全 文 ：河北省科学院学报
祁州漏芦提取物 (M E P一 ) l对
人红细胞保护作用的研究
邹岳奇 刘玉翠 陈英珠
(河北省科学院生物研究所 )
张继全 陈幼春
(中国农业科学院畜牧研究所 )
陈韶华
(及涵, .倪 月肠b刃州净 丑叻油 , 论心 及翔间今 2助 , U . S . A )
摘 要
未用关光分光偏振技术以及 S sD 一聚丙 烯酸胺凝胶 电泳 (P A G E )技术 , 研究 了祁州漏芦
提取液 ( M P E一 1) 对人红细胞膜流动性的保护作用以及对细胞膜蛋 白高聚物 ( H M P ) 生成的
影响 。 实验结果表明 , M P E一 1 具有超氧化物歧化酶 s( o D )相似的保护人红细胞的 良好作用 。
为今后研制开发祁州漏芦适应原药物提供 了细胞学依据 。
关扭词 郊州漏芦 ( hR a加 n t ie um u in f lor u m L · DC )
适应原药物 ( A d a tP o g e n dr ug )
膜流动性 (M e m b arn f lu i d it y )
超氧化物歧化酶 (su 讲 r o幻 d e d is m u aset )
十余年来 , 国内外许多药理学研究表明 , 我国传统中药祁州漏芦 , ( R h a op nt i cu m u in n 。
r
um L
.
E K二)是一种适应原药用植物 ,它具有 良好的抗脂质过氧化物生成 ,抗动脉粥样硬化 ,
增强细胞免疫功能以及延缓机体衰老等作用 l[ 一 7〕。 此外 , 医学生化研究表明 ,机体在代谢过程
中 , 产生一种有害物质— 超氧阴离子自由基 , 它会引发细胞膜脂质过氧化 , 导致细胞损伤和机体老化 , 而且还与某些疾病的发生密切相关 。 超氧化物歧化酶 ( su ep r o 幻 d e d is m u姗 , 简称 Son )是机体内唯一可清除超氧阴离子自由基的活性酶卜 , 。〕 。 为了在细胞水平上研究祁州
漏芦提取物 (M p E一 1) 对超氧阴离子自由基诱发细胞损伤的保护功能 ,探讨其抗衰老作用机
理 , 我们选用特别易受脂质过氧化损伤的人血红细胞为材料开展有关研究 ,取得了令人满意
的结果 。 下面特报道本研究的主要实验情况 。
DOI : 10. 16191 /j . cnki . hbkx . 1994. 04. 005
第 4期 邹岳奇等: 祁州漏芦提取物M (pE一) l对人红细胞保护作用的研究2 1
1 材料与方法
1
.
1 仪器与试荆
冷冻高速离心机系 日本 日立公司产品; F R 50 4荧光分光光度计 (带偏振装置) 系 日本岛
津制作所产品 , D F 一 C 型恒压恒流电泳仪及垂直板电泳槽为北京东方仪器厂产品 。 荧光试
剂 D p H ( l , 6一 d ip h e n y l一 1 , 3 , 5一 h e xa tr i e n e )及+ 二烷基硫酸钠 ( S sD )系美国 is 脚a 公司产品 ;
丙烯酞胺 ( cA r ) , 甲叉双丙烯酞胺 ( iB s ) , 四甲基乙二胺 (T EM E D )系华美生物工程公司产品 ;
乙二胺四乙酸 (E D T A )和二琉基苏糖醉 ( D T T )等其他试剂均为国产分析纯 。 人血红细胞在河
北省血液中心现采 。 祁州漏芦购自河北省安国市中药材市场 。
1
.
2 红细胞膜的制备
一 参照文献 l[ ’ .2J 〕提供的方法进行 。 将新鲜人血液离心 ,弃白血球 、 血小板及纤维蛋白原 ,
反复用生理盐水洗涤红经胞并作低渗溶血 。 离心后取红细胞膜多次洗涤至纯净为止 。 在显
微镜下观察 ,细胞膜应是单个的和完整的 ,不应见到膜碎片 。
1
.
3 M p E一 1 保护细胞膜流动性的试验
据文献 ls[ · ’ 4] ,红细胞膜经邻苯三酚处理后 ,其流动性明显下降 ;而事先加入 so D 等保护
剂后能使细胞膜免受或减轻损伤 。 膜流动性可用荧光偏振度 (P 值 )或微粘度 ( n 值 )测量 , p
值或 n 值越大 ,膜流动性越小 。
本试验共设 4 组膜作不同处理 , 它们是 ( 1) 正常对照组 : 红细胞膜样品中不加邻苯三酚
(超氧阴离子自由基产生剂 ) 也不加任何保护剂 ; ( 2) 损伤对照组 ,膜样品 中只加邻苯三酚 ;
( 3 )S O D 对照组 : 膜样品中依次加入 s o D (保护剂 )和邻苯三酚 ; ( 4) M p E一 1试验组 : 膜样 品
中依次加入 M p E一 1和邻苯三酚 。 每组均设三份膜样品 。
按表 1 列出的次序及液量加入各种液体 。 温育一定时间后终止反应 ,洗涤后加入荧光试
剂 s p H 液 (2 x 1 0一 6 m of / )L , 温育离心后悬浮于磷酸钠盐缓冲液 ( P B s , 0 . O l m of / )L , 置荧光分
光光度计内测出各组荧光强度 (I 值 ) ,激发波长为 3 6 2n m ,发射波长为 4 3 2n m 。 按以下公式计
算出 p 值和 n 值 :
I洲 I v v一 I群 I银
I朋 I v v + I , I v ,
式中 I , 为起偏器和检偏器光轴均在水平方向时的荧光强度 , vI v为起偏器和检偏器光轴均在
垂直方向时的荧光强度 ; I , v为起偏器光轴在水平方向 , 检偏器光轴在垂直方向时的荧光强
度 ; vI H为起偏器光轴在垂直方向 ,检偏器光轴在水平方向时的荧光强度 。
2 P
0
.
4 6一 P
D p H 液的配制 :先将 D p H 溶解在四氢吠喃中 ,制成 Z x 1 o 一 3m ul / L 溶液 ,贮于 4℃暗处 。 临用
前以 P sB 稀释至 Z x l o一 6m ul / L , 注意稀释时需猛烈振摇 3一 4分钟 。
1
.
4 M p E一 1 防止膜蛋白过氛化交联的试验
据文献 ls[ 〕 ,细胞受到邻苯三酚造成的过氧化损伤时 , 某些膜蛋白会发生交联形成膜蛋
白高聚物 ( H M )P , 从 s沈匕以 G E 图谱中可看到一条正常对照所没有的清晰的 H M p 区带 。
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本实验据此设计 Mp E一 1对 H Mp 生成的影响 ,共设 4 个膜样品组 ,具体的不同处理与上述
膜流动性试验的相同 。 本实验在相同条件下重复 2 次 。
衰 1 人红细饱膜流动性试验加液衰
次序 名 称 正常组 损伤组 S O D 组 M P E一 1 组 ·
( n = 3 ) ( n = 3 ) ( n = 3 ) ( n = 3 )
l 细胞膜悬液 (而 ) 2 . 0 2 . 0 2 . 0 2。 0
2 保护剂液 (耐 ) 0 0 0 。 4 0。 4
3 邻苯三酚 (而 ) 0 4 0 4 0 4 0
4 P BS (m l ) 0
。
4 4 0 0 0
〔注〕每 0 . 4而s o D 液中含醉活 2` u0 ;每 0 . 刁耐 M甲 E一 1液中含 1 克漏芦的有效成分 ;邻苯三酚浓度为 6 0 m m o l / L 。
取 0 . 5而 红细胞膜悬浮液 ,依次加入 1 0卯 l保护剂液 s( o D 或 MPE 一 1 ,正常组和损伤组
加 1 0 0协l p B S )和 6卜15 o m m o l / L 邻苯三酚液 (正常对照组不加 ) , 1 3 , o o o r帅 高速离心去上清 ,
膜沉淀物用 1 0 0以 Z x 样品缓冲液悬浮 , 温育后离心弃沉淀 , 留上清液作为电泳样品 , 上样量
均为 2邻 1。 电泳采用 5 . 6%凝胶 , 电压 10 V0 , 电流强度 4 0m A , 电泳时间 2 小时 。 电泳结束后
卸胶板以考马斯亮兰 R 一 2 50 染色 ,脱色后观察电泳结果 。 sD 一 P A G E 所用试剂被及凝胶配方如下 :
( l ) ^ e r
一
B is 液 : 含 c^ r 4 0% ( w / v ) , isB l . 5% ( w / v ) 。
( 2 ) 1 0 x 电泳缓冲液 : 每 2 0 0而 中含 4 0而T r i s ( 1 . oiln o / L ) , x o而 E n T A ( 0 . Zm of / L ) 和
10而 乙酸钠 ( 2 . om ol / L ) 。
( 3 ) 5
.
6%凝胶 : 每 1 0 0回 中含 1 4m l A c r 一悦 s 液 , 10 lur l o% s D s 液 , 1 0回 1 . 5% ( w / v )过硫酸
馁液以及 2 5川T EM E D
( 4 ) Z X 样品缓冲液 : 每 1 0 0m l 中含 sm l o . l %澳酚兰 , 2 0m一1 0% s邢 液 , 4m l T r招一 H e e ( 0 .
s m ul / L
,
PH 昌
.
0 )
,
0
.
3 6m l E D T ^ ( 0
.
5 5m o l / L )
,
1
.
2 4目D T T 以及 2 05 蔗糖 。
2 结果与讨论
有关膜流动性保护试验的荧光偏振法测定结果 由表 2 给出 。
从表 2 显示的实验结果可以看到 , 人红细胞膜经邻苯三酚处理后 ,膜流动性明显下降 ,
微粘度平均值 (动由 3 . 80 泊上升至 5 . 1 泊 。 而事先加入一定量 M PE 一 1 后再加邻苯三酚 ,
可明显减轻细胞膜的受损程度 ,膜流动性下降很少 , 其 云值为 4 . 14 泊 , 比损伤对照组的云值
(5 .’ n 泊 )要低得多 , 已相当接近于 S O D 对照组的 云值 (4 . 02 泊 ) 。 因此 ,可确认祁州漏芦含
有类似 s o D 的活性物质 , 具有保护细胞及机体免受超氧阴离子 自由基造成的过氧化损伤的
作用 。
有关膜蛋白过氧化交联的 SDS 一 P A G E 实验重复二次 ,取得相同的结果 。 电泳图谱由图
1 显示 。
第 4期 邹岳奇等: 祁州漏芦提取物 ( M甲 E一l ) 对人红细胞保护作用的研究3 2
衰 2人红细饱旗各组I 位 、P 值及 n值
组别l 朋I v vI ”vI v H荧光偏振度 微粘度 (泊)
P P 士 S n云I : =S
正常对照组 26。3 7 0 .4 2 2 .1 5 2。 0 0。3 0 60 .3 01 士 0 .1 0 03 .973 . 80士 0 .3 4
( n~3 )
3 2
。
3 5 0
.
53 2
.
5 27
。
60
。
2903
.
41
4 2
.
6 9 2
.
3 3 9
.
3 5 8
。
0 6
.
3 07 4
.
0 2
损伤对照组5 2。 0 40。 9 24。 7 21 .7 0 .1 3 20 .3 2 8士 0 .0 4 2 2 .5 2 2 .1 1 士1 .1 2
( n~3 )
27
。
24 4
.
1 4 2
.
53 2
.
0 4
.
3 3 5 6
.
61
31
.
4 2 9
。
831
.
9 25
。
20
。
1 3 4 8
.
4 8
O SD 对照组 2 8。 24 4 .5 27 .23 2 .0 6 .3 23 0 .3 0 6士 0 .01 5 4 .3 7 4 .0 2士 0 .6 2
( n=3 )
5 2
。
3 0 9
.
24 2
。
1 9 2
。
20
.
3 003
。
7 4
4 2
.
3 27
.
3 3 2
.
5 20
.
0 9
.
25 93
。
5 8
MP 〔卜1 试3 5 .253 。3 3 8。 6 29 .1 0。31 0 9 .1 3 0士 0 .0 24 4 .5 24 .1 4士 0 .3 5
验组 ( n=3 )3 0。5 4 9 .29 8.5 6 2 .0 6, 3 0 3 3 . 8 5
3 8
。
6 5 6 一2 3 6
.
0 3 1
.
9 0
.
3 0 8 4
.
0 4
D日自目。目口日曰Al目日IL曰口
H M P e 州卜
带 1
带 2
一 )
「一一 一 {
二
! {口
曰 . . . .
图 1 \ M p E 一 1 在防止膜蛋白高聚物 ( H M )P 生成中的作用的人红细胞旗蛋白 s D 6 一 PA GE 图谱 。
图中 , A 为正常膜蛋白组的泳谱 ; B一 D 为经邻苯三酚过氧化处理的膜蛋白组分的泳谱 ,其中 B 不加保
护剂 , C 加 s o D , D 加 M甲 E一 l 。 电泳条件为 1 0 0 v 恒压 , 电流强度 40 m A ,电沪时间 Zhr 。
从图 1 可以看到 ,与正常对照组膜蛋白泳谱 A 比较 , 损伤对照组膜蛋白泳谱 B 中带 1
和带 2 位置的蛋 白量明显减少 ,并在其上方十分清晰地出现一条膜蛋白高聚物泳带 ( H M p ) , .
这表明邻苯三酚产生的过氧化作用促使某些膜蛋 白发生交联 ,形成了膜蛋 白高聚物 。 而分别
加有保护剂 s 0 D 及祁州漏芦提取物 M P E一 1 的膜蛋白泳谱 C 和 D 则显示 , 虽然这两组膜样
品经过同样的邻苯三酚过氧化处理 ,但它们的 H h l p 泳带却很细 , 表明所产生的膜蛋白高聚
物甚少 。 但是 ,它们的 H M p 泳带并不能完全消除 。 分析其原因 ,很可能与超氧阴离子自由基
歧化反应产生的 H Z o Z 有关 。 文献 l[ `〕指出 , H ZO Z 及其与超氧阴离子自由基反应生成的 O H 一均
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具有很强的氧化能力 ,这两种氧自由基也可使细胞膜受到一定程度的过氧化损伤 ,从而使一
些膜蛋白 (如膜收缩蛋白 )产生交联 , 生成膜蛋白高聚物 。
鉴于上述两项实验所获的结果 , 我们初步认为 ,祁州漏芦提取物 ( M p E一 l) 对人红细胞
具有明显的保护作用 ,它可以避免或减轻膜蛋白遭受过氧化损伤 , 从而达到防治动脉粥样硬
化等多种疾病以及延缓细胞和机体的衰老的目的 。 本研究可为今后开发祁州漏芦保健型药
物提供细胞学依据 。
参考文献
LIJ F 侧口 IS W o d 五 N . R . et al , E以价ol m允 助 d M a山幼匕目 n an t R e 明处 rI c h , (目` ) W毗如 e r H , et al ,人口 d e而 c F怡巴困 , 19 8 5
[ 2 ]邹莉菠等 ,沈阳药学院学报 , 峨 : 2 5 5 , 1 , 8 7
〔3〕付乃武等 , 中草药 , 2 0 : 2 2 7 , l , 5 9
〔魂 ]卢泳才等 , 中华医学杂志 , 6 5 : 75 0 , 29 5 5
s[ 〕顾立刚等 , 中国免疫学杂志 , 9 ( 6 ) · 38 , 1 9 9 3
【6] 龚树生等 , 中华老年医学杂志 , 2 : 49 , 19 83
[ 7〕崔文英等 ,北京医学院学报 , 3 : 2 02 , 1 9 7 9
[ 8〕M c c o r d J . M . et 目 , J . B IO I c 为e m , 2 4 4 ( 2 2 ) : 6 0 4 9 , 19 6 9
[ 9」M ar kl u n d S , L et 目 , a 仇 〔为 jm , A 日泊 12 6 : 4 1 , 19 8 2
[ 10〕B旧】k ley G . B , s ur 名e口 , 9 4 : 4 0 7 , 1 98 3
〔1 1〕。 川助 J . T . et al , 润J曲 ,翻沈h e m ,翻哪角 y , 1 0 0 : 1 1 9 , 1 9 6 3
〔12〕轰松青等 , 北京医学院学报 , 2 5 : 2弓9 , x g s 3
〔13〕林克椿等 , 生理科学进展 , 1 6 : 8 3 , xg 8 5
【14〕秦德安等 , 生物化学与生物物理进展 , 16 : 13 扭, 19 8 9
[ 15 ]H OC 卜留 t e i n p
. , F川 e ar t i o n rP OC e 血吃 .确。 ( 2 ) : 15 3 , 1 9 5 1
S T U D IE S O N T H E E F F E C T S O F R H A P O N T IC U M
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h u r n a n e r y t h r oc y t e r ju s t l i k e t h e e nz y m e
一
su ep r o x id e d is m u ta se ( S O D )
.
tI pt vo i d es
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