全 文 ： 表 2 氧化苦参碱含量测定加样
回收率考察试验数据(n=6)
称样量
(mg)
样品中含量
(mg)
加入量
(mg)
测得值
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
%
373.5 0.7097 0.7384 1.4594 101.54
391.7 0.7442 0.7384 1.4901 101.01
393.1 0.7469 0.7384 1.5156 104.10 101.27 2.82 259 275 46 5 99 94
374.6 0.7117 0.7384 1.4339 97.80
380.8 0.7235 0.7384 1.4859 103.24
结果:苦参碱 、氧化苦参碱含量测定的方法有较好的
加样回收率 , 符合相关要求 ,所得数据准确可靠。
2.10 样品含量测定 对 3批样品 , 分别按供试品溶液制
备方法制备供试液 , 精密吸取供试品溶液及对照品溶液 ,
照上述色谱条件测定 ,并计算含量。结果见下表。
表 3 样品中苦参碱和氧化
苦参碱含量测定(n=3)
样品批号 苦参碱含量(标示量)% RSD%
氧化苦参含量碱
(标示量)% RSD%
20071001 0.0472 0.192
20071012 0.0475 0.191
20071013 0.0480 0.85 0.188 1.09
3 讨论
3.1 我们在进行深入细致的方法学研究中 , 做了各种不
同流动相 、色谱条件及系统适应性试验的考察与选择 , 包
括各种不同溶剂的选择 ,各种辅料在不同溶剂中的溶解情
况的考察 , 各种不同超声溶剂的选择及超声时间的考察
等 , 结果优选出流动相为乙腈∶无水乙醇∶3%磷酸溶液(81
∶10∶9), 检测波长 λ=220nm为本泡腾栓样品的最佳色谱
条件 , 用乙醇加氨水作为最佳溶解样品的溶剂 , 超声处理
10min作为样品的最佳提取方法。
3.2 因测定苦参碱与氧化苦参碱时干扰较多 , 尝试一般
样品的制备不能达到分离要求 , 用中性氧化铝柱处理后 ,
样品杂质对此两种化合物的分离基本无影响 , 能较好的测
定各自的含量。样品取样量较大处理时 , 泡腾系统与基质
PEG均可溶 ,应用适当可溶性溶剂处理后定容较为合理。
3.3 抗炎泡腾栓样品中苦参碱与氧化苦参碱含量相对较
低 , 对样品的取样量较大。因泡腾栓样品中辅料占有量较
大且溶于三氯甲烷 , 加入氨水后酸碱系统也会发泡溶解 ,
会改变溶液体积 , 影响定量 , 故应先加入少量溶液放置 , 待
发泡充分后再超声处理 , 样品处理过程中应选择先溶解至
一定量量瓶中稀释至刻度为好。
3.4 苦参碱 、氧化苦参碱 UV吸收均为未端吸收 , 使用氨
基柱时检测波长为 220nm时响应值增大 ,且并未有较大的
基线漂移而影响含量测定 , 故可作为检测波长。
3.5 据报道苦参药材在提取过程中 , 苦参碱与氧化苦参
碱相互转化 [ 3] , 但在本样品制备过程中未有较高温度的加
热处理 , 样品中苦参碱与氧化苦参碱均能较稳定存在。故
文中方法操作简便 , 测定结果准确 , 可用于抗炎泡腾栓中
苦参碱与氧化苦参碱的含量测定 。
参考文献
[ 1] 贵州省药监局 ,编 , 贵州省中药材 、民族药材质量标准 [ S] .
2003年版 ,贵阳:贵州科技出版社, 2003.
[ 2] 陈德媛等主编 , 苗族医药学 [ M] .贵阳:贵州民族出版
社, 1992.
[ 3] 田娟 ,王维皓 ,高慧敏等.HPLC测定复方苦参碱注射液中苦
参碱 、槐定碱和氧化苦参碱的含量 [ J] .中国中药杂志 ,
2007, 32(3):222.
基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项黔科合农字(2006)5043号
通讯作者:梁光义 E-mail:guangyi liang@21cn.com
收稿日期:2008-12-26
HPLC法测定田基黄药材槲皮素的含量
王欣欣 , 张永萍 ,冯昀熠 , 梁光义＊
(贵阳中医学院 贵州贵阳 550002)
摘要:目的:建立田基黄药材中槲皮素的含量测定方法。方法:采用反相高效液相色谱法 , 迪马(钻石)C18色谱柱。甲
醇 -0.06%磷酸(52∶48)为流动相 ,流速为 1.0mL· min;检测波长 360nm。结果:槲皮素的线性范围是 7 ～ 42μg/ml(r=
0.9999);槲皮素平均回收率为 100.3%, RSD=2.1%。结论:该方法简便 、准确 , 可用于田基黄中槲皮素的含量测定。
关键词:田基黄;槲皮素;HPLC
·18·
第 31卷 第 3期
2009年 5月
贵阳中医学院学报
JGCTCM
No.3 Vol.31
May 2009
DOI :10.16588/j.cnki .issn1002-1108.2009.03.025
中图分类号:R927.2 文献标识码:B 文章编号:1002-1108(2009)03-0018-02
田基黄 HypericumjaponicumThumb.始载于《生草药性
备要》 、《植物名实图考》 , 又称地耳草 , 为藤黄科植物田基
黄全草。生于田野较湿润处 , 广布于长江流域及其以南各
地 , 主产于江西 、福建 、广东 、广西 、四川 、贵州等地。 现代
药理研究表明田基黄具有抑菌 、保肝 、抑制肿瘤等作用;对
心血管系统也有作用 ,目前田基黄已被制成注射剂用于临
床治疗急 、慢性肝炎 [ 1] 。 田基黄的化学成分主要有黄酮 、
黄烷醇及其苷类和间苯三酚等化合物 , 其中 3个黄酮类化
合物异槲皮苷 、槲皮苷 、田基黄苷均有保肝退黄作用 [ 2] 。
为了更有效地对其进行质量控制 , 本实验参考文献 [ 3] , 采
用正交设计法对样品的提取和水解条件进行了研究 , 建立
了田基黄中槲皮素高效液相色谱测定方法。
1 仪器与试剂
岛津 20AT高效液相色谱仪 , LCsolutiong色谱工作站。
槲皮素对照品(购自中国药品生物制品检定所 , 批号
100081— 200406, ), 田基黄购于贵阳药材市 , 经贵阳中医学
院何顺治教授鉴定为 Hypericum-japonicumThumb的干燥
全草;甲醇为色谱纯 , 水为重蒸馏水 , 其余试剂均为分
析纯。
2 色谱条件
迪马(钻石)C18色谱柱(4.6mm×250mm, 5um), 柱温
35℃;流动相甲醇 -0.06%磷酸(52:48), 进样量 10μl;流
速 1.0mL· min-1 , 检测波长 360nm。分离结果如图 1:
图 1 槲皮素对照品(A)和田基黄(B)的 HPLC色谱图
3 方法与结果
3.1 溶液的制备 对照品溶液的制备:精密称取于 120℃
下干燥 4小时的槲皮素对照品 0.7mg于 25ml容量瓶中 ,加
甲醇溶解并定容至刻度 , 制成浓度为 0.028mg/ml的槲皮
素对照品溶液。
供试品溶液的制备:0.5g田基黄粗粉 , 置 50ml圆底烧
瓶中 , 加入 MeOH:25%HCL(3:1), 混合溶剂 35ml, 称定重
量 , 置水浴中加热回流 1h,放冷 , 称重 , 并用提取液(溶剂)
补足重量 , 摇匀 , 滤过 , 精密量取滤液 4ml于 25ml容量瓶
中 , 加 MeOH至刻度。
3.2 样品提取方法的优选 通过正交实验设计 , 以田基
黄中槲皮素的含量为指标 ,考察因素:盐酸的百分比浓度 ,
甲醇与盐酸混合溶剂的体积比 , 溶剂用量 , 回流提取的时
间 , 应用 L9(34)正交设计表进行试验 , 因素水平安排如
表 1:
表 1 因素水平表
HCL% 因素HCL% 醇酸比 溶剂用量(ml)水解时间(min)
1
2
3
10
20
30
2∶1
3∶1
4∶1
15
25
35
30
60
90
表 2 正交试验安排与结果
试验号 因素A B C D
槲皮素含量
(mg/g)
1 1 1 1 1 4.97
2 1 2 2 2 6.67
3 1 3 3 3 6.82
4 2 1 2 3 5.33
5 2 2 3 1 7.65
6 2 3 1 2 6.77
7 3 1 3 2 6.35
8 3 2 1 3 6.51
9 3 3 2 1 6.33
K1 6.093 5.55 6.083 6.317
K2 6.583 6.883 6.050 6.537
K3 6.397 6.640 6.940 6.220
R 0.490 1.333 0.890 0.317
·19· 第 3期 王欣欣 , 张永萍 ,冯昀熠.HPLC法测定田基黄药材槲皮素的含量
表 3 方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
SA 0.367 2 2.323
SB 3.025 2 19.146 P<0.05
SC 1.527 2 9.665
SD(误差 ) 0.158 2 1.000
从表 2的级差 R值大小显示 ,各因素作用主次为:B>
C>A>D。方差分析结果(表 3)显示 ,醇酸比有较显著性
意义 , 盐酸的百分比浓度 , 溶剂用量 , 回流提取的时间无显
著性意义。 从上述结果可得较优的提取及水解条件
为 A
2
B
2
C
3
D
1
。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性关系考察 取槲皮素对照品 1.75mg加入到
25ml容量瓶中 , 加甲醇定容 , 配置称浓度为 0.07mg/ml的
槲皮素对照品溶液 , 在从中分别取 1ml、 2ml、3ml、4ml、5ml、
6ml加入到 10ml容量瓶中 , 用甲醇定容至刻度 ,配成 7μg/
ml、14μg/ml、21μg/ml、28μg/ml、 35μg/ml、 42μg/ml的对照
品溶液 , 分别取 10μl进样 。以峰面积(A)对对照品溶液系
列浓度(C)进行回归 , 得回归方程 A=51777C— 28433, r=
0.9999,试验表明槲皮素浓度在 7μg/ml～ 42μg/ml之间与
峰面积线性关系良好 。
3.3.2 精密度试验 精密称取 0.5g药材粗粉 , 置 50ml圆
底烧瓶中 , 加入 MeOH∶25%HCL(3∶1), 混合共 35ml, 称定
重量 , 置水浴中加热回流 30min, 放冷 , 称重 , 并用提取液
(溶剂)补足重量 , 摇匀 , 滤过 , 精密量取滤液 4ml于 25ml
容量瓶中 , 加 MeOH至刻度 , 取 10μl进样 , 连续测定 5次 ,
记录峰面积并计算 , 结果槲皮素的 RSD为 0.8%,表明仪器
精密度良好。
3.3.3 稳定性试验 将样品溶液在室温下贮存 , 于 0.0,
2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0h测定 , 结果样品溶液在
12.0h内稳定 ,槲皮素峰面积 RSD为 1.7%。
3.3.4 重现性试验取同一批的地耳草药材 6份 , 分别精密
称定 , 按上述样品溶液制备方法和色谱条件测定 , 计算含
量 , RSD为 0.7%(n=6)。结果表明该方法具有较好的重
现性。
3.3.5 加样回收率试验精密称取已知含量的同一批号样
品共 9份 , 按高中低浓度(即 1∶1.2、 1∶1、1∶0.8三个梯度)
加入相应量的槲皮素对照品 , 按供试品溶液的制备方法处
理并测定 , 计算回收率 ,结果见表 4。槲皮素平均回收率为
100.33%, RSD∶2.1%。结果表明本方法准确可靠。
表 4 加样回收率试验结果
取样量
g
样品含量
mg
加入量
mg
测得量
mg
回收率
%
平均回
收率%
RSD%
0.250 1.63 2.02 3.65 100.0
取样量
g
样品含量
mg
加入量
mg
测得量
mg
回收率
%
平均回
收率% RSD%
0.250 1.63 2.02 3.70 103.0
0.250 1.63 2.02 3.69 102.0
0.250 1.63 1.62 3.20 97.0
0.250 1.63 1.62 3.24 99.3 100.33 2.1
0.250 1.63 1.62 3.21 97.5
0.250 1.63 1.30 2.96 101.8
0.250 1.63 1.30 2.97 102.4
0.250 1.63 1.30 2.93 100.0
3.3.6 样品测定按 3.1项下操作 ,分别对 3批样品按上述
含量测定方法进行测定 , 另进对照品溶液 , 以外标法计算
含量 , 结果 3批样品中槲皮素的含量分别为 6.25mg· g-1 ,
6.78mg· g-1 , 6.55mg· g-1。
4 讨论
4.1 本试验曾采用文献方法 [ 4]进行供试品溶液的制备 ,
即取田基黄药材细粉 1.0g, 精密称定 , 准确加入 70%甲醇
50ml,称重 , 超声 40min, 放冷 , 称重后 , 用 70%甲醇补足减
失的重量。摇匀 , 过滤 , 精密称取 30ml过滤液 , 加入 25%
盐酸 25ml,水浴回流水解 60min,快速冷却 ,定容至 50ml,摇
匀 , 离心 10min, 取上清液滤过(0.45um), 10μl进样 , 计算
得田基黄中槲皮素得含量为 5.87mg/g,而本试验采用得供
试品制备方法测得田基黄中槲皮素得含量为 6.52mg/g。
经分析 , 田刚等 [ 5]的测定田基黄的槲皮素的含量是用酸水
解药材的超声提取液 , 而本试验采用酸直接水解田基黄药
材 , 水解的比较充分。
4.2 流动相的 PH与峰的对称性的关系 通过试验证明 ,
当样品的 pH值小于流动相的 pH值的时候 , 吸收峰前沿 ,
当样品的 pH值大于流动相的 pH值的时候 , 吸收峰拖尾 ,
也就是说当吸收峰前沿时可以加大流动相中酸的用量 , 当
吸收峰拖尾的时候可以在流动相中适量的加上弱碱 , 也可
以通过调节样品的 pH使峰的对称性良好。
参考文献
[ 1] 宋立人 ,胡熙名 , 张国镇 , 等。中华本草 [ M] .上海:上海科
学技术出版社 , 1999.598-601.
[ 2] 江苏新医学院编 .中药大辞典(上册)[ M] .上海;上海人民
出版社 , 1977.813-814.
[ 3] 李沛波 ,王永刚 ,吴钉红 ,等.田基黄中三个黄酮类化合物保
肝退黄作用的实验研究 [ J] .中山大学学报 , 2007, 28
(1):40.
[ 4] 刘易蓉 ,梁光义 ,张永萍 .小花清风藤中槲皮素的提取工艺
研究 [ J] .贵州医药 , 2006, 30(6):566.
[ 5] 田刚 ,彭国平 .高效液相色谱法测定地耳草中槲皮素的含量
[ J] .中国中药杂志 , 2004, 29(5):476.
·20· 贵阳中医学院学报 第 31卷