全 文 :收稿日期:2011-07-09
蓝靛果中花色苷含量的测定及其体外抗氧化性
刘奕琳1,王振宇1,2*
(1.东北林业大学 林学院,哈尔滨 150040;2.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院,哈尔滨 150090)
摘 要:蓝靛果是具有丰富的花色苷的一种浆果,经常温用60%乙醇提取蓝靛果粉末后,用pH示差法
对其干物质中的花色苷含量进行测定,测定得蓝靛果干物质中的花色苷含量为12.232mg/g。并测定其
体外抗氧化性,分别对羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率进行测定,用VC
作为阳性对照,可得蓝靛果花色苷具有极强的抗氧化性,可用于保健食品药品等领域。
关键词:蓝靛果;花色苷;pH示差法;抗氧化性
Determination the Anthocyanin Content in Lonicera edulis
by pH-differential Spectrophotometry and the Antioxidance
Liu Yilin1,Wang Zhenyu1
,2
(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040;
2.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090)
Abstract:Lonicera edulis is the berry which possess rich anthocyanins.After extracted anthocyanin from
Lonicera edulis powder in normal temperature by 60%ethanol,the anthocyanin content in dry matter is
determined by pH-differential spectrophotometry.We concluded that the anthocyanin content in Lonicera
edulis diy matter is 12.232mg/g.Determinated the antioxidance of it by the scavenging effects of it on
·OH,O2—·,DPPH and ABTS respectively with VC as the control group.We concluded that the Lon-
cera edulis anthocyanins possess strong antioxidance.Application health care food and drug,etc.
Key words:Lonicera edulis;Anthocyanins;pH-differential spectrophotometry;Antioxidance
花色苷是一类具有苯并吡喃结构的类黄酮化合
物,具有预防心脏病、抗大脑炎症、抗癌、延缓衰老、抗
辐射、清除自由基、抗氧化等多种功效[1-3]。蓝靛果是
一种蓝黑色的浆果,含有丰富的天然绿色无毒的色素,
是天然色素的良好来源。马自超[4]鉴定了蓝靛果色素
中的主要成份是花青定-3-葡萄糖,其他少量成份是花
青定-3,5-双葡萄糖、花青定-3-芸香糖、花青定-3-龙胆
二糖、芍药定-3-葡萄糖。本实验通过pH 示差法[5]测
定蓝靛果干物质中花色苷的含量,并测定其对羟自由
基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除
能力。
1 材料与方法
1.1 实验材料
蓝靛果(Lonicera edulis),采摘于大兴安岭;无水
乙醇;乙酸钠;氯化钾;盐酸;DPPH Sigma公司、ABTS
Sigma公司、无水乙醇、FeSO4、H2O2、水杨酸钠、焦性
没食子酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁。
1.2 实验仪器
电热恒温鼓风干燥箱;粉碎机;电子分析天平;旋
转蒸发仪;离心机;精密pH计;紫外分光光度计。
1.3 实验方法
1.3.1 蓝靛果花色苷的提取
将蓝靛果烘干后用粉碎机粉碎,取10g蓝靛果粉
末,用200mL 60%乙醇溶液在常温下浸提1h,将提取
物在4000r/min离心10min后真空抽滤,滤饼再重复
浸提2次,合并3次上清液,在40℃下真空旋转蒸发浓
缩,定容至250mL得花色苷提取液。取少量花色苷提
取液,稀释至一定体积,进行光谱扫描,确定其测定波
长。
1.3.2 pH示差法的原理及缓冲液的配制
花色苷的颜色随pH值的改变而发生变化,而干
扰物质的特征光谱不随pH 的改变而变化。为了让
pH示差法更准确更灵敏,选择的2个pH处测定的花
色苷的吸光值差异最显著,并且花色苷相当稳定。pH
为1时,花色苷以2-苯基苯并吡喃的形式存在。pH为
4.5时,花色苷以甲醇假碱的形式存在,因此选择pH
为1.0和4.5[6]
pH4.5的缓冲液的制备:准确称取1.64g乙酸钠
用蒸馏水定容100mL,用盐酸调pH(4.5±0.1)。
41
第5期(总第114期) 中 国 林 副 特 产 No.5(GSNO.114)
2011年10月 Forest By-Product and Speciality in China Oct.2011
DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2011.05.029
pH 1的缓冲液的制备:准确称取1.49gKCl用蒸
馏水定容至100mL。准确量取1.7mL盐酸用蒸馏水
定容至100mL,配制成0.2mol/L盐酸溶液,将KCl溶
液与盐酸溶液以25∶67的比例混合。用 KCl溶液调
pH(1.0±0.1)。
1.3.3 平衡时间的确定
因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式,这4
种结构形式在某一pH下处于动态平衡,当pH 改变
时,动态平衡发生转移,总的趋势是pH降低时,平衡
向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动;pH升高时平衡
向蓝色醌式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因
此提取液用缓冲液稀释后,必须先静置一段时间,等动
态平衡处于稳定后,才能测定吸光值。
分别移取2份2mL花色苷提取液,分别用pH1.0
和pH4.5的缓冲溶液定容至50mL,在所选择的测定
波长下测定吸光值,每隔10min测定一次吸光值,直至
稳定。
1.3.4 经验公式的选择
花色苷含量(%,w/w)=(A/εL)×MW×DF×V/
Wt×1000
式中:A-吸光度;ε-矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系
数,26900;DF-稀释因子;MW-矢车菊花素-3-葡萄糖苷的
分子量,449.2;V-最终体积,mL;Wt-产品重量,mg;L-
光程,1cm;A=ApH1.0-ApH4.5。
1.3.5 抗氧化指标的测定
1.3.5.1 羟自由基清除能力的测定。参照徐建国
等[7]采用的水杨酸钠络合法略作改动,测定样品清除
羟自由基的能力。反应体系中依次加入样品液1mL,
浓度为6mmol/L FeSO4 溶液2mL,浓度为6mmol/L
H2O2 溶液2mL,将反应体系混合均匀放置10min,再
加入浓度为6mmol/L水杨酸钠溶液2mL,静置30min
后于510nm波长下用蒸馏水调零,并测定吸光值 A1;
将上述体系中的水杨酸钠溶液用相同体积的蒸馏水代
替,其他操作相同,测定吸光值A2;将上述体系中的样
品溶液用相同体积的蒸馏水代替,其他操作相同,测定
吸光值A0。羟自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/
A0]×100%。
1.3.5.2 超氧自由清除能力的测定。参照郭雪峰[8]
方法略作改动,测定样品清除超氧自由基的能力。反
应体系中依次加入浓度为50mmol/L Tris-HCl溶液
5.7mL,样品溶液0.2mL,浓度为6mmol/L邻苯三酚
溶液0.1mL,将混合物反应4min,滴入2滴 HCl终止
反应,在320nm波长下测定吸光值 A1;将邻苯三酚用
等体积的蒸馏水代替,其他操作相同,测定吸光值 A2;
将样品溶液用等体积的蒸馏水代替,其他操作相同,测
定吸光值 A0。超氧自由基清除率(%)=[1-(A1-
A2)/A0]×100%。
1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的测定。参照Blois
等[9]的方法略作改动,测定样品清除DPPH自由基的
能力。配制0.2mmol/L DPPH乙醇溶液,放在棕色试
剂瓶中于4℃保存,在试管中加入2mL DPPH乙醇溶
液及2mL样品溶液,混合均匀在室温避光放置30min,
于517nm波长下用无水乙醇调零,并测定吸光值 A1;
将DPPH乙醇溶液用等体积的无水乙醇代替,其他操
作相同,测定吸光值 A2;将样品溶液用等体积无水乙
醇溶液代替,其他操作相同,测定吸光值 A0。DPPH
自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。
1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的测定。参照 Wan-
wisa等[10]方法略作改动,测定样品清除 ABTS自由基
的能力。用2.6mmol/mL过硫酸钾溶液溶解 ABTS
甲醇溶液,配制成7.4mmol/mL ABTS储备液,室温避
光静置12~24h后4℃保藏。现用时取1mL储备液用
甲醇稀释54.7倍,在734nm吸光值为0.700±0.020,
甲醇调零。在试管中加入2.850mL ABTS测定液及
0.150mL样品溶液,混合均匀在室温避光放置2h,于
734nm波长下用甲醇调零,并测定吸光值A1;将ABTS
测定液用等体积的蒸馏水代替,其他操作相同,测定吸
光值A2;将样品溶液用等体积甲醇溶液代替,其他操
作相同,测定吸光值 A0。ABTS自由基清除率(%)=
[1-(A1-A2)/A0]×100%。
2 结果与分析
2.1 测定波长的确定
蓝靛果花色苷的提取液经稀释后,经光谱扫描如
图1所示,确定其最大吸收波长为531nm。
波长/nm
图1 光谱扫描曲线
2.2 平衡时间的确定
表1 蓝靛果花色苷在缓冲溶液中的吸光值与时间变化关系
t/min 0 10 20 30 40 50 60 70
pH1.0 1.439 1.476 1.490 1.496 1.499 1.499 1.500 1.500
pH4.5 0.335 0.331 0.330 0.329 0.329 0.328 0.328 0.328
由表1可见,pH1.0缓冲溶液中花色苷的吸光值
随时间的延长而上升,在60min时基本稳定;pH4.5缓
冲溶液中花色苷的吸光值随时间的延长而下降,在
50min时基本稳定。综合考虑,选 择 平 衡 时 间 为
60min。
2.3 蓝靛果干物质中花色苷的含量
由表1中的数据,取平衡时间60min,根据经验公
式计算得花色苷的含量(%,w/w)=(A/εL)×MW×
DF×V/Wt×1000=(1.500-0.328)×0.250×25×
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2011年 刘奕琳等:蓝靛果中花色苷含量的测定及其体外抗氧化性 第5期
449.2×1000/(26900×10×1)=12.232mg/g。
2.4 清除羟自由基的能力
羟基自由基(·OH)是化学性质最活泼的一种自
由基,建立一种Fenton反应产生羟基自由基的方法,
以VC作为阳性对照组,测定其清除率如图2所示。
图2 样品对羟自由基的清楚能力
由图2可以看出,花色苷对羟自由基的清除率随
质量浓度的增加而增大,并呈现明显的量效关系,而且
清除率比VC对照组高,当质量浓度为0.2mg/mL时,
花色苷的清除率为90.35%,VC的清除率为58.31%,
可见蓝靛果花色苷对羟自由基有极强的清除能力。
2.5 清除超氧自由基的能力
超氧阴离子自由基(O2—·)是生物体中产生量最
多的一种氧自由基。由邻苯三酚的方法,以 VC作为
阳性对照组,测定其清除率如图3所示。
图3 样品对超氧自由基的清除能力
由图3可以看出,花色苷对超氧自由基的清除率
随质量浓度的增加而增大,并呈现明显的量效关系,
但清除率比 VC对照组低,当质量浓度为0.2mg/mL
时,花色苷的清除率为87.35%,VC的清除率为
97.53%,可见蓝靛果花色苷对超氧自由基有一定的
清除能力。
2.6 清除DPPH自由基的能力
二苯基苦味肼基自由基(DPPH·)是一种稳定的
以氮为中心的自由基,花色苷等抗氧化剂能与其结合
使溶液颜色变淡,以VC作为阳性对照组,测定其清除
率如图4所示。
由图1可以看出,花色苷对DPPH自由基的清除
率随质量浓度的增加而增大,并呈现明显的量效关系,
但清除率比 VC对照组低,当质量浓度为0.2mg/mL
时,花色苷的清除率为 84.39%,VC 的清除率为
96.74%,可见蓝靛果花色苷对DPPH自由基有较强的
清除能力。
图4 样品对DPPH自由基的清除能力
2.7 清除ABTS自由基的能力
ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]是一种供氢体。该方法作为一种用于体外测定物
质总抗氧化能力的新方法,以VC作为阳性对照组,测
定其清除率如图5所示。
图5 样品对ABTS自由基的清除能力
由图5可以看出,花色苷对 ABTS自由基的清除
率随质量浓度的增加而增大,并呈现明显的量效关系,
而且清除率比 VC对照组高,当质量浓度为10μg/mL
时,花色苷的清除率为 87.98%,VC 的清除率为
60.52%,可见蓝靛果花色苷对ABTS自由基有极强的
清除能力。
3 结论
蓝靛果是具有花色苷的一种浆果,实验用pH 示
差法测定花色苷含量,方法可靠准确,结果显示其花色
苷在干物质中的含量为12.232mg/g,可见其含量丰
富。
蓝靛果花色苷对四种自由基都具有较强的清除能
力,对于羟自由基和 ABTS自由基的清除能力较 VC
阳性对照组强,而对于超氧自由基和DPPH自由基的
清除能力较VC阳性对照组低,实验表明,蓝靛果花色
苷具有较强的抗氧化性,可以作为天然绿色的抗氧化
剂,广泛应用于食品、化妆品、药品等领域,具有很大的
发展前景。
61
2011年 中 国 林 副 特 产 第5期
树莓总多酚及其抗氧化功能研究
王丽1,王振宇1,2*,樊梓鸾1,左丽丽1
(1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院,哈尔滨 150090;2.东北林业大学 林学院,哈尔滨 150040)
摘 要:树莓中含有降低慢性疾病发生的抗氧化活性物质,研究用溶剂法提取悬钩子中生物活性物质,
并测定总多酚及提取物的抗氧化活性。丙酮作为溶剂提取的树莓中总多酚,用福林酚法测定其含量为
708.54mg/100g鲜果。通过测定树莓提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基、超氧阴离子
自由基的能力,评价其抗氧化活性。结果表明提取物具有较强的体外抗氧化能力,这可能与树莓中的多
酚含量有关。因此,悬钩子具有良好的抗氧化活性,可作为一种潜在的用于抗癌活性物质的来源。
关键词:树莓;总多酚;抗氧化
Determination of Polyphenol Content
and in Vitro Antioxidant Activity of Raspberry
Wang Li 1,Wang Zhenyu1
,2,Fan Ziluan1,Zuo Lili 1
(1.School of Food Science and Engineering,Herbin Institute of Technology,Herbin 150090;
2.School of Forestry,Northeast Forestry University,Herbin150040)
Abstract:Raspberry is associated with lower risk of chronic dieases as result of consumption of antioxidant
substances.Raspberry have higher antioxidant capacity,because they are rich of secondary compounds
such as polyphenols.The objective of this work is to evaluate the total phenolic content and antioxidant
activity of Raspberry.Total phenolic content was quantified by Filion-Ciocalteu reagent,and the antioxi-
dant capacity was measured by the ABTS,DPPH,hydroxyl radical,superoxide anion free radical meth-
ods.The results showed that total phenolic content was 708.54mg/100g Raspberry of acetone solvent ex-
traction.And also Raspberries extract exhibited significant antioxidant capacity,it may have relation with
polyphenol content.Thus,raspberries exhibited good antioxidant activity and may serve as a potential
source of materials with anticancer activity.
Key words:Raspberry;Polyphenol;Antioxidat activity
树莓也称悬钩子,悬钩子属是蔷薇科(Rosaceae) 中的一个大属,全世界已知有750余种,
櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐
主要分布在北
参 考 文 献
[1] 李韬,张宏宇,吕玉璋.花色苷类色素的研究进展[J].
农业科技与装备,2010(5):23-26.
[2] 倪勤学,霍艳荣,陆国权.花色苷保健功能的研究进展
[J].安徽农业科学,2010,38(35):20025-20028.
[3] Nozomu Matsunaga,Kazuhiro Tsuruma,etal.Inhibitory
Actions of Bilberry Anthocyanidins on Angiogenesis
[J].Phytother Res,2010,24(1):42-47.
[4] 马自超.蓝靛果中花青素色素的研究[J].中国野生植
物资源,1996(2):1-3.
[5] 孙建霞,张燕,孙志健,等.花色苷的资源分布以及定性
定量分析方法研究进展[J].食品科学,2009,30(5):
263-26.
[6] Lee J,Durst RW,Wrolstad RE.Determination of total
monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices,
beverages,natural colorants,and wines by the pH dif-
ferential method:colaborative study[J].J AOAC Int,
2005,88(5):1269-1278.
[7] 徐建国,胡青平.决明子水提物体外清除自由基活性
的研究[J].食品科学,2006,27(6):73-7.
[8] 郭雪峰,岳永德,汤锋,等.用清除超氧阴离子自由基
法评价竹叶提取物抗氧化能力[J].光谱学与光谱分
析,2008,28(8):1823-1826.
[9] Blois ms.Antioxidant determinations by the use of a
stable free radical[J].Nature,2002,26:1199-1200.
[10] Wanwisa B,Soottawat B,Wonnop V,et al.Antioxi-
dative activity of Mungoong,an extract paste,from
the cephalothorax of white shrimp(Litopenaeus van-
namei)[J].Food Chemistry,2008,106:185-193.
作者简介:刘奕琳,女,硕士研究生,研究方向功能性食
品,E-mail:liuyilin16888@163.com
*通讯作者:王振宇,男,教授,博士生导师,主要从事活
性成分分离合成与调控、新资源开发与利用。E-mail:
wzy219001@yahoo.com.cn
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第5期(总第114期) 中 国 林 副 特 产 No.5(GSNO.114)
2011年10月 Forest By-Product and Speciality in China Oct.2011