全 文 ：0 引言
金葡菌是引起细菌性食物中毒的重要的致病菌[1]。
葡萄球菌肠毒素(SEs)是引起葡萄球菌性胃肠炎和食
物中毒主要的毒力因子，此外，肠毒素可也引起一些过
敏性和自身免疫性疾病[2]。肠毒素具有超抗原的免疫
调制活性，诱导T淋巴细胞活化和T细胞产生的细胞
因子的释放(如肿瘤坏死因子TNF-α)。到目前为止，
多种肠毒素已经得到鉴定，包括 SEA-E、SEG、SHE、
SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和 SEO。虽然肠毒素
确切的致病机制还没有完全阐明，但是普遍认为，肠毒
素通过刺激肠迷走神经反射，触发脑部的呕吐中枢[3]。
在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌
性食物中毒的33%，加拿大则更多占45%[4]。随着人们
对食品质量要求的提升，在食品加工中使用化学防腐
剂如氯化钠和硝酸盐的量将越来越少。因此，在食品
工业中迫切需要开发新的策略以预防由金葡菌引起的
食物中毒。2004年Smith-Palmer等[5]研究了多种植物
挥发油成分对金葡菌肠毒素A和B表达的影响，阐明
基金项目：重庆市科技创新能力建设项目“甘草查尔酮A对金葡菌的作用研究”(CSTC-2009CB1010)。
第一作者简介：吴金梅，女，1970年出生，河南新县人，博士研究生，研究方向：兽医药理与毒理学。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号
吉林大学农学部畜牧兽医学院，Tel：0431-87836161，E-mail：meizi1868@126.com。
通讯作者：邓旭明，男，1964年出生，湖南邵阳人，博士，研究方向：兽医药理与毒理学。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号吉林大学农
学部畜牧兽医学院，Tel：0431-87836161，E-mail：dengxm@jlu.edu.cn。
收稿日期：2011-09-18，修回日期：2011-10-17。
异土木香内酯对金黄色葡萄球菌肠毒素表达的影响
吴金梅 1,2，邱家章 1，邓旭明 1
（1吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062；2郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450002）
摘 要：为了考察异土木香内酯对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并研究其对金葡菌肠毒素表达的影响。
应用肉汤微量稀释法测定异土木香内酯对金黄色葡萄黄色球菌标准株的最低抑菌浓度，采用
Western-blot分析、蛋白酶试验、肿瘤坏死因子释放试验和荧光定量PCR分析测定异土木香内酯对金黄
色葡萄黄色球菌主要肠毒素SEA和SEB表达的影响。结果表明：异土木香内酯在2048 μg/mL仍然不能
抑制金葡菌的生长，然而低浓度(1~8 μg/mL)的异土木香内酯能够剂量依赖性地降低金葡菌SEA和SEB
的表达。
关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；异土木香内酯
中图分类号：S859.7 文献标志码：A 论文编号：2011-2652
Isoalantolactone Reduces Enterotoxins Production by Staphylococcus Aureus
Wu Jinmei1,2, Qiu Jiazhang1, Deng Xuming1
(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062;
2Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450002)
Abstract: In the study, we were aimed to investigate the antimicrobial activity of isoalantolactone against
Staphylococcus aureus, and further assess the influence of isoalantolactone on the expression of enterotoxins by
S. aureus. A broth micro-dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs);
Western-blot, proteolytic activity, TNF-α release and real-time RT-PCR assays were performed to assess the
effects of isoalantolactone on S. aureus SEA and SEB expression. The data showed that the MICs of
isoalantolactone against S. aureus strains were greater than 2048 μg/mL. However, low concentrations of
isoalantolactone (1-8 μg/mL) could dose-dependently inhibit the expression of SEA and SEB by S. aureus.
Key words: Staphylococcus aureus; enterotoxins; isoalantolactone
中国农学通报 2012,28(08):51-55
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
了能够降低肠毒素表达的丁香挥发油和肉桂挥发油可
潜在地作为新型的食品防腐剂应用于食品工业中。此
外Souza等[6]研究了牛蛭挥发油的抗金葡菌活性及对
肠毒素分泌的影响，结果表明，牛蛭挥发油既可抑制金
葡菌的生长，又可降低肠毒素的表达。中国中草药资
源非常丰富，Qiu等[2,8-10]、Li等[7]研究发现，许多中药单
体和挥发油如麝香草酚、丁香酚、甘草查尔酮A、紫苏
挥发油和薄荷挥发油可在亚抑菌浓度下剂量依赖性地
降低金葡菌肠毒素的表达。异土木香内酯是中药土木
香(Inula helenium)中的倍半萜内酯类化合物，亦是土
木香药材中含量较高的主要有效成分。目前尚无异土
木香内酯对金葡菌的抗菌作用及其对金葡菌毒力因子
影响的研究报道。采用肿瘤坏死因子释放试验、T淋
巴细胞增殖试验、免疫印迹和荧光定量PCR的方法研
究异土木香内酯对金葡菌主要肠毒素(SEA和SEB)分
泌的影响，在基因水平、蛋白水平和表型功能3个层面
确证其作用。
1 材料与方法
1.1 菌株及培养条件
金葡菌标准株ATCC29213和ATCC10832购买自
美国模式培养物集存库(ATCC)；MH肉汤(MHB)购自
青岛海博生物技术有限公司。
1.2 试剂和仪器
异土木香内酯购自中国药品生物制品检定所
(CMCC)；二甲基亚砜(DMSO)、抗 SEA和 SEB多克隆
抗体、HRP标记的二抗、含氮酪蛋白和溶葡萄球菌素
购自Sigma公司；Super ECL Plus超敏发光液购自北京
普利莱基因技术有限公司；Qiagen Rneasy Maxi
column 为Qiagen公司产品；反转录试剂 Takara RNA
PCR kit(AMV)Ver.3.0 和荧光定量 PCR 试剂 SYBR
Premix Ex TaqTM均购自Takara公司。UV-2600型紫
外可见分光光度计(尤尼柯公司)，酶标仪(TECAN)，荧
光定量PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)，半干转
膜仪(Biorad)。
1.3 方法
1.3.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用CLSI(Clinical
and Laboratory Standards Institute)的标准方法M7-A8，
倍比稀释测定异土木香内酯对金葡菌ATCC29213和
10832的最低抑菌浓度(MIC)。
1.3.2 免疫印迹分析 金葡菌ATCC29213和 10832在
MHB培养基中加入不同亚抑菌浓度的药物后培养至
对数生长后期 (T=300 min)。离心取上清 (5000 g，
5 min，4℃)。细菌培养物上清经SDS-PAGE后用于免
疫印迹试验，用半干式转膜仪将蛋白转至PVDF膜上，
5% BSA封闭 2 h，抗SEA和SEB多克隆抗体（分别做
1:8000和 1:1000倍稀释）孵育 1 h，HRP标记的二抗
（1:4000稀释）孵育1 h，加入ECL发光液孵育3 min后，
胶片曝光。
1.3.3 蛋白酶活性测定 取1.3.2菌液上清100 μL，加入
到 1 mL的含氮酪蛋白溶液中，于 37℃孵育 1 h，加入
1 mL 5%的三氯乙酸终止反应，未消化的含氮酪蛋白
继续沉淀 30 min，10000 g离心 10 min并在 328 nm测
其光密度。
1.3.4 肿瘤坏死因子(TNF-α)释放试验
（1）菌液上清的制备。在RPMI 1640培养基中过
夜培养的金葡菌ATCC29213和 10832经 30倍稀释于
500 mL预热的RPMI 1640中。稀释的培养物在37℃、
200 r/min培养 30 min后等量分装于 5个锥形瓶中，加
入不同浓度的异土木香内酯，是药物终浓度分别为1、
2、4、8 µg/mL，对照组不加药。继续按上述条件培养
4 h后离心取上清，用0.2 μm的滤膜过滤除去残留的细
菌。（2）脾淋巴细胞的分离。SPF BALB/c小鼠（雌性，
6~8周，20~22 g）。无菌取小鼠脾细胞，清洗并重悬于
RPMI-1640 完全培养基中。按每孔 106 个细胞
(150 μL)加入 96孔板中。（3）ELISA检测TNF-α水平。
每孔加入 50 μL的上述菌液上清，于细胞培养箱中
(37℃，5%CO2)孵育 16 h后，离心取上清。应用Mouse
TNF-α ELISA MAXTM Set Standard 检测上清中的
TNF-α水平，按照试剂盒操作。
1.3.5 荧光定量 PCR分析 ATCC29213在加入不同浓
度的异土木香内酯情况下于MHB培养基中培养至对
数生长后期 (OD600 nm=2.5)。总 RNA 的提取参照
Sambanthamoorthy的方法 [11]。离心收获细胞(5000 g，
5 min，4℃)，并重悬于含 100 µg/mL溶葡萄球菌素的
TES 缓冲液中，于 37℃孵育 10 min 后用 Qiagen
RNeasy Maxi column分离RNA；RNase-free DNase I用
于清楚污染的DNA；应用Agilent 2100 Bioanalyzer检
测 RNA的质量、完整性和浓度。应用 Takara RNA
PCR kit(AMV)Ver.3.0将RNA反转录成为 cDNA并存
放于-20℃备用；荧光定量PCR所用引物见表 1。应用
SYBR Premix Ex TaqTM在Real Time PCR扩增仪中进
行扩增。反应体系为 25 µL，循环参数为：95℃变性
30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，运行40个循环。所
有样品均为3个平行，并以gyrBRNA作为参照。采用
△△Ct法分析基因的相对表达水平。
1.3.6 统计分析 每个试验均单独地重复 3次，数据以
x±s表示；用SPSS 12.0统计软件进行分析，组间进行 t
检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
·· 52
吴金梅等：异土木香内酯对金黄色葡萄球菌肠毒素表达的影响
2 结果与分析
2.1 异土木香内酯对金葡菌的抗菌活性
异土木香内酯在 2048 μg/mL的浓度仍然不能抑
制金葡菌ATCC29231和 10832的生长，表明异土木香
内酯没有抗金葡菌活性。
2.2 低浓度的异土木香内酯抑制金葡菌肠毒素的分泌
通过免疫印迹分析检测了异土木香内酯作用后金
葡菌主要的肠毒素SEA和SEB的分泌量。结果如图
1，异土木香内酯剂量依赖性地抑制金葡菌 SEA和
SEB的分泌，当在1 μg/mL时，SEA和SEB的分泌即受
到显著抑制，而在8 μg/mL时，则检测不到SEA和SEB
引物
gyrB-F
gyrB-R
sea-F
sea-R
seb-F
seb-R
agrA-F
agrA-R
基因
gyrB
gyrB
sea
sea
seb
seb
agrA
agrA
序列(5’–3’)
TTATGGTGCTGGGCAAATACA
CACCATGTAAACCACCAGATA
ATGGTGCTTATTATGGTTATC
CGTTTCCAAAGGTACTGTATT
TGTTCGGGTATTTGAAGATGG
CGTTTCATAAGGCGAGTTGTT
TTCACTGTGTCGATAATCCA
GGAAGGAGTGATTTCAATGG
表1 荧光定量PCR引物
SEA
SEB
(a) (b)
0 1 2 4 8 0 1 2 4 8
异土木香内酯/(μg/mL) 异土木香内酯/(μg/mL)
图1 金葡菌ATCC 29213(a)和ATCC 10832(b)在不同浓度的异土木香内酯作用后SEA及SEB表达的免疫印迹分析
的表达。此外，通过测定蛋白酶活性，发现异土木香内
酯作用后，金葡菌上清的蛋白酶单位没有明显变化（图
2）。表明异土木香内酯降低SEA和SEB的表达不是
由于增加蛋白酶活性所致。
2.3 异土木香内酯降低金葡菌培养物上清刺激T淋巴
细胞释放TNF-α的能力
金葡菌分泌的外毒素中，肠毒素是最重要的具有
超抗原活性的蛋白，刺激 T淋巴细胞释放 TNF-α，因
此，通过TNF-α释放试验用于阐明异土木香内酯降低
SEA和SEB的生物相关性。见图 3所示，异土木香内
酯作用于金葡菌后显著降低其培养物上清刺激T淋巴
细胞释放TNF-α的活性。该作用呈现剂量依赖性。
2.4 异土木香内酯抑制金葡菌 sea和 seb基因的转录
应用荧光定量 PCR技术检测异土木香内酯对金
葡菌 SEA和 SEB编码基因 sea及 seb转录的影响，此
外，由于 sea和 seb基因受 agr二元调控系统的正向调
节，同时检测了异土木香内酯对 agrA转录的影响。结
果如图4~6所示，在加入8 μg/mL的异土木香内酯作用
下，sea、seb和 agrA的转录分别降低了 6.5，8.2和 8.5
倍，并且这种抑制作用呈现剂量依赖方式。
0
5
10
15
20
25
0 1 2 4 8
蛋
白
酶
单
位
ATCC 29213 ATCC 10832
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 4 8
异土木香内酯/(
g/mL)
TNF
-
/(p
g/mL
)
ATCC 29213 ATCC 10832
* **
图2 异土木香内酯作用后金葡菌培养物上清的蛋白酶活性 图3 异土木香内酯作用后金葡菌培养物上清的TNF-α活性
异土木香内酯/(μg/mL)
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
3 讨论
金葡菌是引起人食物中毒的常见病原菌广泛存
在于自然界中，可通过各种途径和方式引起食品的污
染，特别是通过加工人员的手污染最为常见。在美国
由金葡菌引起的食物中毒占所有细菌性食物中毒的
33%[4]。在中国也不时有由金葡菌引起的食物中毒的
报道。蔡雪凤等[12]对中国 50株食源性金葡菌肠毒素
特性和耐药性进行了检测，结果表明产肠毒素金葡菌
阳性率为 40%，并对氨苄西林(68%)、红霉素(56%)、克
拉霉素(58%)、克林霉素(64%)、青霉素(88%)、四环素
(38%)耐药率较高, 并发现 2株万古霉素耐药株。因
此，金葡菌所引起的食源性疾病已日益成为世界性的
卫生问题[13]。
葡萄球菌胃肠炎是食品中金葡菌污染导致的一种
重要的疾病，其致病过程不是由于摄入金葡菌，而是由
于摄入了其分泌在食品中的肠毒素所致[14]。其中SEA
的毒力最强，摄入1 μg即可引起食物中毒。在食品加
工过程中，NaCl和硝酸盐的用量越来越少。因此迫切
需要开发新型的防腐剂。低浓度异土木香内酯即可抑
制金葡菌主要肠毒素SEA和SEB的表达，表明其可潜
在地作为一种新型的防腐剂用于食品工业中。当然，
目前异土木香内酯的这种作用仅仅是在MHB培养基
中，在食品中是否具有这种抑制作用还需进一步研究。
通过荧光定量 PCR发现异土木香内酯能够显著
抑制金葡菌 agr二元调控系统。事实上，金葡菌在对
数期合成的细胞膜表面蛋白和在对数生长后期合成的
胞外蛋白受到一个由许多调控元件组成的调控网络的
控制，这个调控系统包括SarA蛋白家族，以及许多的
二元调控系统如 agr和 sae[15]。因此，金黄色葡萄球菌
控制毒力因子表达的过程是非常复杂的，涉及 sar、agr
和其他组分的产物的相互作用以及级联调控作用[16]。
为此异土木香内酯降低SEA和SEB的表达可能部分
依赖于agr二元调控系统。
参考文献
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sea
-10
-8
-6
-4
-2
0
2 异土木香内酯/(
g/mL)
相
对
基
因
表
达
*
**
**
图4 金葡菌ATCC29213 sea的相对基因表达
图6 金葡菌ATCC29213 agrA的相对基因表达
图5 金葡菌ATCC29213 seb的相对基因表达
seb
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2 异土木香内酯/(
g/mL)
相
对
基
因
表
达
**
**
agrA
-11
-9
-7
-5
-3
-1
1
3 异土木香内酯/(
g/mL)
相
对
基
因
表
达
**
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