全 文 ：狼爪瓦松全草粗提物体外抑菌作用研究
任 荣1，柴军红1，金志民1，弥春霞1，肖 杰1，熊需海2
(1．牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江 157012;2．大连理工大学化工学院，辽宁大连 116012)
摘要 ［目的］研究狼爪瓦松(Orostachys cartilaginous A． Bor)全草粗提取物体外抑菌作用。［方法］采用液 －液萃取法对狼爪瓦松的体积
分数为0． 75的丙酮提取液的活性成分进行初步分离，制备氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水相萃取物。采用滤纸片法和2倍连续稀释法测定
了各相萃取物对 4种供试菌的体外抑菌效果。［结果］狼爪瓦松全草体积分数为 0． 75的丙酮提取液的各萃取相对金黄色葡萄球菌、枯
草芽孢杆菌、大肠杆菌和普通变形杆菌有不同程度的抑菌活性，其中氯仿萃取相、乙酸乙酯萃取相对金黄色葡萄球菌显示了较好的抑菌
效果，最低抑菌浓度均为 1． 25 mg /ml。［结论］中药狼爪瓦松全草的抑菌活性成分主要存在于氯仿萃取相和乙酸乙酯萃取相中，为狼爪
瓦松抑菌药物的开发提供了理论依据。
关键词 狼爪瓦松(Orostachys cartilaginous A． Bor);体外抑菌;滤纸片法;最低抑菌浓度
中图分类号 S567． 23 + 9 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)14 －08353 －02
Study on Antibacterial Activities of Crude Extracts from the Whole Herb of Orostachys cartilaginous A． Bor in Vitro
REN Rong et al (School of Life Science and Technology，Mudanjiang Teachers College，Mudanjiang，Heilongjiang 157012)
Abstract ［Objective］To study antibacterial activities of crude extracts from the whole herb of Orostachys cartilaginous A． Bor in vitro．［Meth-
od］ liquid － liquid extraction technique was applied to isolate active ingredients from 0． 75 acetone extracts for preparing chloroform，ethyl ace-
tate，normal butanol and water phases． The antibacterial activities of extraction phases on 4 tested strains in vitro were investigated using the filter
paper method and double dilution method．［Result］Extraction phases from 0． 75 acetone extracts had antimicrobial activities against Staphylocco-
cus aureus Rosenbach，Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn，Escherichia coli and Proteus vulgaris in varying degrees． Chloroform and ethyl acetate
extraction phases were provided with strong antibacterial activities against Staphylocoaus aureus with minimal inhibitory concentration at 1． 25
mg /ml．［Conclusion］Active ingredients of Orostachys cartilaginous A． Bor plant were mainly existed in chloroform and ethyl acetate phases，
which could provide a scientific basis for developing antibacterial agents from Orostachys cartilaginous A． Bor．
Key words Orostachys cartilaginous A． Bor;Antibacterial activities in vitro;Filter paper method;Minimal inhibitory concentration
基金项目 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551514) ;牡丹江师
范学院教学改革工程项目(10-XY01038)。
作者简介 任荣(1982 － ) ，女，河南安阳人，助教，硕士，从事天然药物
化学的科研和教学工作，E-mail:swxrr1@ 126． com。
收稿日期 2011-02-21
狼爪瓦松(Orostachys cartilaginous A． Bor)属于景天科
(Crassulaceae)瓦松属(Orostachys)植物，主要产于山东、内蒙
古、辽宁、吉林和黑龙江［1］。瓦松属植物具有较高的药用价
值，有广阔的开发应用前景。临床应用广泛，多用于抗菌、消
炎，抗肿瘤、强心等，目前以瓦松为原料开发的瓦松栓已成为
治疗宫颈糜烂的常用药物［2 －3］。笔者以狼爪瓦松为材料，采
用体积分数为 0． 75的丙酮水溶液提取，提取液经石油醚、氯
仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取其中的有效成分并对其抑菌活性
进行了研究，以期为寻找新的具有抑菌活性的中药资源提供
理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料。狼爪瓦松，采集于牡丹江市镜泊湖熔岩
地区，经鉴定为景天科瓦松属植物。
1． 1． 2 供试菌种。大肠杆菌(Escherichia coli) ，金黄色葡萄
球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) ，普通变形杆菌(Pro-
teus vulgaris)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis (Ehrenberg)
Cohn)均由牡丹江师范学院生命科学与技术学院微生物学实
验室提供。
1． 1． 3 主要试剂。二甲基亚砜 DMSO，由天津市化学试剂一
厂生产;头孢氨苄霉素(批号:20100209) ，由哈药集团三精制
药四厂生产;丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和正丁醇等化学试
剂均为国产分析纯。
1． 1． 4 主要仪器。YXQ-LS-50SⅠ型立式压力蒸汽灭菌器，由
上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;ZH-WY200B 型摇
床，由上海智城分析仪器制造有限公司生产;DHP-2000 型电
热恒温培养箱，由天津市华北试验有限公司生产;无菌操作
台，由江苏苏州洁净技术研究所生产;SHZ-D(Ⅲ)型循环水真
空泵，由巩义市予华仪器责任有限公司生产;RE-52AA 型旋
转蒸发器，由上海亚荣生化仪器厂生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 提取液的制备。将采集的狼爪瓦松全草清洗干净、
阴处晒干，粉碎，过筛。准确称取 300 g 干粉，用体积分数为
0． 75的丙酮溶液室温下浸提 3次(每次 600 ml，2 d) ，合并提
取液，减压浓缩至无丙酮味，静置过夜，得浓缩液 500 ml，密
封保存于 4 ℃冰箱中备用。
1． 2． 2 活性物质的初步分离。将制备好的提取液依次用等
体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每种溶剂
萃取 3次，合并 3次萃取液，减压浓缩至蒸干溶剂，分别获得
石油醚萃取相(A0)、氯仿萃取相(A1)、乙酸乙酯萃取相
(A2)、正丁醇萃取相(A3)和水萃取相(A4)。其中氯仿相 5 g
用 10 g粗硅胶(80 ～100目)拌样，200 g 硅胶(100 ～ 200 目)
进行硅胶柱层析。以氯仿 －甲醇(1∶ 0、10∶ 1、7∶ 3、5∶ 5、0∶ 1)为
流动相进行梯度洗脱，TLC 监测合并相同馏分，得到 5 个极
性段 A11 ～ A15段。A11 ～ A13做了抑菌试验，A14、A15由于质量
太少未做进一步研究。
1． 2． 3 样品的制备。称取适量的 A1、A2、A11 ～ A13，溶于
DMSO中配制成 10 mg /ml的溶液。称取适量的 A3 和 A4，溶
于 DMSO中配制成 100 mg /ml的溶液。头孢氨苄霉素(T)配
制成 10 mg /ml作为阳性对照。每种样品经微孔滤膜(孔径
0． 22 μm) ，过滤灭菌后待用。A0 萃取物质量太少，因此未被
选用。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(14):8353 － 8354，8356 责任编辑 侯美灵 责任校对 马君叶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.14.174
1． 2． 4 培养基的配制。LB 固体和液体培养基均为常规
配制［4］。
1． 2． 5 菌液的制备。在无菌室中将供试菌种移接入相对应
的试管斜面培养基上，进行活化，细菌置于 37 ℃培养箱中培
养 24 h，用无菌水配制成 1 ×107 ～ 1 ×108 CFU /ml的菌液。
1． 2． 6 体外抑菌试验(滤纸片法)［5］。在每种待测样品中浸
入直径为 10 mm无菌滤纸片，充分浸泡后取出、晾干。将灭
菌后的固体培养基倒入无菌培养皿中，每皿 20 ml 左右。待
冷却凝固后，加入制备好的菌悬液各 0． 1 ml，用涂布棒将菌
液涂布均匀，制成含菌平板，然后取含样品液的滤纸片贴在
平板上，每皿贴 3 片，每个菌种做 3 次平行，另每个菌种以
DMSO浸泡的滤纸片做空白对照。10 min后倒置于 37 ℃恒
温培养箱中培养 24 h，测定滤纸片的抑菌圈直径，比较抑菌
效果。
1． 2． 7 最低抑菌浓度(MIC)的测定［6］。以 A1 为例，在无菌
条件下将灭菌试管分成 4组，每组 9支。向每组的第 1 支试
管中加入 2 ml 2倍浓度的 LB液体培养基，第 2 ～7支试管中
各加入 2 ml LB液体培养基;向每组的第 1 支试管中加入 2
ml A1 样品液后按二倍稀释法使各管药液浓度分别为 5． 00、
2． 50、1． 25、0． 63、0． 31、0． 16和 0． 078 mg /ml，第 8支试管中加
入 2 ml LB液体培养基作为阳性对照，然后向各管中加入0． 1
ml的菌液，第 9支试管中加入提取液但不加菌悬液作为阴性
对照，于 37 ℃培养 24 h，观察抑菌效果。试验重复 3次。以
无菌生长的最低样品液浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。对
不宜判定有无细菌生长者，在营养琼脂平板上划线接种，37
℃恒温培养 24 h后取出，以完全无细菌生长的平板所对应的
样品液浓度作为此样品液对该菌株的最小抑菌浓度(MIC) ，
其余样品操作方法如 A1。
2 结果与分析
2． 1 滤纸片法测定狼爪瓦松粗提物的抑菌作用 按照
“1． 2． 6”操作，结果见表 1 ～ 2。从表 1 ～ 2 可知，各提取液对
变形杆菌抑菌作用较小。各萃取相对金黄色葡萄球菌、枯草
杆菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌作用，但 A4 与 A3 的抑菌
作用明显弱于其他萃取相。A2 对金黄色葡萄球菌、枯草杆
菌及大肠杆菌的抑菌作用较 A1 及 A11 ～ A13相的抑菌作用稍
强，且 A13 ＞ A12 ＞ A11。各萃取相对金黄色葡萄球菌和枯草杆
菌的抑菌效果基本相当且 ＞大肠杆菌 ＞变形杆菌。总之，不
同的萃取相对同一种供试菌有不同的抑菌效果，同一种萃取
相对不同供试菌的抑菌效果也不尽相同。
表 1 狼爪瓦松氯仿相和乙酸乙酯相滤纸片法的抑菌效果
Table 1 Antibacterial activity of chloroform and ethyl acetate phases
from Orostachys cartilaginous A． Bor by filter paper method
供试菌种
Tested strains
抑菌圈直径∥mm
Diameter of inhibition zone
A1 A2 A11 A12 A13 T
金黄色葡萄球菌 13． 7 15． 5 12． 8 13． 0 15． 7 25． 6
Staphyloccocus
aureus Rosenbach
大肠杆菌 Escherichia coli 12． 5 14． 2 12． 4 12． 5 13． 4 20． 2
变形杆菌 Proteus vulgaris 11． 8 12． 0 11． 8 － 11． 6 －
枯草杆菌 13． 3 15． 6 12． 7 13． 5 14． 5 15． 8
Bacillus subtilis
(Ehrenberg)Cohn
注:“－”没有抑菌活性;样品液浓度为 10 mg /ml。
Note:“－”represented no inhibitory effect;concentration of sample solu-
tion was 10 mg /ml．
表 2 狼爪瓦松正丁醇相和水相滤纸片法的抑菌效果
Table 2 Antibacterial activity of normal butanol and water phases
from Orostachys cartilaginous A． Bor by filter paper method
供试菌种
Tested strains
抑菌圈直径∥mm
Diameter of inhibition zone
A3 A4
金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus Rosenbach 11． 5 11． 3
大肠杆菌 Escherichia coli 13． 0 12． 4
变形杆菌 Proteus vulgaris － －
枯草杆菌 Bacillus subtilis (Ehrenberg)Cohn 11． 8 11． 1
注:“－”没有抑菌活性;样品液浓度为 100 mg /ml。
Note:“－”represented no inhibitory effect;concentration of sample solu-
tion was 100 mg /ml．
表 3 狼爪瓦松粗提物对供试菌的最小抑菌浓度
Table 3 MIC of crude extracts from Orostachys cartilaginous A． Bor against tested strains
萃取相
Extraction phases
MIC∥mg /ml
金黄色葡萄球菌
Staphyloccocus
aureus Rosenbach
大肠杆菌
Escherichia coli
变形杆菌
Proteus vulgaris
枯草杆菌
Bacillus subtilis
(Ehrenberg)Cohn
A1 1． 25 2． 50 5． 00 2． 50
A2 1． 25 1． 25 5． 00 1． 25
A3 50． 00 50． 00 － 50． 00
A4 50． 00 50． 00 － －
A11 2． 50 2． 50 5． 00 2． 50
A12 2． 50 5． 00 － 2． 50
A13 1． 25 2． 50 5． 00 2． 50
阳性 Positive － － － －
阴性 Negative + + + +
T 0． 16 0． 31 － 1． 25
注:“－”没有抑菌活性;“+”无菌生长。
Note:“－”presented no inhibitory effect;“+”presented no bacterial growth．
2． 2 狼爪瓦松全草各萃取相对供试菌的最低抑菌浓度 由
表 3可知，狼爪瓦松粗提物的各溶剂萃取相(A1 ～ A4、A11 ～
A13)在试验质量浓度范围内对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌
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4538 安徽农业科学 2011 年
五味子酯甲峰面积积分值并计算含量，其 RSD 分别为
1． 32%，1． 54%，1． 28%。
表 1 线性回归方程及线性范围
Table 1 Linear regression equation and linearity range
样品
Sample
线性范
围∥mg /L
Linearity
range
线性回
归方程
Linear regre-
ssion equation
检出限
μg /L
Detection
limit
R2
五味子酯甲 0 ～120． 4 Y =14 687X －33 725 0． 204 0． 998 6
Deoxyschizandrin
五味子甲素 0 ～156． 0 Y =23 161X －102 957 0． 202 0． 994 6
Schisandrin A
五味子乙素 0 ～138． 0 Y =14 552X －68 431 0． 338 0． 994 7
Schisantherin B
2． 5 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液 10 μl，分别
于 0，2，4，6，8，10 h进样，测定五味子甲素、五味子乙素以及
五味子酯甲峰面积积分值，其 RSD 分别为 1． 25%，1． 16%，
1． 35%。结果表明，供试品溶液在 10 h内基本稳定。
2． 6 加标回收率计算 取已知量的五味子木脂素 10． 0 mg，
加 10． 0 ml甲醇，超声溶解并用 0． 45 μm微孔滤膜过滤，加入
一定量的对照品，测定相应对照品的峰面积，以得到加标回
收率。得到五味子甲素、五味子乙素以及五味子酯甲的平均
回收率(n = 3)分别为 98． 5%，99． 4%和 99． 43%。相应的
RSD为 1． 10%，1． 43%和 1． 68%。
2． 7 供试品含量测定 取供试品北五味子木脂素 10． 3 mg，
溶于加甲醇并定溶到 10 ml，超声溶解，用 0． 45 μm微孔滤膜
过滤，在甲醇∶水为70% ∶ 30%，流速 1 ml /min，波长 254 nm色
谱条件下进样 50 μl;测定其含量(n = 3)分别为五味子甲素
1． 14 mg /g，五味子乙素 2． 55 mg /g，五味子酯甲 3． 26 mg /g。
3 结论
高效液相色谱法因其分析效果好，分离能效高，因此常
用来进行北五味子木脂素的分析。该研究利用高效液相色
谱法建立了测定北五味子中主要木脂素成分(五味子甲素、
五味子乙素和五味子酯甲)的分析方法。结果表明，该方法
操作简单，灵敏快速，样品中各组分的分离效果好，灵敏度
高，为北五味子的成分以及药理活性提供了更丰富的数据
支持。
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778 －781．
(上接第 8354 页)
均有一定的抑制作用，其中 A1、A2及 A13对金黄色葡萄球菌
的抑菌作用最强，其 MIC为 1． 25 mg /ml，A2 对大肠杆菌的抑
菌作用最强，其 MIC也为 1． 25 mg /ml，A3 和 A4 对金黄色葡
萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用最弱，其 MIC 均为 50． 00
mg /ml。此外，A3、A4、A12对变形杆菌不具抑菌作用，A1、A2、
A11、A13对变形杆菌的抑菌作用较弱，其 MIC 均为 50． 00
mg /ml。A2 对枯草杆菌的抑菌作用最强，其 MIC 为 1． 25
mg /ml，其次为 A1、A11 ～ A13，其 MIC 为 2． 50 mg /ml，A3 对枯
草杆菌的抑菌作用最弱，其 MIC为 50 mg /ml，A4 对枯草杆菌
不具抑菌效果。总体上，A1、A2 及 A11 ～ A13对供试菌的抑菌
效果要强于 A3 和 A4。
3 结论与讨论
试验结果发现，从狼爪瓦松体积分数为 0． 75 的丙酮提
取液中萃取出的乙酸乙酯相(A2)和氯仿相(A1)对金黄色葡
萄球菌显示了较好的抑菌效果，对枯草杆菌也表现出了一定
的抑制活性。此外，狼爪瓦松对大肠杆菌的抑制作用主要表
现在其中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相。狼爪瓦松的
粗提物对变形杆菌的抑制作用最弱，可能是由于量较低，在
该试验的质量浓度范围内尚不足以较好的抑制变形杆菌
增殖。
近年来，由于抗生素的不合理使用，引起菌群失调、菌种
变异、产生耐药性等一系列棘手问题。寻找和研制具有抗菌
活性的新型抗菌药物成为当今世界迫切需要解决的问题。
中草药是我国具有悠久历史的并被证明非常行之有效的医
药，深入开发研究中草药活性成分具有重大现实意义［7 －8］。
该研究对牡丹江镜泊湖火山熔岩地区的狼爪瓦松植物进行
了探索研究，初步揭示了狼爪瓦松的有效抑菌部位。这为今
后对其抑菌活性成分的进一步分离与分析奠定了基础，对筛
选天然药物，促进中药现代化，合理开发和利用植物资源有
一定的指导意义。
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