全 文 ：第 33 卷第 6 期
2013 年 12 月
林 产 化 学 与 工 业
Chemistry and Industry of Forest Products
Vol． 33 No． 6
Dec． 2013
doi:10． 3969 / j． issn． 0253－2417． 2013． 06． 022
响应面法优化钙离子沉淀分离田基黄槲皮素
收稿日期:2012 － 12 － 13
基金项目:湖南省科技厅科技计划项目(2008FJ3077)
作者简介:欧阳玉祝(1956 －)，男，湖南永州人，教授，硕士，研究方向为天然产物开发和功能性食品;E-mail:ouyang1227@ 126． com。
OUYANG Yu-zhu
欧阳玉祝，魏 燕，李雪峰，徐勇威
( 吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000)
摘 要: 利用响应面( ＲSM) 优化法研究了钙离子沉淀分离田基黄槲皮素的工艺条件。考察了
石灰水用量、沉淀温度和沉淀时间对槲皮素得率的影响。结果表明，用 64 mL 饱和澄清石灰水做
沉淀剂，61 ℃ 沉淀 31 min，槲皮素的得率为 3． 256 %。分离产物用高效液相色谱结合标样进行定
性分析，结果与标准品一致。
关键词: 田基黄;槲皮素;离子沉淀;响应面法
中图分类号:TQ35; TQ28 文献标识码:A 文章编号:0253 － 2417( 2013) 06 － 0116 － 05
Optimization on Calcium Ion Precipitation Separation Technology
of Quercetin for Hypericum japonicum by Ｒesponse
Surface Methodology
OUYANG Yu-zhu，WEI Yan，LI Xue-feng，XU Yong-wei
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000，China)
Abstract:Calcium ion precipitation separation conditions of quercetin from Hypericum japonicum Thumb． were optimized by
response surface methodology (ＲSM)． Influence of calcium hydroxide water solution dosage，precipitation temperature and times
on extraction ratio of quercetin were studied． The results show that extraction rate of quercetin from Hypericum japonicum is
3. 256% with 64 mL calcium hydroxide water solution as precipitator，61 ℃ precipitation for 31 min． The separation product
agrees with standard substance by high performance liquid chromatography (HPLC)analysis．
Key words:Hypericum japonicum Thumb．;quercetin;ion precipitation;response surface methodology
田基黄系藤黄科金丝桃属植物地耳草(Hypericum japonicum Thumb．)的干燥全草，含有丰富的槲皮
苷、异槲皮苷、田基黄苷等黄酮类化合物［1－2］。槲皮素是田基黄的主要活性成分，具有延缓衰老、增强免
疫、抗菌抗炎、抗氧化和清除过氧自由基等生物活性，广泛用于医药、保健品、日用化学品和食品等领
域［3－4］。目前，田基黄的研究主要是化学成分分析和临床应用。张琳等［5］对田基黄中的化学成分进行
了研究;欧阳玉祝等［6］用火焰原子吸收分光光度法测定了田基黄中重金属含量;方新华等［7］研究了槲
皮素锌的抗肿瘤作用;姜云云等［8］研究了黄酮类化合物的体外抗氧化活性;焦晶晶等［9］对植物黄酮类
护肤因子在化妆品领域的应用研究进展进行了综述。响应曲面法是一种新的工艺优化方法，广泛用于
植物活性成分提取分离工艺优化［10－11］。作者以饱和澄清石灰水为沉淀剂分离田基黄中的槲皮素，用响
应曲面法优化沉淀分离工艺，分离产物用高效液相色谱定性，以期为田基黄的开发利用提供理论依据。
1 实 验
1． 1 原料、试剂与仪器
田基黄购置于吉首市药店，材料购回后经真空干燥，用植物粉碎机打碎成粉末备用;槲皮素对照品
第 6 期 欧阳玉祝，等:响应面法优化钙离子沉淀分离田基黄槲皮素 117
购置于成都欧康植化科技有限公司，纯度 99． 38 %;无水乙醇、氢氧化钙、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸、氢氧
化钠均为国产分析纯试剂;甲醇和磷酸为色谱纯试剂。
UV－2450 型紫外可见分光光度计;LC－2010 型高效液相色谱仪;DF－101S 集热式恒温磁力搅拌器;
JA2003N型电子分析天平;ＲE－85Z 型旋转蒸发器;SHB－III 循环水式多用真空泵;KQ－250E 型超声波
清洗器。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 槲皮素提取液的制备 槲皮素提取液按参考文献［12］运用水酶超声波辅助提取法制备。
1． 2． 2 槲皮素的分离 取 25 mL提取液置于 200 mL锥形瓶中，加一定量的饱和澄清石灰水溶液，在一
定温度下搅拌沉淀，抽滤，滤渣加 9． 8 % 稀硫酸使沉淀完全溶解，抽滤，滤液定容到 50 mL，用紫外可见
分光光度法测槲皮素含量。
1． 2． 3 标准曲线的绘制 标准曲线按参考文献［13］配制梯度槲皮素标准溶液，用紫外可见分光光度
计测 357 nm处吸光度，绘制标准曲线，经线性回归得回归方程及相关系数为:C = 0． 020 2A － 0． 030 8，
Ｒ2 = 0． 997 8。式中 C为标准溶液浓度，g /L;A为吸光度。
1． 2． 4 槲皮素得率分析 取 1 mL 溶液置于 25 mL 容量瓶中，按参考文献［13］用紫外分光光度计测
357 nm处的吸光度，带入回归方程计算槲皮素质量，按下式计算槲皮素得率。
槲皮素得率 =提取液中槲皮素的质量
田基黄粉末质量
× 100 %
1． 2． 5 色谱分析 色谱条件:色谱柱为 Spherigel VP－ODS，C18柱(150 mm × 4． 6 mm，5 μm);流动相为
100 % 甲醇 － 0． 4 % 磷酸，体积比为 45 ∶ 55，流速为 1． 0 mL /min;检测波长为 360 nm:柱温为 30 ℃;进
样量为 20 μL。
2 结果与讨论
2． 1 沉淀分离单因素试验
2． 1． 1 石灰水用量 用澄清石灰水分离槲皮素，是通过槲皮素与钙离子形成配合物沉淀达到分离目
的，因此，石灰水用量将直接影响沉淀效率。取 25 mL田基黄槲皮素提取液，按 1． 2． 2 节方法加入一定
体积的饱和澄清石灰水溶液，在 60 ℃ 下搅拌沉淀 30 min，考察石灰水用量对槲皮素得率的影响，结果
见表 1。
表 1 不同条件对槲皮素得率的影响
Table 1 Influence of different conditions on extraction
ratio of quercetin
条件
condition
槲皮素得率 /%
quercetin yield
饱和石灰水用量
saturation calcium hydroxide
water solution dosage
40 mL 2． 14
50 mL 2． 29
60 mL 2． 44
70 mL 2． 07
80 mL 2． 06
温度
temperature
40 ℃ 1． 79
50 ℃ 2． 13
60 ℃ 2． 36
70 ℃ 1． 63
80 ℃ 1． 6
时间
time
20 min 1． 53
30 min 2． 36
40 min 1． 74
50 min 1． 71
60 min 1． 62
由表 1 数据可知，沉淀初期，槲皮素得率
随添加饱和澄清石灰水溶液体积的增加而增
大，添加 60 mL饱和澄清石灰水时槲皮素得
率最大为 2． 44 %，随后得率下降，沉淀的颜
色显著加深。因为在沉淀初期，添加石灰水，
溶液碱性增强，溶液中的槲皮素与钙离子生
成槲皮素钙沉淀。添加 60 mL石灰水时槲皮
素基本沉淀完全。在此基础上再增加石灰水
用量，溶液碱性剧增，造成槲皮素氧化加剧，
颜色变深，得率下降。
2． 1． 2 沉淀温度 碱性条件下沉淀分离槲
皮素，温度升高，氧化加剧。为了考察沉淀温
度对槲皮素得率的影响，取 25 mL 提取液，
按 1． 2． 2 节方法分批加入 60 mL饱和澄清石
灰水溶液，在不同温度下搅拌沉淀 30 min。
结果见表 1。结果表明，温度升高，槲皮素得
118 林 产 化 学 与 工 业 第 33 卷
率增加，当温度达到 60 ℃ 时，槲皮素的得率达到最大值 2． 36 %。继续升高温度，槲皮素的得率下降。
因为在强碱性条件下沉淀会导致槲皮素氧化，温度升高，氧化加剧，槲皮素得率减小。所以，在 60 ℃ 沉
淀较宜。
2． 1． 3 沉淀时间 取 25 mL槲皮素提取液，按 1． 2． 2 节方法分批加入 60 mL 饱和澄清石灰水溶液，在
60 ℃ 下搅拌沉淀，考察沉淀时间对槲皮素得率的影响，结果如表 1 所示。结果表明，用 60 mL饱和澄清
石灰水溶液沉淀 30 min，槲皮素基本沉淀完全。随着沉淀时间增加，槲皮素氧化速率加快。所以，沉淀
30 min较宜。
2． 2 响应面优化沉淀分离试验
2． 2． 1 Box-behnken试验设计及结果 结合单因素试验结果，采用 Box-behnken中心组合设计原理［14］，
选择沉淀时间(X1)，沉淀温度(X2)和饱和澄清石灰水溶液用量(X3)3 个因素为影响因素，以槲皮素得
率为响应值设计 3 因素 3 水平试验，并对田基黄槲皮素的 Box-Behnken 优化沉淀分离工艺，按 1． 2． 2 节
方法进行试验，试验因素水平及试验结果见表 2。
表 2 Box-behnken因素水平表及试验结果
Table 2 Factor level and results of Box-behnken experiment
试验号
number
X1
沉淀时间 /min
precipitation times
X2
沉淀温度 /℃
precipitation temperature
X3
饱和石灰水用量 /mL
saturation calcium hydroxide
water solution dosage
槲皮素得率 /%
quercetin yield
1 20 60 70 1． 53
2 20 50 60 1． 02
3 30 60 60 3． 06
4 40 60 50 1． 99
5 30 60 60 3． 31
6 40 70 60 1． 76
7 30 60 60 3． 24
8 30 60 60 3． 27
9 30 50 50 2． 47
10 30 70 50 2． 46
11 30 60 60 3． 34
12 40 50 60 1． 59
13 20 70 60 1． 23
14 30 70 70 2． 94
15 30 50 70 2． 54
16 40 60 70 2． 13
17 20 60 50 1． 44
2． 2． 2 模型的显著性检验 以槲皮素得率为响应值，用 Design Expert 7． 00 软件对试验结果进行拟合，
得出二次多项式数学模型为:Y = 3． 24 + 0． 28X1 + 0． 096X2 + 0． 098X3 － 0． 01X1X2 + 0． 013X1X3 +
0． 1X2X3 － 1． 34X
2
1 － 051X
2
2 － 0． 13X
2
3。
同时，对表 2 数据用 Design Expert 7． 00 软件进行回归和方差分析，结果见表 3。
由表 3 可知，试验所选模型的相关系数 Ｒ2 = 0． 993 9，P ＜ 0． 000 1，表明模型极显著;模拟调整相关
系数 Ｒ2Adj = 0． 986 1，表明响应值(得率)变化的 98． 61%来自于所选变量;失拟项 P = 0． 783 9 ＞ 0． 05，没
有显著性意义，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项。表 3 中，X1 和 X
2
1，X
2
2 表现为极显著
(P ＜ 0． 000 1) ;X2，X3，X
2
3 变现为显著(P ＜ 0． 05) ;交互项 X1X2，X1X3，X2X3 不显著。结合表 3 中各系数
项的估计值，本试验各因素的影响大小顺序依次为:沉淀时间 ＞石灰水用量 ＞沉淀温度。
2． 2． 3 响应面分析 根据回归模型作出相应的响应曲面图，考察拟合响应曲面的形状，分析各因素对
第 6 期 欧阳玉祝，等:响应面法优化钙离子沉淀分离田基黄槲皮素 119
槲皮素得率的影响，结果如图 1。
表 3 回归模型系数显著性检验及方差分析
Table 3 Significance testing and variance analysis of model regression coefficients
系数来源
source of coefficient
平方和
quadratic sum
自由度
degree of freedom
均方
mean square
F值
F value
P值
P value
显著性
significance
模型 model 10 9 1． 11 126． 97 ＜ 0． 0001 ＊＊
X1 0． 63 1 0． 63 72． 33 ＜ 0． 0001 ＊＊
X2 0． 074 1 0． 074 8． 47 0． 0266 *
X3 0． 076 1 0． 076 8． 69 0． 0215 *
X1X2 4． 000E － 004 1 4． 000E － 004 0． 046 0． 8368
X1X3 6． 250E － 004 1 6． 250E － 004 0． 071 0． 7970
X2X3 0． 042 1 0． 042 4． 80 0． 0645
X21 7． 53 1 7． 53 860． 25 ＜ 0． 0001 ＊＊
X22 1． 08 1 1． 08 123． 70 ＜ 0． 0001 ＊＊
X23 0． 076 1 0． 076 18． 71 0． 0214 *
失拟 lack of fit 0． 013 3 4． 375E － 003 0． 36 0． 7839
净误差 pure error 0． 048 4 0． 012
残差 residual 0． 061 7 8． 749E － 003
总离差 cor total 10． 06 16
相关系数 Ｒ2 0． 9939
调整相关系数 Ｒ2Adj 0． 9861
图 1 响应曲面图
Fig． 1 Ｒesponse surface graphs
利用 Design expert 7． 00 软件结合回归模型，预测石灰水沉淀分离槲皮素的最佳工艺条件为:沉淀
时间为 31 min，沉淀温度 61 ℃，石灰水用量为 64 mL，模型对槲皮素得率的预测值为 3． 286 %。
2． 2． 4 模型验证 为了检验响应曲面法所得结果的可靠性，同时考虑试验条件的可操作性，将提取工
艺参数调整为:沉淀时间 31 min，沉淀温度 60 ℃，石灰水用量 64 mL。在此条件下进行验证试验，平行
试验 5 次得率分别为 3． 2 %、3． 25 %、3． 23 %、3． 26 % 和 3． 34 %，取平均值为 3． 256 %，与模型的预
测值 3． 286 % 相差 0． 03 %，表明基于响应曲面法所得的优化沉淀条件准确可靠，进一步验证了数学模
型的合理性。
2． 3 分离产物的表征
为了验证分离产物为目标产物，将分离产物按 1． 2． 5 节做高效液相色谱图，并与槲皮素标准品的高
效液相色谱图对比，结果见图 2。
图 2 结果表明，试验分离得到槲皮素产品的 HPLC图与槲皮素标准品的 HPLC 图相吻合，说明本试
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验分离样品是目标产物。
图 2 产品和标准品的高效液相色谱图
Fig． 2 HPLC chart of product and standard substance
3 结 论
在单因素试验的基础上，以澄清石灰水用量，沉淀温度和沉淀时间为因素，以槲皮素的得率为响应
值，对田基黄槲皮素沉淀分离条件进行响应面优化。结果表明，在 25 mL田基黄提取液中加 64 mL饱和
澄清石灰水，60 ℃ 沉淀 31 min，槲皮素得率为 3． 256 %。分离产物用高效液相色谱结合标样进行定性
分析，结果与标准品一致。
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