全 文 ：引起了组织的纤维化 ,研究者也试图从干预该信号途径方面来寻
找治疗组织纤维化 、皮肤创伤愈合及瘢痕形成 [ 12 , 13] 。在保护皮
肤光老化的机制方面 , TanakaH等 [ 14]的研究发现革兰氏阴性厌
氧菌 Zymomonasmobilis的可发酵代谢物通过提高 TGF-β /Smad
信号来改善皮肤成纤维细胞的光老化 , 该代谢物可以抑制 UVB
照射引起的 TβR-IImRNA和蛋白的下降 , 从而恢复Ⅰ型胶原合
成的下降 , 抑制了光老化。虫草多糖对成纤维细胞光老化的保护
或许也可通过影响 TGF-β /Smad信号来实现。
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Res, 2008, 300(Supplement1):57.
收稿日期:2008-03-13;　修订日期:2008-07-20
基金项目:广西高校人才小高地建设创新团队资助计划项目
作者简介:潘小姣(1975-),女(汉族),广西贵港人 ,现任广西中医学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事中药活性成分的筛选 、中药新药的研究与开发工作.
田基黄不同提取物含药血清体外
抗乙肝和抗肝癌作用的实验研究
潘小姣1 , 杨　柯 1 , 曾金强2 , 韦志英 1 , 陈　晨1
(1.广西中医学院 ,广西 南宁　530001;　2.中国人民武装警察部队广西边防总队医院 ,广西 南宁　530022)
摘要:目的 观察田基黄不同提取物的含药血清体外抗乙肝和抗肝癌的作用。方法 采用酶链免疫法 , 观察田基黄不同提
取物的含药血清对 2215细胞分泌 HBeAg和 HBsAg的抑制作用。采用 MTT技术 , 观察田基黄不同提取物的含药血清对
肝癌细胞 BEL-7404增殖的抑制作用。结果 当含药血清浓度为 5%时 , 田基黄乙醇总提取物和正丁醇提取物对 HBeAg
和 HBsAg呈现较好抑制作用 ,抑制率分别为 34.84%和 57.95%,以及 76.02%和 53.15%(P<0.05);当含药血清浓度为
20%时 , 醋酸乙酯提取物对 HBeAg和 HBsAg呈现较好的抑制作用 , 抑制率分别为 79.79%和 57.22%(P<0.05);水提取
物 3种浓度的含药血清对 HBeAg和 HBsAg都有较好的抑制作用 ,抑制率分别达到了 70%和 30%以上(P<0.05)。田基
黄各提取物对肝癌 BEL-7404细胞都有一定的抑制作用 , 该抑制作用呈明显的量效关系 , 当含药血清浓度为 20%时 , 乙
醇总提取物 、醋酸乙酯提取物 、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分别为 29.74%, 53.80%, 40.79%和 54.24%(P<
0.01)。结论 田基黄不同提取物含药血清能抑制 2215细胞分泌 HBeAg和 HBsAg, 并且能抑制肝癌细胞 BEL-7404的增
殖。其抗乙肝的有效成分主要分布在田基黄的水提取物中 ,而抗肝癌的有效成分则均衡分布于各种极性部位。
关键词:田基黄;　2215细胞;　BEL-7404细胞;　血清药理学
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)05-1076-03
ExperimentalStudyonAnti-hepatitisBandAnti-hepatomaEffectofDifferentEx-
tractsinSerumofHypericumjaponicumThunb.inVitro
PANXiao-jiao1 ,YANGKe1 , ZENGJin-qiang2 ,WEIZhi-ying1 , CHENChen1
(1.GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning, Guangxi530001, China;2.GuangxiFrontier
ForcesHospital, Nanning, Guangxi530022, China)
Abstract:ObjectiveToobservetheanti-hepatitisBandanti-hepatomaeffectofdiferentextractsinserumsofHypericumja-
ponicumThunb.invitro.MethodsEnzymelinkedimmuneresponsewasusedtoinvestigatetheeffectofthediferentextractsin
serumsofHypericumjaponicumThunb.onHBeAgandHBsAgexcretedby2215 celinvitro.MTTtechniquewasusedtoinvesti-
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5
gatetheeffectofthediferentextractsinserumsofHypericumjaponicumThunb.onthegrowthofhepatomaBEL-7404 cellin
vitro.ResultsEtOHandBuOHextractsshowedbeterinhibitoryratesonHBeAgandHBsAgas34.84%, 57.95% and76.02%,
53.15%(P<0.05)in5% serumrespectively.EtOAcextractsshowedbetterinhibitoryratesonHBeAgandHBsAgas79.79%
and57.22%(P<0.05)in20% serumrespectively.H2OextractshadstableinhibitoryratesonHBeAgandHBsAginthethreediferentconcentrationofserumandtheinhibitoryrateswerealmorethan70% and30% respectively.Alextractsshowedthe
inhibitoryactivityonthegrowthofhepatomaBEL-7404cellinvitroandtherewasobviousdose-efectrelationship.Theinhibi-
toryratesofEtOH, EtOAc, BuOHandH2Oextractsin20% serumwere29.74%, 53.80%, 40.79% and54.24%, respectively(P<0.01).ConclusionThedifferentextractsofHypericumjaponicumThunb.inserumhavetheinhibitoryefectonHBeAgand
HBsAgexcretedby2215celandonthegrowthofhepatomaBEL-7404celinvitro.Thestableactivecompoundsofanti-Hep-
atitisBmainlydistributeinH2Oextractsandtheactivecompoundsofanti-hepatomaevenlydistributeineachextracts.Keywords:HypericumjaponicumThumb.;　2215Cel;　BEL-7404Cel;　Seropharmacology
　　田基黄原名地耳草 , 始载于《生草药性备要》《植物名实图
考》 ,别名雀舌草 , 系藤黄科金丝桃属植物地耳草 Hypericumja-
ponicumThumb.的干燥全草。 味甘 、微苦 , 性凉 , 归肝 、胆 、大肠
经。具有清热利湿 、散瘀止痛 、消肿解毒的功效 [ 1] 。现已研究发
现田基黄中含有内酯 、香豆素 、酚类 、蒽醌 、黄酮类 、维生素类等化
学成分 [ 1～ 4] 。现代药理研究表明 , 田基黄具有明确的保肝 、抑制
癌细胞药理学功效;临床用于治疗急 、慢性肝炎 , 传染性肝炎 ,原
发性肝癌 , 伤寒 ,副伤寒等。但是直至目前 ,田基黄的抗乙肝和肝
癌有效成分或有效部位仍然不够清晰。 本实验研究旨在阐明田
基黄的抗乙肝和肝癌有效部位 ,为进一步确定其有效化学成分奠
定基础。
1　材料
1.1　药物 田基黄经广西中医学院药用植物教研室韦松基副教
授鉴定为藤黄科金丝桃属植物地耳草 Hypericumjaponicum
Thumb.的干燥全草。
1.2　动物 昆明种小鼠 , 体重 22 ～ 26 g, 雌雄兼用 , 由广西中医
学院实验动物中心提供 ,合格证号:桂医动字第 11004号。
1.3　试剂 EaglesMEM干粉 、RPMI-1640培养基(美国 Gibco
公司产品 , 批号:1041001, 批号:1243098);G418、L-谷氨酰胺
(北科化学试剂公司进口分装);新生牛血清(NBS,杭州四季青公
司 , 批号:060720);卡那霉素 、青霉素 、链霉素(Sigma分装);二甲
基亚砜(DMSO, 上海生物工程有限公司 , 批号:54186);HBsAg,
HBeAg检测试剂盒 (上海荣盛生物科技有限公司 , 批号:
20070605, 20070711);MTT(北 京拜 尔迪生 物公 司分 装 ,
Amresco0793)。
1.4　细胞系及培养液 HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的 2215
细胞(购自中国医学科学院中国医药生物技术研究所):2215细
胞用 MEM培养液培养 , 培养液含 10%胎牛血清 , 0.03%谷氨酰
胺 , G418 380μg· ml-1 ,卡那霉素 50 U· ml-1 , pH7.2。细胞消化
液含 0.25%胰蛋白酶 , 用 D-Hangs配制。
肝癌 BEL-7404细胞(广西民族医院惠赠):肝癌 BEL-
7404细胞用 RPMI-1640培养液培养 , 培养液含 10%胎牛血清 、
青霉素 100 U· ml-1 , 链霉素 100 U· ml-1。 细胞消化液含
0.25%胰蛋白酶 ,用 D-Hangs配制。
1.5　器材 培养瓶(丹麦 Tunclon公司产品);96孔细胞培养板
(美国 Corning公司产品);二氧化碳培养箱(美国 Forma公司);
倒置显微镜(德国 Leica公司);酶标仪(奥地利 Sunrise公司);吉
尔森微量移液器(法国 Pipetman公司);BDX-35BI型座式自动
电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。
2　方法与结果
2.1　田基黄不同提取物的制备 取田基黄 95%乙醇提取干浸膏
37.6 g(每克干浸膏相当于 9.1 g生药), 溶于 300 ml水中 , 用醋
酸乙酯萃取 5次 , 300 ml/次;水层再用正丁醇萃取 5次 , 300 ml/
次。分别合并水层 , 正丁醇层和醋酸乙酯层 , 减压回收溶剂 , 备
用。另取 37.6 g田基黄干浸膏 ,和上述各层提取物 ,分别溶于适
量水中 , 最后定容成 100ml, 4℃保存备用。
2.2　含药血清的制备 [ 5] 取小鼠 40只 , 体重 22 ～ 26 g, 雌雄兼
用。分为 5组:空白血清组(灌胃给予生理盐水), 田基黄乙醇总
提取物血清组 , 田基黄醋酸乙酯提取物血清组 , 田基黄正丁醇提
取物血清组 ,田基黄水提取物血清组。含药血清组按每次 20 ml
· kg-1(68.4 g生药 /kg)剂量灌胃给药 , 每天给药两次(每天的
总给药量约为田基黄半数致死量的 50%), 连续 3 d, 末次给药后
1 h, 摘眼球取血 , 离心分离血清 , 56℃灭活 30 min。分别用不含
血清的 MEM培养液和 RPMI-1640培养液稀释成 40%, 20%和
10%的血清浓度 , 分别过滤 , 4℃保存备用。
2.3　细胞培养
2.3.1　2215细胞培养 在长满 2215细胞培养瓶内用 0.25%胰
酶 , 37℃消化 3 ～ 4 min,加培养液吹散 , 1∶3传代;10 d长满 。消
化后计数 , 配制成 1×105个 /ml的细胞悬液 , 接种于 96孔培养
板 , 每孔 100μl,在 37℃, 5%的 CO2培养箱中培养 24 h, 细胞长成
单层后进行实验 。将含各浓度血清的 MEM培养液加入到 96孔
板中 , 每种血清每浓度平行 3孔 ,每孔 100μl,使含药血清最终浓
度分别为 20%、10%和 5%。同时设无药物细胞对照组和培养液
空白对照组各 3孔。收集第 4天细胞培养上清液 , 在 450 nm波
长处用酶标仪测 OD值。应用 SPSS14.0统计软件进行组间 t检
验 , 并按以下公式计算抑制率。结果见表 1。
抑制百分率(%)=
无血清细胞对照组 OD值均数 -田基黄提取物血清组 OD值均数
无血清细胞对照组 OD值均数 -培养液空白对照组 OD值均数 ×
100%
2.3.2　肝癌 BEL-7404细胞的培养 将培养瓶中的 7404细胞株
用 0.25%胰蛋白酶 、0.2% EDTA消化后 , 加入 RPMI-1640培养
液 , 将细胞配制成 5×104个 /ml的细胞悬液 , 加入 96孔培养板
中 , 每孔 100μl,置于 37℃, 5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁
生长后(约 15 h),每孔分别加入含不同浓度血清的 RPMI-1640
培养液 , 每种血清每浓度平行 6孔 , 每孔 100μl, 使含药血清最终
浓度分别为 20%, 10%和 5%。每个 96孔培养板中设无血清细
胞对照组各 6孔。 继续培养 48 h, 然后加入 0.5%MTT溶液 ,
10μl/孔 ,继续培养 4h。 2000 r· min-1离心 15 min, 弃去上清液;
每孔加入 200μlDMSO,轻振 10min后在 490nm波长处用酶标仪
测 OD值。应用 SPSS14.0统计软件进行组间 t检验 , 并按以下公
式计算抑制率。结果见表 2。
抑制率(%)
=空白血清组 OD值均数 -田基黄提取物血清组 OD值均数空白血清组 OD值均数 ×100%
对 2215细胞分泌 HBeAg和 HBsAg的影响实验结果显示:当
含药血清浓度为 5%时 , 田基黄乙醇总提取物和正丁醇提取物对
HBeAg和 HBsAg呈现较好抑制作用 , 抑制率分别为 34.84%和
57.95%, 以及 76.02%和 53.15%(P<0.05);当含药血清浓度为
20%时 , 醋酸乙酯提取物对 HBeAg和 HBsAg呈现较好的抑制作
用 , 抑制率分别为 79.79%和 57.22%(P<0.05);水提取物 3种
浓度的含药血清对 HBeAg和 HBsAg都有较好的抑制作用 , 抑制
率分别达到了 70%和 30%以上(P<0.05)。提示田基黄中的水
溶性化学成分对 HBeAg和 HBsAg存在较稳定的抑制作用 , 并且
没有明显的量效关系;同时各极性部位单独用药对 HBeAg的抑
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5 时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期
制效果明显优于混合用药的抑制效果。
对肝癌 BEL-7404细胞的影响实验结果显示:田基黄不同
提取物对肝癌 BEL-7404细胞都有较好的抑制作用 , 该抑制作
用呈现明显的量效关系 ,当含药血清浓度为 20%时 ,乙醇总提取
物 、醋酸乙酯提取物 、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分别为
29.74%, 53.80%, 40.79%和 54.24%(P<0.01)。 提示田基黄
抗肝癌的有效成分均衡分布于各种极性部位中 ,而且各极性部位
单独用药的效果要优于混合用药的效果。
表 1　田基黄不同提取物的血清在 2215细胞培养中对乙肝 HBeAg和 HBsAg的抑制作用( x±s)
组别 最终的血清浓度(%)
HBeAg
OD值 抑制率(%)
HBsAg
OD值 抑制率(%)
乙醇浸膏血清 5 0.216±0.026② 34.84 0.397±0.038② 57.95
10 0.249±0.037③ 19.76 0.457±0.065② 48.66
20 0.301±0.039③ 0.00 0.573±0.196③ 30.70
醋酸乙酯层血清 5 0.196±0.014③ 43.74 0.601±0.023③ 26.26
10 0.191±0.015② 46.00 0.468±0.057② 46.90
20 0.117±0.017② 79.79 0.401±0.051② 57.22
正丁醇层血清 5 0.125±0.087② 76.02 0.428±0.022② 53.15
10 0.190±0.012② 46.61 0.546±0.060② 34.88
20 0.175±0.037① 53.39 0.688±0.159③ 12.85
水层血清 5 0.123±0.025② 76.77 0.562±0.015② 32.35
10 0.119±0.033① 78.88 0.524±0.035② 38.29
20 0.135±0.029② 71.34 0.506±0.065② 41.07
空白血清 5 0.284±0.036③ 4.07 0.764±0.036③ 1.08
10 0.286±0.044③ 3.32 0.754±0.012③ 2.63
20 0.306±0.053③ 0.00 0.759±0.035③ 1.81无血清细胞对照 0.293±0.037 0.771±0.062
培养液空白对照 0.072±0.027 0.125±0.033
　　与细胞对照组比较 , ①表示 P<0.01, ②表示 P<0.05, ③表示 P>0.05;n=3
表 2　田基黄不同提取物的血清对肝癌 BEL-7404细胞的抑制作用( x±s)
组别 最终的血清浓度(%)
BEL-7404
OD值 抑制率(%)
乙醇浸膏血清 5 1.445±0.074③ 0
10 1.054±0.066① 23.81
20 0.848±0.108① 29.74
醋酸乙酯层血清 5 1.339±0.080② 6.74
10 0.797±0.096① 42.41
20 0.558±0.089① 53.80
正丁醇层血清 5 1.378±0.042② 4.06
10 0.974±0.137① 29.56
20 0.715±0.073① 40.79
水层血清 5 1.380±0.041③ 3.90
10 0.948±0.083① 31.43
20 0.552±0.048① 54.24
空白血清 5 1.436±0.021
10 1.383±0.021
20 1.207±0.033
无血清细胞对照 1.458±0.122③
1.324±0.076③
1.222±0.026③
　　与空白血清组比较 , ①P<0.01, ②P<0.05, ③P>0.05;n=6
3　讨论
中药血清药理学是指在动物经口服给药后一定时间采血分
离血清 , 用此含药血清进行体外实验的一种实验方法 [ 6] 。这种新
的实验方法可排除在体外实验中各种干扰因素的影响 ,比较接近
药物在体内环境中产生药理效应的真实过程。作者利用血清药
理学方法 , 研究田基黄不同提取物在体外对 2215细胞分泌
HBeAg和 HBsAg的抑制作用和对肝癌 BEL-7404细胞的抑制作
用 ,结果表明田基黄不同提取物含药血清有良好的体外抗乙肝和
抗肝癌作用。其抗乙肝的有效成分主要分布在的水提取物中 , 今
后可以考虑从水层部位筛选出活性更强的抗乙肝单体化合物。
抗肝癌的有效成分均衡分布于各种极性部位 , 并且各极性部位单
独用药对肝癌 BEL-7404细胞的抑制效果明显优于混合用药的
抑制效果 , 今后可以考虑从这几个活性部位中筛选出活性更强的
抗肝癌单体化合物。 实验结果显示空白血清组的 OD值与无血
清细胞对照组的 OD值无显著性差别(P>0.05), 说明血清对实
验没有干扰。至于田基黄是通过何种途径实现其抑制 2215细胞
分泌 HBeAg和 HBsAg,以及抑制肝癌 BEL-7404细胞生长的 , 还
有待于进一步研究;而其具有抑制作用的化学单体有哪些 , 还有
待于进一步筛选。
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