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藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定



全 文 :第38卷第2期          西 南 大 学 学 报 (自然科学版)           2016年2月
Vol.38 No.2 Journal of Southwest University(Natural Science Edition) Feb. 2016
DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2016.02.027
藏药材牛尾蒿中总黄酮提取
工艺优化及质量分数测定

杨正明1, 滕 云1, 王景富1, 李 波1, 刘 圆2
1.西南民族大学 化学与环境保护工程学院,成都610041;2.西南民族大学 民族医药研究院,成都610041
摘要:采用紫外分光光度法,以芦丁为对照品测定牛尾蒿中总黄酮的质量分数.通过单因素试验考察乙醇体积分
数、提取时间、提取温度和料液比对总黄酮提取率的影响,并采用L9(34)正交试验优化藏药材牛尾蒿中总黄酮的
提取工艺,测定各样品中总黄酮质量分数.结果表明:最佳提取工艺为乙醇体积分数20%,提取温度90℃,提取时
间1.0h,料液比1∶50(g/mL),在此条件下,牛尾蒿中总黄酮提取率为67.88mg/g;不同植株部位总黄酮质量分
数差异有统计学意义,以叶中质量分数最高;煅烧成炭后,总黄酮质量分数明显降低.优化后的提取工艺合理、可
行,可用于牛尾蒿总黄酮的提取;牛尾蒿炭(闷煅)工艺的科学性和必要性有待进一步综合评价.
关 键 词:牛尾蒿;牛尾蒿炭;总黄酮;正交试验;提取工艺
中图分类号:R931    文献标志码:A    文章编号:1673-9868(2016)02-0176-06
藏药材牛尾蒿为菊科植物牛尾蒿Artemisia subdigitata Mattf.的干燥地上部分,是藏药普尔芒类药材
来源之一,被藏族人民视为止咳祛痰圣药[1-3],具有止咳平喘、祛痰、抗炎、抗菌、抗病毒、杀虫、抗疟疾、
抗肿瘤、抗氧化性和保肝等作用[4-5].普尔芒可以直接研磨药用、煎膏药用或煅灰(明煅和闷煅)药用,常配
方用药:煎膏或直接入药常用于清热解毒、消炎以及瘟疫等症;煅灰常用于虫病、疮疖、止血、干脓水或黄
水等症[6-7].牛尾蒿全草主要有效成分为挥发油、黄酮、香豆素、单萜类、倍半萜类、三萜类、苯丙素类、酚
类、皂苷、鞣质、蛋白质、糖类、油脂等化学成分[8-9].作为许多传统药材中的有效成分,黄酮类化合物具
有抗氧化、抗衰老、抗炎镇痛、免疫调节、降血脂、抗肿瘤、抗辐射等药理作用[10-11].本试验以总黄酮提取
率为考察指标,在单因素试验的基础上,采用正交试验优选牛尾蒿中总黄酮的回流提取工艺,并测定牛尾
蒿和牛尾蒿炭(闷煅)中总黄酮的质量分数,以期为藏药材牛尾蒿的进一步开发研究及牛尾蒿和牛尾蒿炭的
化学成分差异的研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
TU-1950型双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;ESJ200-4电子天平,沈阳
龙腾电子有限公司.牛尾蒿(炭)药材分别于2013年7月3日采自于四川省阿坝州松潘县水晶乡川盘村(川
主寺药泉山庄,海拔3 300m),2014年7月9日购于四川省阿坝藏族羌族自治州藏医院,所有样品均经西
① 收稿日期:2015-05-28
基金项目:国家自然科学基金项目(81173653);西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2015SZ061).
作者简介:杨正明(1990-),男,云南丽江人,硕士研究生,主要从事少数民族药物的研究.
通信作者:刘 圆,博士,教授.
南民族大学刘圆教授鉴定为菊科植物牛尾蒿A.subdigitata Mattf,粉碎,过3号筛,备用;芦丁对照品
(批号:100080-201408),中国食品药品检定研究院;水为纯净水;试剂均为分析纯.
1.2 试验方法
1.2.1 对照品溶液的制备
精密称取7.8mg的芦丁对照品,用70%乙醇定容至50mL,摇匀,即得0.156mg/mL的芦丁对照品
溶液.
1.2.2 供试品溶液的制备
取0.5g牛尾蒿药材粉末(注:单因素和正交试验所用药材均为采于川主寺药泉山庄的牛尾蒿地上部
分),精密称定,在设定的试验条件下按一定的乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比提取,过滤,
并用少量提取液洗涤,定容至50mL容量瓶中,摇匀,即得牛尾蒿总黄酮供试液.
1.2.3 标准曲线的绘制[12]
精确量取1.4,1.8,2.2,2.6,3.0,3.4,3.8mL芦丁对照品溶液,置于10mL比色管中,分别加入
0.4mL的5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置6min加入0.4mL的10%硝酸铝溶液,摇匀,6min后加入5mL
4%的氢氧化钠溶液,并用水定容至刻度,摇匀,放置15min.以试剂空白作参比,于510nm处测定其吸光
度,以芦丁质量浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程:
A=11.407C+0.035 8
其线性相关系数为R2=0.999 2,结果表明芦丁对照品溶液在21.84~59.28μg/mL线性关系良好.
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 精密度试验
精密量取6份1.2.1项下对照品溶液2mL,按1.2.3项下方法显色,于510nm处测定A,计算相对
标准偏差(RSD)为0.85%,表明仪器精密度好.
2.1.2 重复性试验
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,按1.2.3项下方法于
510nm处测定A,计算RSD 为0.56%,表明本方法重复性较好.
2.1.3 稳定性试验
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,按1.2.3项下方法显
色,每隔15min(n=6)测定1次,RSD 为1.12%,表明在90min内稳定性良好.
2.1.4 加样回收率试验
取6份0.05g牛尾蒿药材粉末,精密称定,加入适量的芦丁对照品溶液,按1.2.2项下方法制备供试
品溶液,按1.2.3项下方法显色,于510nm处测定A,计算平均回收率为98.53%,RSD 为1.86%,表明
该方法准确可靠.
2.2 单因素试验考察
2.2.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,分别加入体积分数为10%~60%的乙醇水溶液15mL,
70℃水浴加热1.5h,提取1次.过滤,用少量提取液洗涤,滤液定容至50mL容量瓶中,取0.8mL于
10mL具塞比色管中,按1.2.3项下方法显色测定,计算总黄酮提取率,结果如图1所示.由图1可知,乙
醇体积分数为30%时,总黄酮提取率最高.随着乙醇体积分数的增加,产生较大的渗透压,一些醇溶性杂
质、色素等成分溶出增多,导致黄酮类化合物提取率下降[13-14].
2.2.2 提取时间对总黄酮提取率的影响
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,加入30%的乙醇15mL,70℃水浴分别加热0.5,1.0,1.5,
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2.0,2.5,3.0h,提取1次.过滤,用少量提取液洗涤,滤液定容至50mL容量瓶中,取0.8mL于10mL
具塞比色管中,按1.2.3项下方法显色测定,计算总黄酮提取率,结果如图2所示.由图2可知,提取时间
为1h时,总黄酮提取率最高.随着提取时间的延长,未溶出的总黄酮量已经很少,其他杂质可能会增多,
从而导致提取率的降低[15].
图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 图2 提取时间对总黄酮提取率的影响
2.2.3 提取温度对总黄酮提取率的影响
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,加入30%的乙醇15mL,分别于40~90℃下水浴加热
1.0h,提取1次.过滤,用少量提取液洗涤,滤液定容至50mL容量瓶中,取0.8mL于10mL具塞比色
管中,按1.2.3项下方法显色测定,计算总黄酮提取率,结果如图3所示.由图3可知,提取温度为80℃
时,总黄酮提取率最高.随着提取温度的升高,加快了分子的扩散能力,总黄酮的提取率增大,当达到一定
温度时,总黄酮提取率达到最大,但继续升高温度,提取率反而下降,这可能是因为高温引起了黄酮类物
质结构的变化,亦或是温度达到溶剂沸点以后,造成溶剂的损失,总黄酮得率降低[13,16].
2.2.4 料液比对总黄酮提取率的影响
取6份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,加入的料液比为20~70倍量的30%乙醇,80℃水浴加热
1.0h,提取1次.过滤,用少量提取液洗涤,滤液定容至50mL容量瓶中,取0.8mL于10mL具塞比色
管中,按1.2.3项下方法显色测定,计算总黄酮提取率,结果如图4所示.料液比较低时,牛尾蒿药材得不
到完全浸润,使得黄酮不能很好地溶出;当料液比为1∶40(g/mL)时,总黄酮提取率达到最大,随着料液
比的继续增加,总黄酮提取率反而降低,可能是某些脂溶性杂质的溶出量增加,干扰因素增多所致[17].
图3 提取温度对总黄酮提取率的影响 图4 料液比对总黄酮提取率的影响
2.3 正交试验
根据单因素试验的结果,选取影响牛尾蒿总黄酮质量分数的4个因素:乙醇体积分数(A),提取时间
(B),提取温度(C),料液比(D)作为考察因素,因素水平安排见表1.每个因素设定3个水平,按L9(34)表
设计试验,并计算总黄酮质量分数.试验结果见表2,方差分析见表3.
871 西南大学学报(自然科学版)     http://xbbjb.swu.edu.cn     第38卷
表1 因素水平表
水平
因     素
乙醇体积分数A/% 提取温度B/℃ 提取时间C/h 料液比D/(g·mL-1)
1  20  70  1  1∶30
2  30  80  1.5  1∶40
3  40  90  2  1∶50
表2 正交试验设计和结果
试验号 A  B  C  D 总黄酮得率/(mg·g-1)
1  1  1  1  1  57.73
2  1  2  2  2  61.06
3  1  3  3  3  67.31
4  2  2  1  3  66.66
5  2  3  2  1  59.46
6  2  1  3  2  58.85
7  3  3  1  2  65.03
8  3  1  2  3  62.20
9  3  2  3  1  58.67
K1 62.03  59.59  63.14  58.62
K2 61.66  62.13  60.91  61.65
K3 61.97  63.93  61.61  65.39
R  0.38  4.34  2.23  6.77
表3 方差分析结果
方差来源 SS  df  MS  F  p
校正模型 105.352  6  17.559  144.86  0.007
截距 34 468.398  1  34 468.398  284 366.652  0
B  28.522  2  14.261  117.655 <0.01
C  7.823  2  3.912  32.272 <0.05
D  69.006  2  34.503  284.653 <0.01
A(误差) 0.242  2  0.121
总计 34 573.992  9
校正的总计 105.594  8
  注:F0.01(1,2)=99,F0.05(1,2)=19.
由表3数据分析可知:各因素的影响程度依次为料液比,提取温度,提取时间,乙醇体积分数.乙醇体积
分数对牛尾蒿总黄酮的提取率影响最小,所以将其作为误差进行方差分析,提取温度和料液比各水平间差
异有统计学意义(p<0.01),提取时间各水平间差异有统计学意义(p<0.05).结合直观分析结果,最佳提
取工艺为A1B3C1D3,即乙醇体积分数20%,提取温度90℃,提取时间1.0h,料液比1∶50(g/mL).
2.4 验证试验
取3份0.5g牛尾蒿药材粉末,精密称定,采用上述优化条件进行提取,并计算总黄酮提取率.结果显
示,总黄酮平均提取率为67.88mg/g,RSD=0.58%(n=3),表明该提取工艺稳定可行.
2.5 各样品中总黄酮质量分数测定
牛尾蒿各样品中总黄酮质量分数测定结果如表4所示.由表4可知,牛尾蒿不同植株部位总黄酮质量
971第2期       杨正明,等:藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定
分数差异有统计学意义,以叶中质量分数为最高,可达185.97±2.20mg/g;煅烧成炭后,总黄酮质量分数
明显降低.
表4 各样品中黄酮质量分数测定结果(x±S,n=3)
样品编号 产地(来源) 药材 不同部位 总黄酮质量分数/(mg·g-1)
S1 阿坝州川主寺药泉山庄 牛尾蒿 茎 12.77±0.19
S2 叶 127.16±1.50
S3 地上部分 67.88±0.39
S4 阿坝州藏医院 牛尾蒿 茎 24.79±0.65
S5 叶 185.97±2.20
S6 地上部分 87.10±2.71
S7 阿坝州藏医院 牛尾蒿炭 茎 2.94±0.09
S8 地上部分 10.78±0.37
3 结 论
黄酮类化合物与铝盐络合后会产生特征吸收,本试验采用铝盐络合比色法,方法学考察结果表明该方
法合理、准确.各样品中总黄酮质量分数测定结果表明:叶中总黄酮质量分数较高于茎;牛尾蒿烧炭后,总
黄酮质量分数明显降低,可能是因为高温炭化引起黄酮类物质结构发生变化,破坏了黄酮物质,使总黄酮
的质量分数降低[13,18],藏医临床煅烧前后化学成分的变化有待进一步试验研究,因此,牛尾蒿炭(闷煅)工
艺的科学性和必要性有待进一步综合评价.
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Optimization of the Extraction Technology for Total Flavonoids
from the Tibetan Medicine Artemisia subdigitata Mattf.
and Determination of Their Content
YANG Zheng-ming1, TENG Yun1, WANG Jing-fu1,
LI Bo1, LIU Yuan2
1.School of Chemistry and Environmental Protection Engineering,
 Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;
2.Ethnic Medicine Institute,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China
Abstract:Ultraviolet spectrophotometry was employed to determine the total flavonoids in Artemisia sub-
digitata Mattf.,with rutin as the control.The effects of ethanol concentration(v/v),extraction time,
extraction temperature and ratio of solid to liquid on the extraction rate of total flavonoids were evaluated
in single-factor experiments,and an L9(34)orthogonal test was used to optimize the extraction technology.
The results showed that the optimum extraction conditions were 20%ethanol,extraction temperature 90
℃,extraction time 60min,ratio of solid to liquid 1∶50(g/mL),and the average extraction yield of total
flavonoids was 67.88mg/g under the optimum conditions.The content of total flavoniods showed a large
difference in different plant parts,being the highest in the leaves,and total flavoniods content decreased
significantly after carbonization.This optimized extraction technology proved to be reasonable and feasible
and is,therefore,recommended for use in the extraction of total flavonoids in A.subdigitata.Whether
the process of carbonizing A.subdigitatais necessary and science-based is to be further evaluated.
Key words:Artemisia subdigitata Mattf.;carbonized Artemisia subdigitata Mattf;total flavonoids;or-
thogonal test;extraction technology
责任编辑 周仁惠    
181第2期       杨正明,等:藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定