全 文 ：羊耳菊提取物的抑菌动力学研究
刘胜贵 1, 2 ,陈富城 1 ,李军 1
(1.怀化学院生命科学系 ,湖南怀化 418008;2.怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室 ,湖南怀化 418008)
摘要　[目的 ]研究羊耳菊不同浓度提取物对细菌存活率随时间变化的关系 ,以及不同pH值条件下提取物的抑菌效果。 [方法]以金黄
色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌为供试菌种 ,绘制时间杀菌曲线和浓度杀菌曲线。在提取物浓度为最低抑菌浓度(MIC)时培养 24h,
测定不同 pH值条件下的抑菌率。 [结果]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌的MIC、最低杀菌浓度(MBC)分别为
62.5、125.0mg/ml和 125.0、250.0mg/ml。绘制了羊耳菊提取物 16MIC、4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC和对照条件下的杀菌曲线。羊耳菊
水提物抑菌作用最适pH值为 6～ 8。 [结论]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用在较高浓度时并没有进一步提高杀菌速度 ,表
现为时间依赖性 ,但对甲型副伤寒沙门氏菌表现为浓度性依赖性。
关键词　羊耳菊提取物;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度;抑菌动力学;最适pH值
中图分类号　S682.1+1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)26-14322-03
AntimicrobialDynamicsofInulacappaExtracts
LIUSheng-guietal　(DepartmentofLifeSciences, HuaihuaUniversity, Huaihua, Hunan418008)
Abstract　[ Objective] InordertoinvestigatetheefectsofdiferentconcentrationsofInulacappaextractsonviabilityofStaphylococcusaureus
andSalmonelaparatyphiforvarioustimeexposures.[ Method] Thetime-kilingcurvesandconcentration-kilingcurvesagainstS.aureusand
S.paratyphiwereinvestigatedattheconcentrationof1/2×MIC, 1×MIC, 2×MIC, 4×MICand16×MIC, andthesterilizationrateofInula
cappaonthemicroorganismswasdeterminedatdiferentpH.[ Result] TheMICsandMBCofInulacappaagainstS.aureusandS.paratyphi
are62.5, 125.0and125.0, 250.0mg/mlrespectively.OptimumpHvaluesoftheextractsofInulacappaagainstS.paratyphiare6-8.
[ Conclusion] Resultsindicatedthattheplantextractscouldbetime-dependentforS.aureus, andaconcentration-dependentforS.paratyphi.
Keywords　Inulacappaextracts;Minimuminhibitionconcentration(MIC);Minimumbactericidalconcentration(MBC);Antimicrobialdy-
namics;OptimumpH
作者简介　刘胜贵(1965-),男 ,湖南宁乡人 ,硕士 ,教授 ,从事民族药
用植物活性成分研究。
收稿日期　 2010-05-18
　　羊耳菊(InulacappaDC.)系菊科旋覆花属植物 ,亚灌
木 ,在我国南方分布较为广泛 ,主要生长在亚热带和热带的
低山和亚高山的湿润或干燥丘陵地 、荒地 、灌丛或草地 ,在酸
性土 、砂土和粘土上都常见 ,海拔 500 ～ 3 200 m[ 1] 。羊耳菊
味苦微辛 ,性平无毒 ,全草或根花供药用 [ 2] 。经过调查了解 ,
湖南通道县侗族民间常用其治疗疟疾 、痢疾 、风湿关节疼痛 、
泄泻 、产后感冒 、肝炎 、痔疮和疥癣 ,中兽医也常用来治疗牛
的痢疾。目前 ,国内 、外尚没有关于羊耳菊抑菌作用的研究
报道。
对传统的抗菌药物研究都停留在抗菌药的最低抑菌浓
度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的检测 ,但是 MIC和 MBC
不能反映抗菌药物抗菌活性随时间变化的过程 。笔者根据
药效动力学研究方法 [ 3] ,研究了羊耳菊水提取物抗菌浓度与
抗菌效果随时间的变化 ,以及抗菌药在不同 pH值下对抗菌
效果的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　药用植物。羊耳菊于 2006年 12月采于湖南省通道
侗族自治县。
1.1.2　供试菌种。金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus
CCTCCAB91053),甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonelapara-
typhiA),均由怀化学院微生物实验室提供。
1.1.3　培养基 LB(Luria-Bertani)。液体基:蛋白胨 10 g,
NaCl5 g,酵母粉 5g,用 1 mol/LNaOH调节 pH值至 7.0,双
蒸水定容至 1 000ml。LB固体培养基:LB液体培养基中加
1.6%的琼脂粉 ,煮沸溶化后定容 。
1.2　方法
1.2.1　羊耳菊提取物的制备。将羊耳菊的叶洗净放入干燥
箱中 ,在 60℃下干燥至恒重 ,粉碎后过 20目筛。称取 60 g
羊耳菊叶粉末放入 500 ml的烧杯中 ,加入 5 ～ 6倍体积的蒸
馏水 ,加热煮沸后小火煎熬 30 min,纱布过滤除去沉淀 ,滤液
经 8 000r/min离心 10min,分别把上清液浓缩至相当于含原
材料 1 000、2 000、4 000 mg/ml,灭菌后放入冰箱里备用 。
1.2.2　菌悬液制备。将金黄色葡萄球菌 、甲型副伤沙门氏
菌活化后 ,挑取单菌落与无菌生理盐水中混合 ,并用生理盐
水调至 0.5McFarland单位的标准接种物 [ 4] ,即为 1×108 ～ 2
×108 cfu/ml的菌悬液浓度 。用无菌生理盐水按 10倍稀释
法将标准接种物配成 106 cfu/ml的菌悬液 ,备用。
1.2.3　MIC和 MBC的测定。在无菌条件下 ,用 LB培养基
将羊耳菊提取物稀释成各含 1 ml的倍比系列试管 ,然后向各
管中加入 0.1 ml的含 1×106 cfu/ml的细菌悬液 ,将培养物
置于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h,观察培养物生长情况 ,以
能抑制细菌生长的最小药物浓度为 MIC。并从每试管中取
0.1ml培养物涂布在固体 LB培养基平板中 ,以试管培养物
中无细菌生物的提取物浓度为 MBC。
1.2.4　时间杀菌曲线和浓度杀菌曲线。根据试管二倍稀释
法测出的结果 ,将羊耳菊提取物加入 LB培养基中 ,采用二倍
稀释法对提取物进行稀释 ,从而配成体积为 10 ml,羊耳菊提
取物浓度分别为 16 MIC、4 MIC、2 MIC、MIC、1/2MIC及空白
对照的系列试管培养基 ,分别加入 0.1ml浓度为 108 cfu/ml
的金黄色葡萄球菌 ,将培养物置于 37 ℃,转速为 180 r/min
的摇床中培养 24 h。培养 2、4、8、12、16、24 h后分别取培养
物作 10倍系列稀释 ,取 0.1ml的各稀释度培养物涂布于 LB
固体平板上 ,于 37 ℃下培养 24h作菌落记数 ,同一稀释度试
验作 3次重复。以时间为横坐标 ,以菌落形成单位(cfu)的
责任编辑　熊章琴　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(26):14322-14324
对数为纵坐标 ,绘制羊耳菊提取物的杀菌曲线 [ 5-6] 。
羊耳菊提取物对甲型副伤寒沙门氏菌的时间杀菌曲线
和浓度杀菌曲线按上述方法绘制。
1.2.5　不同 pH值对提取物抑菌效果的影响。以甲型副伤
寒沙门氏菌为供试菌种 ,先将 LB固体培养基灭菌后 ,取羊耳
菊提取物加入培养基中配制浓度为 MIC,然后用 pH计测定
酸碱度 ,并用 1mol/LNaOH溶液将培养物分别调节 pH值为
5、6、7、8、9,将培养物倒平板 ,取 0.1 ml浓度为 104 cfu/ml的
甲型副伤寒沙门氏菌悬液均匀涂在平板上 ,以不含提取物的
相同 pH值的平板作对照试验 。在 37 ℃的恒温培养箱中培
养 24 h后 ,按平板菌落记数法记数 ,计算抑菌率 [ 7] 。
抑菌率(%)=(对照组的菌落数 -提取物平板菌落
数)/对照组的菌落数 ×100
2　结果与分析
2.1　羊耳菊提取物 MIC和 MBC值　通过检测试管培养物
的浊度变化和培养物在平板上菌落生长情况 ,分别测定了羊
耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌的
MIC、MBC。
　　由表 1可知 ,羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副
伤寒沙门氏菌都有较强的抑菌作用 ,但对金黄色葡萄球菌抑
菌作用较强。 2种试验菌的 MIC值均略小于 MBC值。
表 1　羊耳菊提取物对 2种试验菌的MIC和MBC值
Table1　MinimuminhibitoryandbactericidalconcentrationsofInula
cappaextractsonS.aureusandS.paratyphi mg/ml
试验菌种
Teststrain MIC MBC
Staphylococcusaureus 62.5 125.0
SalmonellaparatyphiA 125.0 250.0
2.2　羊耳菊提取物抗菌效果　采用了抗菌物质临床研究中
常用 6个浓度梯度 ,即 16MIC、4 MIC、2MIC、MIC、1/2MIC和
对照 ,将 6个浓度梯度下存活的金黄色葡萄球菌数量(用常
用对数表示)随时间的变化结果绘制杀菌曲线(图 1), 24 h
内培养物中存活的金黄色葡萄球菌数量与提取物浓度的关
系如图 2所示。用相同方法将甲型副伤寒沙门氏菌存活的
数量随时间变化的试验结果绘制杀菌曲线(图 3), 24 h内甲
型副伤寒沙门氏菌存活数量与提取物浓度关系如图 4所示 。
图 1　羊耳菊水提物对金黄色葡萄球杀菌曲线
Fig.1　Time-bactericidalcurvesofextractsofInulacappaex-
tractsagainstS.aureus
　　可知 ,羊耳菊的杀菌速度并不随药物浓度增加呈持续加
强现象 ,表明羊耳菊对金黄色葡萄球菌表现为时间依赖性抗
图 2　24h内金黄色葡萄球菌活菌数与羊耳菊提取物浓度的关系
Fig.2　ThechangeofthenumberofS.aureusindiferentcon-
centrationofInulacappaextractsin24h
图 3　羊耳菊提取物对甲型副伤寒沙门氏菌的杀菌曲线
Fig.3　Time-bactericidalcurvesofextractsofInulacappaa-
gainstS.paratyphi
图 4　24h内甲型副伤寒沙门氏菌的活菌数与提取物浓度的关系
Fig.4　ThechangeofthenumberofS.paratyphiindiferent
concentrationofInulacappaextractsin24h
菌作用 ,对甲型副伤寒沙门氏菌表现为浓度性依赖抗菌作
用。 2种试验菌在没有提取物处理时 , 4 ～ 12 h内为对数生长
期 , 12 ～24h处于稳定期 ,并且在 24 h后开始进入衰亡期。
在提取物 MIC处理下 ,金黄色葡萄球菌将前 4 h处于抑制状
态 ,在 4 h后又出现重生长现象。在提取物 MIC下 ,甲型副
伤寒沙门氏菌 0 ～ 8h处于抑制状态 , 8h后出现重生长现象。
在 2MIC、4 MIC、16 MIC下 ,对 2种供试菌来讲 ,药效发挥最
佳作用时间段基本上都集中在 2 ～8 h。且这 3个浓度下 , 4h
时基本上都处于半致死状态 。
2.3　不同 pH值条件下羊耳菊水提物的抑菌效果　在含
12.5%羊耳菊提取物固定培养基中 ,通过涂布平板法计算细
菌的菌落 ,研究不同 pH值条件下细菌生长情况。由表 2可
知 ,羊耳菊提物在 pH值为 6 ～ 8时抗菌效果最强。
1432338卷 26期　　　　　　　　　　　　　　　　　　刘胜贵等　羊耳菊提取物的抑菌动力学研究
表 2　不同 pH值条件下羊耳菊提物对甲型副伤寒沙门氏菌抑菌效果
Table2　EffectsofdifferentpHvaluesonantibacterialactivityofInula
cappaextractsagainstS.paratyphi
pH值
pHvalue
对照∥cfu/ml
Control
试验组菌落形成单位cfu/mlUnit
抑菌率∥%Inhibitionrate
5 289 83 71.3
6 +++ 0 100.0
7 +++ 0 100.0
8 105 0 100.0
9 485 96 80.2
　注:+++表示菌落数太多 ,难以记数。
　Note:+++standsfortoomanystrains, itishardtocount.
3　结论与讨论
羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏
菌的 MBC/MIC相等 ,均为 2,其比值比较小 ,可见羊耳菊提
取物为杀菌剂 [ 3] 。羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌最佳抗菌
浓度为 4 MIC,羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用表
明 ,在浓度 2 MIC以上的抗菌效果并不随浓度提高而显著提
高 ,由此可知 ,羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用表
现为时间依赖关系。羊耳菊提物对甲型副伤寒沙门氏菌最佳
作用浓度为 16 MIC。不同浓度对甲型副伤寒沙门氏菌其抗菌
效果与药液浓度呈正相相关 ,并且表现出时间依赖型。在 2
MIC、4 MIC、16MIC这 3个浓度下 ,把细菌全部杀死的时间分
别出现在 16、12、5h,并且后面时间段并未出现重新生长现象。
对中草药的传统研究一般都停留在检测 MIC和 MBC,
但 MIC和 MBC不能反映抗菌药体外抗菌活性随时间变化的
过程 ,该文主要在体外研究了抗菌药的量效随时间变化的关
系 ,这为临床用药提供了科学依据 [ 3] 。
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(上接第 14321页)
菝葜皂苷元选用蒸发光散射检测器 。它是目前较好的通用
型检测器 ,比视差折光检测器灵敏度高 ,而且可以用梯度洗
脱的分离条件 。该试验选用胆固醇作为内标 ,建立了测定菝
葜皂苷元含量的内标法。采用内标法 ,避免了用外标法时对
照品分析与样品分析 2个过程间仪器状态的波动而造成的
定量误差。工作曲线建立之后 ,测定时只需分析样品溶液就
可定量 ,从而提高测定的准确性。试验中通过反复优化 ,确
定了蒸发光检测器合适的雾化温度和蒸发温度 ,提高了检测
的灵敏度和图谱的质量 ,保证了良好的检测 。
表 3　野生和栽培西陵知母菝葜皂苷元含量比较
Table3　Comparationofsarsasapongenincontentbetweenwildand
cultivatedXilingzhimu
类别
Types
样品个数
Samples
平均值∥%
Mean RSD∥%
野生 Wild 2 1.60 17.3
栽培 Cultivated 13 1.47 20.4
　　由于野生资源不断减少 ,依靠规范化种植生产是保证中
药材供应的根本途径。目前市场上知母药材中野生和栽培
的并存。多数中药材的栽培品与野生道地药材质量有一定
的差异。栽培实践证明 ,野生道地药材的原产地适合该种药
材的种植 ,所生产的人工药材与野生道地药材质量间差异较
小 ,即道地药材的野生原产地有规范化栽培生产的最佳适宜
性 。研究表明 ,西陵知母也遵循这样的规律 。易县栽培品与
野生差异较小 ,质量优于其他来源的知母 ,已逐渐成为道地
西陵知母的组成部分。易县地处太行山区 ,有广大的丘陵山
地 ,不适合大面积的粮食生产。而知母生命力强 ,耐干旱贫
瘠 ,适应山地丘陵。采取半野生种植 ,只需春季将知母苗移
栽山地 ,无需人工灌溉 ,基本不需要后期的管理 ,在半野生环
境下生长 ,生产成本较低。易县栽培知母已经形成规模 ,在
易县出产知母中占有较高比例。近年来随着知母药材市场
价格的提高 ,半野生化栽培生产知母药材已经成为当地群众
致富的一条好途径。
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