上清，合并两次上清，进行
10％的 SDS-PAGE 电泳，蛋白印迹法检测乙酰化 HSP90 蛋白
表达。 上述实验重复 3 次。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 16．0 统计软件进行统计学处理， 计量数据用
x±s 表示，各组计量数据进行单因素方差分析，以 P＜0．05 为
差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 禹州漏芦粗提药中 α-三联噻吩的含量测定：见表 1。
2．2 免疫印迹技术检测禹州漏芦含药血清作用后 HDAC6
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中国药物与临床 2014 年 7 月第 14 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2014,Vol.14,No.7
表 2 含药血清作用 U266 细胞 24 h 48 h 后
α-微管蛋白乙酰化灰度值定量分析（x±s）
组别 样本数
α-微管蛋白乙酰化灰度值（％）
24 h 48 h
空白对照组 3 0．386±0．006 0．618±0．012
1 g/ml 组 3 0．537±0．017 0．846±0．025
2 g/ml 组 3 0．646±0．021 1．071±0．013
4 g/ml 组 3 0．786±0．028 1．085±0．020
注：与空白对照组比较 P＜0．05
特异底物 α-微管蛋白乙酰化程度：见表 2。
2．3 经免疫沉淀 （IP） 法检测禹州漏芦含药血清作用后
HSP90 乙酰化水平：见表 3。
3 讨 论
血清药理学的方法是一门新兴的体外实验方法，是针对
中药及其复方的中药药理研究方法，用含药血清代替了传统
的中药煎剂或提取物进行实验 ，其科学性更强 ，可信度更
高 ［8］。为中药药理的研究提供一种新的手段。该方法在我国起
步较晚，目前仍处于探究阶段，仍有不足之处，如：①血清本
身内源性成分复杂， 给中药血清药理学研究带来了极大困
难； ②不同个体的动物对药物吸收有一定差异，从而影响到
血清中含药成分及其含量；③因给药剂量、采血时间不同，血
清中含药成分及其含量也不尽相同等都需要进一步探索和
完善。
骨髓瘤细胞分泌大量的免疫球蛋白，产生具有细胞毒性
的错误折叠蛋白，细胞为了生存，需要有效的蛋白降解系统
来清除这些多余的蛋白。 聚集体和蛋白酶体通路是负责降解
细胞毒性错误折叠蛋白。 在肿瘤细胞中，无论是靶向蛋白酶
体通路还是聚集体通路都可导致大量的泛素化蛋白在细胞
累积，从而引起细胞凋亡［9，10］。
染色质的结构受组蛋白翻译后修饰的影响， 如甲基化、
磷酸化、乙酰化等。 蛋白质赖氨酸的乙酰化对参与调控不同
细胞功能的多条信号通路有着重要的调节作用。 负责乙酰化
的是一对相互拮抗的蛋白酶——组蛋白乙酸化转移酶
（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）。 HDAC 作为调控基因
的关键蛋白酶，其功能异常被证实与肿瘤的发生和发展有直
接关系。 HDAC 抑制剂治疗恶性肿瘤是一个新的方向。
既往研究发现，在细胞内 HDAC 的 2 个生理底物 HSP90
和 α-微管蛋白。 HDAC 6 作用于 HSP90，使其发生去乙酰化，
增强 HSP90 与各种客户蛋白结合。 HSP90 参与肿瘤细胞增
殖，血管新生，逃避凋亡的许多蛋白都是 HSP90 的客户蛋白。
MM 患者过表达生长和生存蛋白 ， 包括 cDK4，IGFR 和
pAKT， 分子伴侣 HSP90 能够保护这些蛋白并使其正确折叠
［11］。 HDAC 抑制剂使 HSP90 乙酰化水平增加， 从而干扰了
HSP90 结合那些生长和生存蛋白，HSP90 的客户蛋白降解，
这些客户蛋白将变得不可溶［12，13］。 这些不可溶蛋白在细胞中
沉积将对细胞产生毒性作用 ［14，15］， 导致细胞死亡。 此外，
HDAC 6 可使 α-微管蛋白乙酰化水平降低，促进各种具有细
胞毒性的错误蛋白运送至聚集体， 使其通过聚集体通路降
解。 抑制 HDAC6 的功能还可以使 α-微管蛋白乙酰化水平增
加，从而干扰 HDAC6 和聚集体的组成成分之间的相互作用，
使错误折叠蛋白在细胞内积聚， 产生细胞毒性引起细胞凋
亡。
HDAC 抑制剂主要是通过调节热休克蛋白 90 和 α-微管
蛋白乙酰化水平的状态来调节 MM 细胞的增殖和存活的，而
这两个蛋白都是 HDAC6 的靶蛋白， 因此 HDAC6 在 MM 的
治疗中起着重要的作用。
研究发现， HDAC 带含有半胱氨酸区域，半胱氨酸的 S-
亚硝基化可导致 HDAC 活性下降［16］。禹州漏芦提取物中的噻
吩环可被体内精氨酸代谢产生的 NO 转变为低分子质量巯基
亚硝基化化合物（RSNO），进而向组蛋白去乙酰化酶提供一
氧化氮基团，从而使 HDAC 被亚硝基化而活性下降。 因此我
们推断禹州漏芦可以通过亚硝基化作用降低 HDAC 的活性，
调节蛋白的乙酰化，通过聚集体通路降解，从而发挥抗骨髓
瘤作用。
本实验研究结果表明： 禹州漏芦中主要成分 α-三联噻
吩，是其主要的抗肿瘤成分；含药血清可使 HDAC6 底物 α-
微管蛋白和 HSP90 乙酰化水平增加来抑制多发性骨髓瘤细
胞 U266 增殖，进而诱导其凋亡的作用。本实验初步探讨禹州
漏芦含药血清作用于人多发性骨髓瘤 U266 细胞株可使
HDAC6 胞质底物 α-微管蛋白和 HSP90 乙酰化水平增加，进
而导致多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用，为临床应用禹州漏芦
治疗多发性骨髓瘤提供理论依据。 但禹州漏芦是否是通过阻
断聚集体通路及亚硝基化作用实现抗骨髓瘤作用，对其他类
型骨髓瘤细胞株及骨髓瘤耐药细胞株是否具有抑制增长及
逆转耐药作用？ 有待进一步对上述问题进行实验研究。
参 考 文 献
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表 3 含药血清作用 U266 细胞 24 h 48 h 后
对 HSP90 乙酰化水平的影响（x±s）
组别 样本数
HSP90 乙酰化灰度值（％）
24 h 48 h
空白对照组 3 0．473±0．016 0．757±0．012
1 g/ml 组 3 0．530±0．015 0．835±0．025
2 g/ml 组 3 0．566±0．021 0．939±0．013
4 g/ml 组 3 0．624±0．028 1．096±0．020
注：与空白对照组比较 P＜0．05
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本刊编辑部
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