全 文 ：收稿日期:2008-11-26
基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2006CB504100)
作者简介:王晓炜(1972-), 女(汉族), 辽宁沈阳人 , 博士研究生 , E-mailwangxiaowei@szda.gov.cn;王乃利(1950-),
男(汉族),辽宁沈阳人,教授,主要从事天然药物化学研究 , Tel.0755-26957800, E-mailwangnl@sz.tsinghua.edu.cn。
文章编号:1006-2858(2009)09-0701-03
田基黄抗缺氧活性成分的分离鉴定与活性测定
王晓炜1, 2 , 毛　羽 2 , 范　明3 , 丁爱石 3 , 王乃利 1 , 姚新生 1
(1.沈阳药科大学 中药学院 , 辽宁 沈阳 110016;2.深圳市药品检验所 ,广东 深圳 518057;
3.军事医学科学院 基础医学研究所 , 北京 100850)
摘要:目的 分离鉴定田基黄(HerbaHypericcijaponici)中抗缺氧活性成分 , 期望得到具有抗缺氧活
性的纯化合物。方法 采用多种柱色谱法进行分离纯化 , 根据理化性质及 IR、NMR、ESI-MS等波谱
数据进行结构鉴定;对分离得到的化合物采用 PC12细胞进行活性追踪 , 评价其体外抗缺氧活性。
结果 分离得到 5个化合物 , 分别为 3-O-甲基槲皮素(3-O-methylquercetin, 1)、原儿茶酸(protocate-
chuicacid, 2)、二氢山柰酚(dihydronaphthol, 3)、二氢槲皮素(dihydroquercetin, 4)、绿原酸(chloro-
genicacid, 5)。结论 化合物 2 ～ 5为首次从田基黄中分离得到;化合物均具有一定的抗缺氧活性 ,
其中化合物 2活性最强。
关键词:田基黄;抗缺氧活性;化学成分;结构鉴定
中图分类号:R914　　　文献标志码:A
　　田基黄为藤黄科植物地耳草(Hypericumja-
ponicumThunblex.Muray)的全草 ,别名小元宝
草 、雀舌草 、七层塔等。地耳草为一年生草本植
物 ,野生于原野湿地 ,分布于华东 、中南及西南 ,主
产于四川 、广东 、广西 、贵州 、湖南 、江西 、福建等
地 。田基黄味甘 、微苦 ,性凉 ,具有清热利湿 、解毒
的功效 ,主要用于治疗传染性肝炎 、泻痢 、小儿惊
风 、疳积 、喉蛾 、肠痈 、疖肿蛇咬伤等[ 1] 。文献报
道田基黄中含有多种化学成分[ 2-7] ,如色原烯类
(chromeme)、二氢黄酮醇鼠李糖苷 (flavanonol
rhamnoside)、二肽衍生物(dipeptidederivative)、
口山酮类(xanthones)、间苯三酚衍生物(phloroglu-
cinolderivatives)等。作者采用多种柱色谱法对
田基黄进行分离纯化 ,得到了 5个化合物 ,根据理
化性质及 IR、NMR、ESI-MS等波谱数据进行了结
构鉴定;采用 PC12细胞体外抗缺氧活性筛选模
型 ,对田基黄的体积分数 60%的乙醇提取物进行了
活性追踪 ,期望得到具有抗缺氧活性的纯化合物。
1　仪器与材料
Esquire2000质谱仪 (瑞士 Bruker公司 ),
Avance400核磁共振波谱仪(TMS为内标 ,瑞士
Bruker公司), LC-8A高效液相色谱仪 、SPD-10A
紫外分光光度计 、 ODS制备柱 (Shim-pack,
250mm×20 mm, 5μm,日本 Shimadzu公司)。
薄层色谱和柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂),
葡聚糖凝胶LH-20(瑞典 AmershamBiosciences公
司), ODS-A120-S150凝胶(日本 Ymcco公司)。
液相用甲醇(色谱纯 ,天津协和公司 、天津康
科德科技有限公司),二次蒸馏水(自制),其他试
剂(分析纯 ,天津康科德科技有限公司)。
药材采购于广西 ,由沈阳药科大学中药学院
孙启时教授鉴定为田基黄 ,即地耳草(Hypericum
japonicumThunb.)的干燥全草。
2　提取分离
田基黄 4.3kg,用 6倍量体积分数 60%的乙
醇回流提取 3次 ,每次 3 h,合并浓缩得总浸膏
893.9 g;将浓缩浸膏用 10倍量水混悬后 ,依次用
等体积的氯仿 、乙酸乙酯 、饱和正丁醇 、水萃取
3次 ,分别得到氯仿层 、乙酸乙酯层 、正丁醇层和
水层。经活性测定乙酸乙酯萃取部位有较好的抗
缺氧活性 ,因此对乙酸乙酯层进行活性追踪分离。
乙酸乙酯层 119.3 g经硅胶柱色谱 、葡聚糖凝胶
LH-20柱色谱 、ODS柱色谱 、制备液相等分离 ,得
到化合物 1(73.7 mg)、2(704mg)、3(11 mg)、4
(2.4mg)、5(33.4 mg)。
第 26卷 第 9期
2 0 0 9 年 9 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.26 　No.9
Sep.2009 p.701
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2009.09.006
3　结构鉴定
化合物 1:黄色无定形粉末 。盐酸镁粉反应
阳性 ,提示可能为黄酮类化合物。 ESI MSm/z:
339[ M+Na] +、315[ M H] - ,推测相对分子质
量为 316,结合 1H NMR谱和 13C NMR谱 ,确定
分子式为 C16H12 O7。 1H NMR(400 MHz, DM-
SO d6)δ:12.69(1 H, s, 5 OH)、7.54(1 H, brs,
H 2′)、7.44(1 H, d, J=7.8 Hz, H 6′)、6.90(1
H, d, J=7.8 Hz, H 5′)、 6.40(1 H, brs, H 8)、
6.18(1 H, brs, H 6)、 3.78(3 H, s, 3 OCH3 )。
13C NMR(100 MHz, DMSO d6)δ:155.6(C
2)、137.6(C3)、177.8(C 4)、161.3(C 5)、98.6
(C6)、164.4(C 7)、93.6(C 8)、156.4(C 9)、
104.1(C10)、120.8(C1′)、115.8(C 2′)、145.3
(C3′)、148.8(C 4′)、115.4(C 5′)、120.6(C
6′)、59.7(3-OCH3)。以上数据与文献 [ 8]中 3
O甲基槲皮素基本一致 ,故确定化合物 1为 3
O甲基槲皮素(3 O Methylquercetin)。
化合物 2:白色针晶(甲醇)。薄层展开喷溴
甲酚绿显色剂显黄色 ,提示可能为羧酸类化合物。
ESI MSm/z:153[ M H] -,推测相对分子质量
为 154,结合 1H NMR谱和 13C NMR谱 ,确定分
子式为 C7H6O4。 1H NMR(400 MHz, DMSO
d6)δ:7.33(1 H, d, J=2.0 Hz, H 2)、7.28(1 H,
dd, J=8.2、2.0 Hz, H 6)、 6.77(1 H, d, J=8.2
Hz, H 5)。 13C NMR(100 MHz, DMSO d6)δ:
166.6(COOH)、121.1(C1)、115.8(C 2)、144.1
(C3)、149.2(C 4)、114.4(C5)、121.1(C 6)。
以上数据与文献 [ 9]中原儿茶酸的数据基本一
致 ,故确定化合物 2为原儿茶酸 (protocatechuic
acid)。
化合物 3:无色针晶(甲醇)。盐酸镁粉反应
阳性 ,提示可能为黄酮类化合物。 ESI MSm/z:
311[ M+Na] +、287[ M H] - ,推测相对分子质
量为 288,结合 1H NMR谱和 13C NMR谱 ,确定
分子式为 C15H12 O6。 1H NMR(400 MHz, DM-
SO d6)δ:11.90(1 H, s, 5 OH)、10.84(1 H, s,
7 OH)、9.55(1 H, s, 4′OH)、7.30(2 H, d, J=
8.4Hz, H 2′, 6′)、6.78(2 H, d, J=8.4Hz, H 3′,
5′)、5.91(1 H, d, J=2.0 Hz, H 8)、5.86(1 H, d,
J=2.0 Hz, H 6)、 5.75(1 H, brs, 3 OH)、 5.05
(1H, d, J=11.4 Hz, H 2)、 4.58(1 H, d, J=
11.4Hz, H 3)。 13C NMR(100 MHz, DMSO
d6)δ:82.9(C 2)、 71.4(C 3)、 197.8(C 4)、
163.3(C 5)、96.0(C 6)、166.8(C7)、95.0(C
8)、162.5(C 9)、 100.4(C 10)、 129.4(C 1′)、
127.5(C 2′)、114.9(C3′)、157.7(C4′)、114.9
(C5′)、127.5(C 6′)。以上数据与文献 [ 10]中
二氢山柰酚的数据基本一致 ,故确定化合物 3为
二氢山柰酚(dihydronaphthol)。
化合物 4:白色针晶(甲醇)。盐酸镁粉反应
阳性 ,提示可能为黄酮类化合物。 ESI MSm/z:
303[ M H] -,推测相对分子质量为 304,结合
1H NMR谱和 13C NMR谱 , 确定分子式为
C15H12O7。1H NMR(400 MHz, DMSO d6 )δ:
11.89(1 H, s, 5 OH)、 10.81(1 H, s, 7 OH)、
9.01(1 H, s, 4′OH)、8.96(1 H, s, 3′OH)、6.87
(1H, s, H 6′)、 6.74(2 H, s, H 2′, 5′)、 5.90
(1H, d, J=2.1 Hz, H 8)、 5.85(1 H, d, J=
2.1Hz, H 6)、4.98(1 H, d, J=11.1 Hz, H 2)、
4.50(1 H, d, J=11.1 Hz, H 3)。 13C NMR
(100MHz, DMSO d6)δ:83.0(C 2)、71.5(C
3)、197.7(C4)、163.3(C5)、95.9(C 6)、166.7
(C7)、94.9(C8)、162.5(C9)、100.5(C 10)、
128.0(C 1′)、115.3(C2′)、144.9(C3′)、145.7
(C4′)、115.1(C 5′)、119.3(C 6′)。以上数据
与文献 [ 11]中二氢槲皮素的数据基本一致 ,故确
定化合物 4为二氢槲皮素(dihydroquercetin)。
化合物 5:淡黄色粉末。薄层展开喷溴甲酚
绿显色剂显黄色 ,提示可能为羧酸类化合物。 ESI
MSm/z:377[ M+Na] +、353[ M H] - ,推测相
对分 子 质 量 为 354, 结 合 1H NMR谱 和
13C NMR谱 , 确 定 分 子 式 为 C16 H18 O9。
1H NMR(400 MHz, DMSO d6)谱奎宁酸部分
δ:1.88(1 H, m, H 3)、5.16(1 H, m, H 4)、3.63
(1H, m, H 5)、3.86(1 H, m, H 6)、1.99(1 H,
m, H 7);咖啡酰基部分 δ:6.19(1 H, d, J=15.9
Hz, H 2)、7.46(1 H, d, J=15.9 Hz, H 3)、7.02
(1H, d, J=2.0 Hz, H 5)、9.18(1 H, s, 6 OH)、
9.55(1 H, s, 7 OH)、6.76(1 H, d, J=8.1 Hz, H
8)、 6.95(1 H, dd, J=8.1、 2.0 Hz, H 9)。
13C NMR(100MHz, DMSO d6)谱奎宁酸部分
δ:176.0(C 1)、 73.0(C 2)、 35.1(C 3)、 70.4
(C4)、71.3(C 5)、67.7(C 6)、34.9(C 7);咖
啡酰基部分 δ:166.1(C 1)、115.0(C 2)、144.4
(C3)、125.7(C 4)、115.8(C5)、145.6(C 6)、
148.1(C 7)、114.6(C8)、121.1(C9)。以上数
702 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 26卷　
据与文献 [ 12]中绿原酸的数据基本一致 ,故确定
化合物 5为绿原酸(chlorogenicacid)。
4　活性测定
PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克
隆的细胞株 ,细胞膜上有 NMDA受体 , 胆碱能
M、N受体等 ,并具有纯化程度高 、生长繁殖快 、培
养周期短 、使用方便 、条件易控制等优点 ,已广泛
用作研究神经细胞分化 、离子通道 、受体 、递质的
实验材料[ 13] 。
取培养 8 d的 PC12细胞 ,按实验分为阳性对
照组(黄芩苷 , baicalin)和供试品各组(供试品质
量浓度分别为 50、100、200 mg·L-1)。各供试品
孵育 PC12细胞 1 h, 然后用 31.25 μmol·L-1
CoCl2进行缺氧处理 2 h,最后用四甲基偶氮唑盐
微量酶反应比色法(MTT)检测细胞存活情况。
以常氧对照组的细胞存活率为 100 %,其他各组
与之相比 ,获得细胞存活率 。细胞存活率 =缺氧
对照组或缺氧加药组细胞数 /常氧对照组细胞
数 ×100%。表 1结果表明 ,所有化合物的抗缺氧
活性均优于阳性对照组 , 其中化合物 2的活性
最强。
Table1　Survivalrates(%)ofPC12 celstreatedbycompoundsatdifferentconcentration
Compound ρ(compound)/(mg·L
-1)
50 100 200
Baicalin 84.59±7.14 — —
1 169.76±10.71a 176.41±6.80a 173.53±13.62a
2 232.60±5.08a 237.22±6.47a 182.08±6.40a
3 133.42±28.03a 160.30±28.59a 134.97±19.61a
4 142.30±10.48a 102.28±8.72a 96.19±12.53b
5 98.81±9.74a 95.73±5.62b 103.60±6.26a
　　a—P<0.01, b— P<0.05, vspositivecontrol(n=8)
5　结论
采用体外抗缺氧活性测定与提取分离相结合
的方法从田基黄体积分数 60%的乙醇提取物中
追踪分离 ,鉴定了 5个化合物 ,包括 3个黄酮类化
合物 , 2个酚酸类化合物;化合物 2 ～ 5为首次从
田基黄中分离得到;采用 PC12细胞测定 5个化合
物的体外抗缺氧活性 ,化合物均显示出比阳性对
照更好的活性 ,其中化合物 2的活性最强 。
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(下转至第 708页)
703第 9期 王晓炜等:田基黄抗缺氧活性成分的分离鉴定与活性测定
Isolationandidentificationofsecondarymetabolites
frommyceliaofmarinefungusNo.Y19-07
WANGYa-nan, LUXuan, SUNSha, WUHong-hua, ZHANGQi-hui, PEIYue-hu
(SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016,
China)
Abstract:ObjectiveTostudythethechemicalconstituentsfromthemyceliumofmarinefungusNo.Y19-07.
MethodsThecompoundsfromtheacetoneextractwereisolatedbythesilicagelcolumn, SephadexLH-20
columnandHPLC, andtheirstructureswereidentifiedby1H-NMR, 13C-NMR, EI-MSandcomparisonof
chemicalandphysicaldatawithauthenticsamplesreportedinliteratures.ResultsNinecompoundswereiso-
latedfromtheacetoneextractsofthemyceliaofmarinebacteriaNo.Y19-07.Sevenofthemwereidentified
asgriseofulvin(1), 1, 6-dihydroxy-3-methoxy-8-methylxanthone(2), methyl2-pyrrolidone-5-carboxylate
(3), 3-benzyl-pyrolopiperazine-1, 4-dione(4), p-hydroxyphenethylalcohol(5), p-hydroxybenzylmethyl
ether(6), mannitol(7).ConclusionsAlofthecompoundsareobtainedfromthismarinefungusforthefirst
time.
Keywords:marinefungus;acetoneextract;chemicalconsitutent;structureidentification
(上接第 703页)
Isolation, identificationandactivitydeterminationon
theanti-hypoxiccomponentsofHypericumjaponicum
Thunb.
WANGXiao-wei1, 2 , MAOYu2 , FANMing3 , DINGAi-shi3 , WANGNai-li1 , YAOXin-sheng1
(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016,
China;2.ShenzhenInstituteforDrugControl, Shenzhen518057, China;3.BasicPhysicGraduateSchoolof
MilitaryMedicineAcademy, Beijing100850, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheanti-hypoxiccomponentsoftheHerbaHypericijaponici(thewholeplant
ofHypericumjaponicumThunb.).MethodsCompoundswereisolatedthroughvariouschromatography
techniques.Theywereelucidatedonthebasisofphysico-chemicalpropertiesandspectralmethodsandtheir
anti-hypoxicactivitywereevaluatedbyPC12 cels.ResultsFivecompoundswereisolatedfromtheHyperi-
cumjaponicumThunb.andconfirmedas3-O-methylquercetin(1), protocatechuicacid(2), dihydronaphthol
(3), dihydroquercetin(4), chlorogenicacid(5).ConclusionsAmongthem, compounds2-5 areisolated
fromtheplantforthefirsttime.Althecompoundshavesomeanti-hypoxicactivities, whereincompound2
exhibitsverystronganti-hypoxicactivity.
Keywords:HerbaHypericcijaponici;anti-hypoxicactivity;chemicalconstituent;stuctureidentification
708 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 26卷