全 文 ：第 4 0卷第 4期
2 0 0 4年 8月
兰 州大学学报 (自然科学版 )
J o ur n al of L n a
z h o uUn ivr e
sit y(N t a u
r al S ei en e e s)
丫 b l . 4 0 N 0 . 4
A ug
.
2 0 0 4
文章编号 : 04 55一 2 0 5 9(2 004 )0牛 00 68一 0 4
大籽篙化学成分分析及抗癌活性研究
张 琪 1, 郭 国宁 2 , 苗瑞 东` , 陈能煌 3 , 王 勤 1, ①
(1
. 兰州大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州 ; 2 . 华 中科技大学 生命科学学院 , 湖北 武汉 43 00 74 ;
3
, 兰州大学 化学化工学院 , 甘肃 兰州 73 00 00)
摘 要 : 将 大籽篙 ( A代 e 哪诫 a “ 。 e二她 n a E hr h . ex W il d . )地上部分 乙酸 乙醋提取物用硅胶柱层析分
离和纯化 , 通过波谱方法鉴定化合物 , 用 M T T 法 、 单细胞电泳进行体外抗肿瘤 活性研究 . 鉴定 出 4种
化合物 : 洋 艾素 ; A hc i il ;n 5 , 7 , 4几三羚基一 3 , , 5气二 甲氧基黄酮 ; 3 , 5 一二轻基一 6 , 7, 3 , , 4几四甲氧基黄酮 .
M T T 法结果表明洋艾素和 Ahic il n 对人肝癌 细胞 s MM c 一 7721 的生长有 较明显的抑制作用 , 且具有
一定 的时间 和浓度依赖性 . 单细胞电泳显示 对 SM M C 一 77 21 细胞的 D N A有损伤作用 . 所 以洋艾素
和 A hc il in 对 SM M C 一 7 721 细胞株的抑制活性与其 D N A 损伤有关.
关键词 : 大籽篙 ; 化学成分 ; 抗癌活性
中图分类号 : Q 6 29 .6 文献标识码 : A
大籽篙 (A : t 。。 乞s葱a s 乞。 。。 sr 云a o a E hr h . e x iW l ld
.
)
又名繁 、 繁母 、 由胡 、 白篙 、 白艾篙 、 蓬篙 , 为菊科
篙属植物 , 属漪萝篙组 , 分布在东北 、 华北及甘肃 、
陕西等地 . 其味甘 、 性平 、 无毒 . 可治风寒湿痹 、 黄
疽 、 热痢 、 疥癫恶疮 . 所研究过 的篙属植物的化学
成分以含倍半菇为其特征 lI] , 传统的大籽篙生物
活性研究主要局 限于其消炎抗菌的特性上 , 其抗
癌活性研究尚未见报道 . 我们对大籽篙的地上部
分的乙酸 乙醋提取物进行了研究 , 采用硅胶柱层
析等手段从该植物 中首次分离得到 4个化合物 : 洋
艾素 A e h i ll i n ; 5 , 7 , 4 , 一三轻基一3 ’ , 5 ’ 一 二 甲氧基黄酮 ;
3
,
5
一二经基一 6 , 7 , 3 ’ , 4 ,一四 甲氧基黄酮 . 采用 M T T 和
单细胞电泳进行体外抗肿瘤活性研究 .
1 仪器与材料
K ol fe r 型微量熔点仪 (温度计未校正 ) ; B r l lk e r
A M
一
40 0 F T
一
N M R 型 超导核磁共振仪 ; A C 一 20 型
核磁共振仪 ; A C 一80 型核磁共振仪 ; iN d et 17 0S x 红
外分光光度计 ; v G z A B 一H S 质谱仪 ; 柱层析所用
硅胶为 2 0 一3 0 目和 3 0 一4 0 目 , 产 自青岛海洋化工
厂 ; 所用分析纯 (.A R . )试剂产自天津试剂二厂 . 大
籽篙采 自青海省西宁市大通县 , 由西北高原生物
研究所刘建全研究员鉴定 .
荧 光显 微 镜 (O ly m p u s ) ; B xo ~ R A D 酶联 免疫
检测仪 (M o d e l一 3 3 5 0 ) ; 人肝癌细胞 SMM C一 7 7 2 1 , 第
收稿 日期 : 20 0各 0-7 1.0
基金项 目: 甘肃省科技攻关资助项 目 (G s 0 2 2 一 A 4各 13 6 ) .
作者简介 : 张琪 ( 19 7-8 ) , 男 , 博士研究生 . ① 通讯联系人 .
二军 医大 学建 株 , 购 自武 汉大学生命科学 中心 .
培 养基 R P M I一 16 40 和 小 牛 血 清分 别 购 自 iS g m a
和杭 州 四季青公 司 . 低 熔点琼脂糖 、 澳化 乙 吮
(E B )
、
M T T (3
一
(4
, , 5
’ 一
d im e t hy it h i
a z o -l 2
’ 一 y l )
一
2 , 5
一
d i p
-
h 。盯 lt e t r a z o li u m b r o m i d e )均为 S i g m a 产品 .
2 提取与分离
将阴 干 的大 籽 篙地 上部分共 1 . s kg 粉碎后 ,
室温下用 工业 甲醇浸提 3次 , 减压浓缩 后 的浸膏
约 190 9 . 将浸膏溶于冷蒸馏水中 , 依次用石油醚 、
乙 酸乙醋 、 正丁醇萃取 , 分别得萃取物 10 9 , 56 9 ,
1 7 9
.
将 乙 酸乙醋部分反复进行 硅胶柱层 析分离 ,
梯度洗脱 , 洗脱剂为石油醚一丙酮 、 氯仿- 丙酮等 ,
并结合重结 晶等手段 , 分离鉴定得到 4个化合物 :
洋艾素 : A ch i l li n ; 5 , 7 , 4 ,一三经基一 3 ’ , 5 ’ 一二 甲氧基 黄
酮 ; 3 , 5一二经基一 6 , 7 , 3 ’ , 4’ 一四甲氧基黄酮 .
3 杭癌机制研究
.3 1 细胞培养
人肝癌细胞 S M M C 一 7 21 培养于 R P M I一 1 64 0培
养基中 , 外加青霉素 l o U /m L , 链霉素 10 拼g /m L
和 N a H C O 3 2 9 / L , 含 10 % 灭 活 小 牛 血清 , 在 5%
C O Z
,
37
“
C饱和湿度下培养 . 消化收集处于对数生
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 2004. 04. 019
第 4期 张 琪等 :大籽篇化学成分分析及抗癌活性研究
长期的细胞 , 以 5 x l沪个 /m L 密度接种于 25 m L 细
胞培养瓶 , 每 24 h更换新鲜培养液 .
& 2 细胞毒活性 的测定比 3〕
取对数生长期的细胞 , 以 2 x 10 4个 / m L 的浓度 ,
接种 于 9 6孔板中 , 每孔加人 10 0 拜l , 贴壁培养 2 4 h .
将 96 孔 板取 出 , 倒掉 旧培养液 , 向 相应 孔 中加
人不 同浓 度 4种化合物 (6 . 25 , 1 2 . 5 , 2 5 , 50 , 10 0 ,
2 0 0
, 4 00 拼g /m L )和新鲜培养液 , 分别培养 24 , 4 8 ,
72 h
. 将 9 6孔板 取 出 , 每孔 加人 0 . 5 m g加 L M T T
溶液 10 川 , 4 h后加入二甲基亚矾 (D M SO )终止反
应 , 在 酶标仪上测其吸光度 A 59 5 (测量波长为 5 95
n m
, 参考波长为 6 5 5 n m ) .
3
.
3 单细胞彗星电泳检测 D N A损伤冈
消 化 收集经 不 同浓 度 化合物处 理 的细 胞 ,
P B S洗 3次 , 将 0 . 1 m L 浓度为 l 只 1 0 5个 /m L 细胞悬
液滴 人 l m L .0 75 %低熔 点 的琼脂糖 溶 液 中混
匀 , 使细胞终浓度为 1火 10 4个 /m L , 将载玻片预先
用 0 . 1% 的琼脂糖预处理 , 以增加粘附力 , 吸取细
胞琼脂糖悬浮液 均匀涂于处理过的载玻片上 , 用
含 0 0 3 m
o l /L N
a O H
, 1 m m
o l / L N
a ZE D TA 的裂解
液冰浴裂解 1 . 5 h , 冲洗裂解液 , 在 S V / c m 电场下
电泳 20 m in , 用洗碱液冲洗 , 20 雌 /m L 的 E B染色 ,
在 lO y m p su B H一2荧光显微镜下观察并照相 .
I H
一
N M R (C D C 1
3 , 吞): 6 . 1 1 ( I H , d , 了二 1 . 4 76 H z , -H
3 )
, 3
.
3 8 ( I H
,
d
,
J = 1 0
.
1 16 H z
, 11
一
5 )
,
3
.
7 7 ( I H
,
t
,
J 二 10 . 4 2 0 H z , H一6 ) , 1
.
8 2 ( I H
,
m
,
H
一
7 )
, 1
.
4 0 ( ZH
,
m
,
H
一
8 )
, 2
.
6 6 (ZH
,
d
,
J二 7 . 8 5 6 H z , 7 . 58 0 H z , H 一 9 ) ,
2
.
2 9 ( I H
,
m
,
H
一
1 1) 1
.
08 (3H
,
d
,
J = 7
.
5 8 8 H z , H
一
1 3 )
,
2
·
13 (3 H
, s , H
一
1 5 )
, 2
·
3 8 (3H
, 。 , H 一 1 4 )
. 碳谱数据见
表 1 .
表 i 化合物 i 、 4 1 3 C N入任R数据
l h b l e 1 1 3 C N M R
s p e e t r a l d at a o f l 、 4
C 1 2 3 4
4 结果与讨论
.4 1 结构鉴定
化合物 1 : 橙黄色针状结晶 ; C o3 H 4。 0 6 , m . .P
一5 1、 l s 3 o e . [。 1` 6
0
= + 1 7 9
.
5 (
e , 0
.
2 2 5 , C H C 13 )
.
FA B
-
M S 叨 / : : 4 9 7 3 (M + + 1 ); EI 一M s 。 /: : 4 9 6 . 2 (M + ) ,
2 4 5
, 2 3 3 (2 4 8
一
M e )
,
2 3 0 (24 8
一
H ZO )
, 2 15 ( 23 0
一
M e )
,
20 5 (2 3 3
一
C O ) ; I R 7 (K B
r , m二 , e m 一 ` ): 3 3 5 0 , 3 0 3 5 ,
1 7 5 2
, 1 6 58
, 1 3 6 0
, 1 1 7 5
,
8 1 0等 . 王-H N M R (C D C 13 ,
吞)` 2 · 13 8 ( I H , s , H一 1 ) , 2 · 8 4 5 ( I H , d d , J 二 2 · 5 , 3 · SH z ,
H
一
2 )
, 5
.
5 2 1 ( I H
, s , 林 3 ) , 4 · 70 3 ( I H , d , J 二 l o H z , H -
6 )
, 1
.
8 0 0 (SH
,
m
,
H
一
7
,
H
一
8 , H
一
9 )
,
2
,
2 3 1 (ZH
,
m
,
-H 1 1
,
体 1 1 ’ ) , i 、 2 3 5 (s H , d , 了= 7 H z , H一 r 3 ) , 1 . 19 0 (3 H , s , H -
1 4 )
,
1
.
7 7 3 (3 H
,
d
,
J = 1
.
S H z
,
H
一
15 )
, 2
.
2 8 1 ( I H
, s ,
H
一
1 ’ )
,
2
.
8 2 0 ( I H
,
d d
,
J 二 8 , 3 · S H z , H一 2 ’ ) , 3
.
2 10 (I H
,
s , H
一
3
,
)
, 4
.
5 9 7 (I H
,
d
,
J
一
1 1H z
,
H
一
6
,
)
, 1
.
6 1 1 (SH
,
m
,
H
一
7
, ,
H
一
8
, ,
H
一
9
,
)
, 1
.
2 0 2 ( 3H
,
d
,
J 二7 H z , H一 13 , ) ,
1
.
3 1 5 ( 3H
, s , H
一
1 4 , )
, 1
.
9 3 8 (3 H
, s ,
-H 1 5
,
)
,
2
,
15 3 (ZH
,
m
, 1 0
一
O H
, 10
’ 一
O H )
. 碳谱数据见表 1 ·
化合物 2 : 无色针 状晶体 , 1C 5 H 18 O 3 , m . .P
14 4、 14 6 o C ; FA B
一
M S: 24 7
.
1 (M + + l )
,
2 6 9
.
1 (M + + N a )
.
I R (7
e m 一 1 ): 2 9 3 5
,
1 7 7 5
, 1 6 8 1 , 1 6 1 7
, 1 2 1 1 , 9 8 4等 .
1 7 1 3 9 0 1 3 1
.
7 1 6 4
.
5
2 4 5
.
7 0 0 19 5
.
8 1 0 4
.
0
3 1 2 2
.
1 0 5 1 3 5
.
3 1 8 2
.
2
4 1 4 7 0 2 1 1 70
.
0 1 5 7
.
7
5 6 4 2 1 0 5 2
.
8 9 9龙
6 8 2
.
7 1 2 8 3
.
4 1 6 4
.
0
7 4 6
.
6 8 3 5 1 8 9 4 6
8 2 7 5 1 0 2 3
.
5 1 6 1
.
8
9 4 3
.
7 3 0 3 7
.
5 1 0 4
.
7
1 0 74
.
1 1 3 15 2
.
1 1 6 4 5
1 1 4 2
.
3 3 8 3 9
.
2 C H s O
一
3
, ,
5 6 7
1 2 1 7 8
.
9 3 1 1 7 8 3 C H 3 O
一
5
, ,
5 6夕
1 3 1 3
.
1 0 5 9
.
8
1 4 2 9
.
4 3 0 2 1
.
4
1 5 1 3
.
7 0 0 1 9
.
6
1
’
5 7
.
1 10 1 2 0
.
8
2
,
4 6
.
5 2 3 1 0 4
.
7
3
,
5 8
.
90 7 1 4 8
.
6
4
,
13 4
.
9 6 4 1 4 0
.
2
5
,
14 7 5 5 0 1 4 8
,
6
6
,
8 1
.
6 2 1 1 0 4
,
1
7
,
4 9
.
4 14
8
,
2 3
.
6 0 0
9
,
4 2
.
5 9 8
10
,
7 1
.
9 2 0
1 1
’
4 2 0 1 0
12
,
1 7 9
.
3 8 8
13
,
1 2
.
2 0 5
1 4
,
3 2
.
3 0 0
1 5
,
18
,
3 1 3
1 5 5
.
7 6 7
13 7
.
7 6 9
178
.
2 3 4
1 5 1
.
75 7
1 3 1
.
6 1 7
1 5 8
.
6 5 4
9 1 4 1 5
1 5 1
.
4 3 0
10 5石 70
王20 . 7 7 1
1 1 2
.
1 0 0
1 4 7
.
5 1 0
14 9
.
9 3 9
1 15
.
6 4 3
12 2 3 3 4
化合物 3 : 黄色针 状或棒状 晶体 , m . .P 2 73 、
2 75
“
C ; FA B
一
M S : 3 3 1
.
0 (M + + 1)
, 3 53
.
1 (M + + N
a
); E l
-
M S : M +
,
33 0 ( 10 0 ) ; M + + 1
, 3 3 1 ( 1 8 )
, 1 5 3
, 1 5 1 (A
一
)
和 。 /: 1 7 8 (B 一 ) . IR (年 e m 一 1 ): 3 3 0 9 , 2 6 5 5 , 1 6 1 3 ,
1 50 6
, 1 4 6 4 , 1 3 5 9
, 1 33 4
, 1 3 0 6
, 1 16 7
, 1 1 1 8 , 8 3 6
.
I H
一
N M R (占, H z ): 6
.
5 3 ( I H
,
d
,
J = 1
·
Z H z
,
6
一
H )
,
6
.
2 0 ( I H
,
d
,
J = 1
.
2 H z
,
8
一
H )
, 1二己. 9 6 (I H , s , 5一O H ) ,
7
.
3 1( ZH
, s , 2
’ 一
H
, 6
,一
H )
,
6
.
9 6 (H
, s , 3
一
H )
, 3
,
8 8 (6 H
, s ,
3 , , 5
,一
O M e )
. 碳谱数据见表 1 .
化合物 4 : 黄 色针状结晶 ; C 19 H 18 0 , , m . .P
1 83
.
5、 18 4 . 5 o C ; F AB 一M S 。 /: : 37 5 (M + + 1 ); IR (K B r ,
兰 州大学学报 (自然科学版 )第 4 0卷
m a x
, e m 一 1 ): 3 3 9 9 0
, 1 6 5 5
.
4 , 1 59 9
.
7 , 1 5 15
.
2 , 1 48 1
.
4 ,
1 4 3 2
.
9
, 1 3 4 9
.
6 , 5 0 7
.
0
, 7 5 2
.
7等 . I-H N M R (D M S O ,
百): 6 · 8 7 9 7 ( I H , s , H一 8 ) , 7 . 6 14 9 ( I H , d d , J = 2 . 5 ,
8
.
S H z
, 休 6 , ) , 6 9 5 5 8 ( I H , d , J = 8 . S H z , -H 5 ’ ) ,
7
.
6 6 3 5 ( I H
,
d
,
J = 2
.
S H z
,
H
一
2 ’ )
,
9
.
9 2 9 2 ( I H
, 5
一
O H )
,
12
.
6 13 0 ( I H
, 3
一
O H )
· 碳谱数据见表 l ·
.4 2 化合物对 S MM C 一 7 7 2 1存活率 的测定结果
经 过 线 性 回 归 分 析 , 求 出 4种 化 合 物
对 SM M C 一7 7 21 细胞 不 同时 间下 的生长 半抑 制浓
度 I C 50 , 结果见表 .2
表 2 4 种化合物作用 S M M C 一 7 7 2 1 细胞 7 2 h 的 I C o o
了b b l e 2 T h e va l u e s o f I C 5 o o f 4 e o 刃。 P o u n d 吕 o n
SM M C
一
7 7 2 1 i n 7 2 h 拼g /m L
时间 /h 化合物 1
3 7 2
16 3
,
4
15 1
.
6
化合物 2 化合物 3 化合物 4
3 5 3
.
2
18 7
.
3
1 6 0
.
3
> 4 0 0
> 4 0 0
> 4 0 0
> 4 0 0
) 4 0 0
> 40 0
结果显示 , 化合物 1和 2对人肝癌细胞有一定
的杀伤作用 , 且存在时效关系 ; 作用 72 h 后 cI s 。分
别达至l} 1 5 2 . 6 声; ; /丁, 、 I 不「{ 16 0 . 3 / ,然 / ,。飞T .
4
.
3 单细胞电泳检测 D N A 损伤 (图 l)
在电场作 用下 , 受损 的 D N八碎片可以通过 细
胞膜 上 的微小 裂孔 向阳极移动 , 而 未 受损细胞
的 D N A 大分子则由于细胞膜 的阻隔滞留在原处 .
E B染 色后在 落射式荧光显微镜下观察 , 可见 受
损细 胞 电泳 可 产生长 长 的彗 星状拖尾 (图 l) , 损
伤越 重则拖尾越 长 ls, “ ]. 实验结果表 明 , 正常对
照组未受化合物 1 , 2攻击 的单个人肝癌细胞呈圆
形 (图 l a) , 而攻击后 的细胞呈明显 的彗星状 (图 l b ,
d )
, 说明化合物对 SM M C 一 7 72 1细胞的 D N A损伤严
重 , 而且随着化合物的浓度加大 , 这种损伤也呈现
了一定的剂量依赖关系 (图c1 , e) . 而在癌症的发生
和发展过程 中 , D N A 损伤可能导致两种结局 : 细胞
凋亡和致癌性突变 . 遭受严重 D N A 损伤的细胞易
凋亡侧 . 因此我们可 以推测化合物 1, 2有可能通过
对人肝癌细胞 D N A造成损伤 , 诱发凋亡而产生抑
癌作用 . 本文初步证实 了大籽篙具有潜在的抗肿
瘤作用 , 为进一步研究大籽篙的抗肿瘤作用提供
了 一 定的依据 .
2487
!11
!2」
a 对 照 ; 。 )贞址浓度 10 。 子唱 /m L 化合物 1 ; c 质虽浓度加。 赵 g / m L 化合物 1 ;
d 质量浓度 1 0。 赵g /m L 化合物 ;2 e质量浓度 2 0 户 g / m L 化合物 2
图 1 某单细胞电泳检测化合物对 SM M C 一 7 721 细胞 D N A损伤
F i g
.
1 C o m e t
一
l ik e t a i l a P P e ar an e e i n SMM C
一
772 1 e e lls in d u e e d 场 C o m P . 1 a n d C o m P . 2 a ft e r 4 8 h t r e at m e nt
参 考 文 献 r e d i at i o n IJ I. e a n e e : R e s , 199 0 , 50 : 13 92 ,
H u J F
.
I
vne
s t ig a t io n o n t h 。 比e m ie a z 。 o m p o n e nt s !3 } aY n g G Y , s h am s u d d i n A M
.
I n P 6
一
in d u e e d g r
owt
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