全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 403−407 · 403 ·



珍珠梅黄酮纳米粒诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的
内质网应激作用机制
刘荣荣, 张 璇, 肖 斌, 张学武*
(延边大学医学院, 吉林 延吉 133002)
摘要: 本文探讨中药珍珠梅黄酮纳米粒 (5,2,4-trihydroxy-6,7,5-trimethoxy flavone nanoparticle, TTF1-NP)
对裸鼠肝癌移植瘤细胞的凋亡作用及其内质网应激作用机制。建立人肝癌 HepG-2 细胞裸鼠移植瘤模型, 分组
(模型组、TTF1-NP低、中、高剂量组和阿霉素组) 给药, 处死裸鼠计算其抑瘤率; 采用 HE染色观察肿瘤细胞的
形态学变化; 利用 TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡; 采用免疫组织化学法检测 GRP78、p-JNK和 caspase 12的表
达; 利用Western blotting检测 GRP78、p-JNK、caspase 12和 CHOP的表达。结果显示, TTF1-NP给药组 (5、10
和 20 μmol·kg−1) 和阿霉素组对肿瘤细胞均有抑制作用, 其抑瘤率分别为 51.2%、54.2%、61.8% 和 65.9%。与模
型组相比, TTF1-NP 给药组观察到肿瘤细胞凋亡形态学改变; 检测到肿瘤细胞凋亡; 免疫组织化学结果显示
GRP78、p-JNK和 caspase 12的表达均有上升, 与Western blotting结果相一致。结果表明: TTF1-NP可以诱导裸
鼠肝癌移植瘤细胞凋亡, 内质网应激途径是其主要作用机制之一。
关键词: 珍珠梅; 内质网应激; 细胞凋亡
中图分类号: R965 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2016) 03-0403-05
Mechanism of TTF1-NP induced implanted hepatoma tumor
apoptosis in nude mice by endoplasmic reticulum stress pathway
LIU Rong-rong, ZHANG Xuan, XIAO Bin, ZHANG Xue-wu*
(Yanbian University Medical College, Yanji 133002, China)

Abstract: This study was designed to investigate the effect of 5,2,4-trihydroxy-6,7,5-trimethoxy flavone
nanoparticle (TTF1-NP) on inducing apoptosis of implanted tumour cells in nude mice and the mechanism of
endoplasmic reticulum stress pathway. The implanted hepatoma model was established in nude mice, and used
to test the drug TTF1-NP in five groups (vehicle, 5 μmol·kg−1 TTF1-NP, 10 μmol·kg−1 TTF1-NP, 20 μmol·kg−1
TTF1-NP and adriamycin). The nude mice were killed after the treatment to determine the tumor growth
inhibition rate (IR). Morphological changes of implanted tumor cells were observed by HE staining; apoptosis
of tumor cells was detected by TUNEL; the protein expression of GRP78, p-JNK and caspase 12 were analyzed
using immunocytochemistry staining and Western blotting. We tested the effects of TTF1-NP on implanted
HepG-2 cell tumor growth in nude mice. TTF1-NP-treated mice showed volume of tumor smaller than that of
the vehicle-treated mice. The tumor mass of the TTF1-NP-treated mice were significantly reduced than those of
the vehicle-treated mice. In addition, the tumor growth rate of the TTF1-NP-treated mice was significantly
lower than that of the vehicle-treated mice, and the tumor growth inhibition ratio of the TTF1-NP-treated
mice was significantly higher than that of the vehicle-treated mice. TTF1-NP exhibited an inhibitory effect

收稿日期: 2015-10-12; 修回日期: 2015-10-29.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81260655).
*通讯作者 Tel: 86-433-2435102, Fax: 86-433-2435104, E-mail: zhangxuewu@ybu.edu.cn
DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0921
· 404 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 403−407

on implanted tumor cells in the model. The IR was 51.2%, 54.2%, 61.8% and 65.9%, respectively. In
comparison with the vehicle group, the treated groups exhibited alteration in cell morphology and apoptosis of
tumor cells, and expression of GRP78, p-JNK and caspase 12, which were observed by immunocytochemistry
staining and Western blotting. Taken together, our results suggest that TTF1-NP induces apoptosis of implanted
tumor cells in nude mice and the main mechanism is related to activation of endoplasmic reticulum stress.
Key words: Sorbaria sorbifolia; endoplasmic reticulum stress; apoptosis

肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一, 我国是肝
癌发病率和死亡率极高的国家, 发病人数和死亡人
数约占全球的 50%[1]。目前, 外科手术是治疗肝癌的
首选方案, 但是大部分肝癌患者在确诊时已错过手
术的最佳时期, 只能依赖于化学药物的治疗, 但是肝
癌对于化疗不敏感, 大部分化学药物并不能使患者
的生存质量得到提高[2]。目前在抗癌领域的研究中,
天然产物取得了显著的成就, 临床使用的抗癌药物
中60% 以上来源于天然产物, 已成为抗癌新药开发的
重要途径之一[3, 4]。因此, 为了满足癌症患者的需求,
亟需从天然产物中开发新的药物[5]。
中药珍珠梅 (Sorbaria sorbifolia) 属蔷薇科植物,
广泛分布于云南、贵州、湖北、甘肃、宁夏、四川及
东北。民间常利用其活血化瘀、消肿止痛等功效治
疗骨折、跌打损伤等, 并被《抗癌中药大辞典》收录
为长白山抗癌药。珍珠梅抗癌的主要成分为 5,2,4-
三羟基-6,7,5-三甲氧基黄酮 (5,2,4-trihydroxy-6,7,5-
trimethoxy flavone, TTF1)。前期研究发现 TTF1能够
抑制小鼠 S180 肉瘤及人肝癌 HepG-2 细胞的生长[6],
通过线粒体途径诱导细胞凋亡及抑制肿瘤血管生
成[7, 8]。但 TTF1溶解性较差, 为了促进 TTF1在体内
的吸收, 本研究以硬脂酸为载体, 采用乳化低温固化
法制备生物体可降解吸收的 5,2,4-三羟基-6,7,5-三甲
氧基黄酮纳米粒 (5,2,4-trihydroxy-6,7,5-trimethoxy
flavone nanoparticle, TTF1-NP), 大大提高了药物溶
解性及利用效率[9]。内质网应激是细胞凋亡的一条新
途径, 不同于线粒体和死亡受体两条经典途径[10]。本
研究利用人肝癌 HepG-2 细胞建立裸鼠移植瘤模型,
探讨 TTF1-NP 诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的内质
网应激作用机制, 为临床肝癌治疗提供理论基础。

材料与方法
药品及试剂 小牛血清、青链霉素、DMEM 培
养液 (Gibco公司); GRP78、p-JNK、Caspase 12、CHOP
抗体 (Cell Signaling Technology公司); 羊抗兔 LgG、
羊抗小鼠 LgG (Sigma公司); TUNEL原位细胞凋亡检
测试剂盒 (南京凯基试剂公司); 苏木素、伊红、柠檬
酸钠抗原修复液、胎牛血清封闭液、3% H2O2 (南京
碧云天生物公司); TTF1-NP 由延边大学药学院关丽
萍教授惠赠。
动物与瘤株 BALB/c 裸鼠, 由上海斯莱克实验
动物有限责任公司提供 , 实验动物生产许可证 :
SCXK (沪) 2007-0005; 合格证编号: 2007000543734;
实验动物使用许可证: SYXK (苏) 2012-0047。裸鼠全
部为雄性, 日龄 28～35天, 体重 18～22 g。收集培养
的 HepG-2 细胞, 计数, 调整细胞悬液浓度为每毫升
1×107个, 以每只 0.1 mL接种于裸鼠右侧腋窝皮下。
分组与给药 用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径,
待移植瘤生长至 50～100 mm3 时将动物随机分成模
型组 (对照组, 生理盐水)、TTF1-NP 低剂量组 (5
μmol·kg−1)、中剂量组 (10 μmol·kg−1)、高剂量 (20
μmol·kg−1) 和阿霉素组 (ADM, 2 mg·kg−1), 每组 8只。
各组裸鼠尾静脉注射给药, 每天 1次, 连续 10天。
体内抑瘤率 用游标卡尺测量移植瘤直径, 隔天
测量肿瘤体积和动物体重, 动态观察 TTF1-NP的抗肿
瘤效应, 给药 10天后处死裸鼠, 手术剥取瘤块称重。
肿瘤体积 (tumor volume, TV) 计算公式为 : TV =
1/2×a×b2, 其中 a、b分别表示长和宽。抗肿瘤活性评
价指标: 肿瘤生长抑制率(inhibition rate, IR), 计算公
式如下: IR (%) = (1 − 给药组平均瘤重 / 模型组平均瘤
重) × 100%。
瘤体形态学观察 取出浸泡在 10% 福尔马林溶
液中的裸鼠移植瘤, 选取肿瘤边缘部位, 采用常规方
法制备蜡块, 冷却后制成 5 μm 连续切片, 脱蜡, 水
合, 进行 HE染色, 光学显微镜观察并拍照。
TUNEL 原位细胞凋亡检测 取蜡块制成 5 μm
连续切片, 进行脱蜡, 水合, 按照 TUNEL 检测试剂
盒说明书进行操作。显微镜下观察染色深浅, 染好后
立即中止, 自来水冲洗 15 min, 用蒸馏水终止显色反
应, 复染, 封片, 光学显微镜观察拍照并计算出细胞
凋亡指数 (apoptosis index, AI), 计算公式如下: AI
(%) = (凋亡细胞数/细胞总数)×100%。
免疫组织化学检测 取蜡块制成5 μm连续切片,
60.℃烤片 1 h, 二甲苯脱蜡透明, 梯度酒精脱水, 3%
刘荣荣等: 珍珠梅黄酮纳米粒诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的内质网应激作用机制 · 405 ·

H2O2处理 5 min, 柠檬酸钠抗原修复液修复 15 min、
96 ℃左右, 待其冷却, 5% 封闭液封闭 30 min, GRP78
(1∶150)、p-JNK (1∶100)、caspase 12 (1∶100) 一抗
4 ℃孵育过夜, PBS 洗载玻片后, 相应二抗 (1∶150)
室温孵育 2 h, 显色 (二氨基联苯胺, DAB), 显微镜下
观察阳性区域, 染好后立即中止, 用自来水轻柔冲洗
15 min, 用蒸馏水终止显色反应, 苏木素染色 3 min,
梯度酒精处理, 二甲苯 20 min, 中性树胶封片, 光学
显微镜观察并拍照。
Western blotting检测 提取裸鼠移植瘤组织总
蛋白, 考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 将蛋白与 5× 上样
缓冲液混匀 (4∶1) 后在电磁炉上加热沸腾 5 min, 取
30 μg上样, 浓缩胶 (80 V、1 h)、分离胶 (100 V、2 h)
使蛋白分离, 切胶, 转膜 p-JNK、β-actin、caspase 12
(100 V、60 min), CHOP (100 V、30 min), GRP78
(100 V、75 min), 5% 牛奶室温封闭 1 h, 一抗 (1∶
1 000、4 ℃孵育过夜), TBST洗膜后二抗 (1∶5 000) 室
温 2 h, ECL显影液孵育 5 min, 显影并拍照。
数据处理 所有数据均采用 x ± s 表示, 采用单
因素方差分析统计, P < 0.05 有显著性统计意义, P <
0.01有极显著性统计意义。

结果
1 TTF1-NP对裸鼠肝癌移植瘤细胞的抑制作用
对照组裸鼠体重和肿瘤体积增长较快, 5、10、20
μmol·kg−1 TTF1-NP 给药组和 ADM 组对裸鼠移植瘤
细胞均有抑制作用, IR分别为 51.2%、54.2%、61.8% 和
65.9% (P < 0.01), 结果见图 1。
2 TTF1-NP对肝癌细胞形态学改变的影响
光镜下观察, 对照组裸鼠移植瘤细胞完整, 细胞
核规则, 细胞数目较多。随着给药剂量增加, 肿瘤细
胞数逐渐减少, 形态改变, 细胞核固缩、碎裂, 伴有
炎症细胞浸润 (图 2)。


Figure 2 Morphological changes of apoptosis by HE staining
(200×). a: Vehicle; b: 5 μmol·kg−1; c: 10 μmol·kg−1; d: 20
μmol·kg−1 TTF1-NP; e: ADM

3 TTF1-NP对裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的影响
TUNEL原位细胞凋亡检测结果显示: 对照组小鼠
中大部分细胞呈蓝紫色, 阳性细胞极少见, 给药组和
ADM组可见明显的棕色阳性区域, 其中 20 μmol·kg−1
TTF1-NP组阳性表达超过 ADM组, AI高达 24%。由
此可见 TTF1-NP 能够诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞的凋
亡, 结果见图 3。
4 免疫组织化学检测 GRP78、caspase 12和 p-JNK
的表达
与模型组相比 , TTF1-NP 给药组中 GRP78、
caspase 12和 p-JNK蛋白表达阳性区域增大, 检测到
明显的棕色颗粒, 表明加强内质网应激反应可以促
进裸鼠肝癌移植瘤细胞的凋亡, 结果见图 4。


Figure 1 Effects of 5,2,4-trihydroxy-6,7,5-trimethoxy flavone nanoparticle (TTF1-NP, 5, 10 and 20 μmol·kg−1) on implanted HepG-2
cell tumor growth in nude mice. A: Implanted tumor in nude mice; B: Weight of tumor; C: Weight of mice; D: Volume of tumor.
ADM: Adriamycin, 2 mg·kg−1. n = 8, x ± s
· 406 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (3): 403−407



Figure 3 TTF1-NP promoted implanted tumor cell apoptosis
in nude mice. A: Representative images of TUNEL staining.
a: Vehicle; b: 5 μmol·kg−1; c: 10 μmol·kg−1; d: 20 μmol·kg−1
TTF1-NP; e: ADM. B: Apoptotic index of implanted tumor cell

5 Western blotting检测 GRP78、p-JNK、caspase 12
和 CHOP的表达
TTF1-NP给药组 GRP78、p-JNK、caspase 12和
CHOP的表达较对照组均有升高, 表明裸鼠肝癌移植
瘤细胞的凋亡可能与内质网应激途径中关键蛋白活
化表达有关 (图 5)。

讨论
在 75 ℃下硬脂酸处于液态。由于 TTF1 在水中
的溶解度小, 因此药物存在于硬脂酸所形成的乳滴
中, 形成药物的硬脂酸溶液。将体系分散于冰水浴中,
初乳的温度急剧下降, 微乳凝固成固态硬脂酸纳米
粒, 药物被包封在硬脂酸纳米粒中。前期研究结果显
示: 采用低温超速离心法分离纳米粒与游离药物, 分
别测定 3个批号 TTF1黄酮固体脂质纳米粒的包封率
为 64.6%、64.5% 及 64.7%[9]。TTF1固体脂质纳米粒
体外释药先快后慢, 绝大多数药物包封于可生物降
解材料骨架内[9]。本研究, 采用乳化低温固化法制备
生物体可降解吸收的 TTF1-NP, 大大提高了药物溶解

Figure 4 Expression of GRP78 (A), caspase 12 (B), p-JNK (C)
by immunocytochemistry staining in different groups (200×).
a: Vehicle; b: 5 μmol·kg−1; c: 10 μmol·kg−1; d: 20 μmol·kg−1
TTF1-NP; e: ADM
性及利用效率, 为 TTF1-NP 诱导裸鼠肝癌移植瘤细
胞凋亡的作用机制研究提供了药物基础。
前期研究发现, 在体外实验中, TTF1-NP能够通
过内质网应激途径诱导人肝癌HepG-2细胞的凋亡[11]。
珍珠梅作为一种中药抗癌药, 目前尚未报道 TTF1-NP
对裸鼠肝癌移植瘤细胞有作用 , 本实验以人肝癌
HepG-2细胞建立裸鼠移植瘤模型, 研究其诱导裸鼠移
植瘤细胞凋亡的作用并探讨其内质网应激作用机制。
裸鼠瘤重和抑瘤率是衡量药物抗肿瘤效果最直接
的指标[12], 本实验构建裸鼠肝癌移植瘤模型。结果显
示, 给药组裸鼠瘤重明显下降, 并且呈现量效关系, 3
次重复实验的抑制率均在 50%以上, 显示出 TTF1-NP
具有稳定的抗肿瘤作用。
TTF1-NP 诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的形态
学检测, HE染色结果显示, TTF1-NP可以引起裸鼠移
植瘤细胞的细胞核固缩, TUNEL 检测更形象直观地
反映了 TTF1-NP可以诱导裸鼠移植瘤细胞的凋亡。
内质网应激是真核细胞的一种自我保护机制 ,
在各种条件刺激下, 细胞通过一系列信号途径对其
应答, 包括增强蛋白折叠、加速蛋白降解等, 以减轻
或中止内质网应激[13]。但是当内质网应激强度过强
或内质网应激持续时间过长时则会造成细胞损伤[14],


Figure 5 Effect of TTF1-NP on key protein in implanted tumor cell in nude mice. A: The protein expressions were detected by
Western blotting; B: Relative protein level. a: Vehicle; b: 5 μmol·kg−1; c: 10 μmol·kg−1; d: 20 μmol·kg−1 TTF1-NP; e: ADM. n = 8,
x ± s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle group
刘荣荣等: 珍珠梅黄酮纳米粒诱导裸鼠肝癌移植瘤细胞凋亡的内质网应激作用机制 · 407 ·

主要通过激活内质网应激的 CHOP 通路、caspase 通
路和 JNK 通路诱导细胞凋亡。内质网应激关键蛋白
GRP78与 IRE1、PERK、ATF6的解离活化是内质网
应激发生发展的必要条件。随着内质网腔内 Ca2+水平
持续升高会引起钙蛋白酶活化, 激活 caspase 12, 该
分子是半胱天冬氨酸家族中唯一定位于内质网的分
子, 仅在内质网应激通路中被活化, 而在线粒体或死
亡受体途径中不被激活[15]。Caspase 12从无活性酶原
的形式发生重组, 切割并激活 caspase 9酶原, 继而启
动 caspase 家族经典凋亡途径, 最终导致细胞凋亡。
大量积累的 IRE1、PERK、ATF6的活化可导致 CHOP
表达增加, CHOP的主要作用是在未折叠蛋白反应过
程中通过编码蛋白质促进细胞凋亡。CHOP可能通过
降低 Bcl-2的表达和耗竭谷胱甘肽下调细胞的抗凋亡
能力, Bcl-2 可调节内质网的 Ca2+ 稳态, 诱导细胞凋
亡[16]。活化的 IRE1 募集 TRAF2 并与 ASK1 结合形
成 IRE1-TRAF2-ASK1复合物, 激活 JNK[17]。活化后
的 JNK 可从细胞质转移到细胞核中, 通过磷酸化激
活 c-jun、c-Fos等转录因子, 而调节下游凋亡相关靶
基因的表达。活化的 JNK也可以留在细胞质中, 通过
磷酸化直接调节 Bcl-2家族成员的活性而介导细胞凋
亡的发生。本研究运用免疫组织化学技术和Western
blotting技术检测 GRP78等一系列蛋白的表达, 结果
显示, TTF1-NP可以激活内质网应激途径中蛋白的表
达从而诱导细胞发生凋亡, 免疫组织化学检测结果
与Western blotting检测结果一致。
综上所述, TTF1-NP对裸鼠移植瘤具有一定的抑
制作用, 能够诱导肿瘤细胞凋亡, 内质网应激反应可
能是其诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一, 具体分子作
用机制尚待进一步研究。由此可见, TTF1-NP具有一
定的抗肿瘤药用价值, 值得进一步研究。
References
[1] EI-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma:
epidemiology and molecular carcinogenesis [J]. Gastroen-
terology, 2007, 132: 2557−2576.
[2] Thomas M. Molecular targeted therapy for hepatocellular
carcinoma [J]. J Gastroenterol, 2009, 44 suppl 19: 136−141.
[3] Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new
drugs over the 30 years from 1981 to 2010 [J]. J Nat Prod,
2012, 75: 311−335.
[4] Butler MS. Natural products to drugs: natural product derived
compounds in clinical trials [J]. Nat Prod Rep, 2008, 25:
475−516.
[5] Guo M, Wu ZL, Wang CG, et al. Synthesis and anti-tumor
activity of baicalin-metal complex [J]. Acta Pharm Sin (药学
学报), 2014, 49: 337−345.
[6] Zhang XW, Cui CX, Chen LY. Inhibition of Sorbaria
sorbifolia on proliferarion of hepatoma HepG-2 cell line [J].
J Chin Med Mater (中药材), 2007, 30: 681−684.
[7] Li Y, Bian L, Zhang XW, et al. TTF1-induced apoptosis of
HepG-2 cells through a mitochondrial pathway [J]. Oncol
Rep, 2011, 26: 651−657.
[8] Liu C, Li XW, Zhang XW, et al. Inhibition of tumor
angiogenesis by TTF1 from extract of herbal medicine [J].
World J Gastroenterol, 2011, 17: 4875−4882.
[9] Li Y, Cui FD, Zhang XW. Preparation of flavonoids-loaded
solid lipid nanoparticles from Sorbaria sorbifolia [J]. Lishizhen
Med Mater Med Res (时珍国医国药), 2012, 23: 2549−2550.
[10] Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al. Caspase-12 me-
diates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxic-
ity by amyliod-beta [J]. Nature, 2000, 403: 98−110.
[11] Xiao B, Liu BT, Zhang XW. TTF1-NP induces human
hepatoma cell apoptosis through ERS-mediatedand pathway
[J]. J Jilin Univ Med (吉林大学学报 医学版), 2015, 41:
1118−1123.
[12] Wang DY, Zhang HQ, Li X, et al. Apoptosis induced by
the C21 sterols in Baishouwu and its mechanism of action in
hepatoma [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2007, 42: 366−
370.
[13] Meng C, Yuan CH, Zhang CC, et al. Ophiopogonin D
protects cardiomyocytes against doxorubicin-induced injury
through suppressing endoplasmic reticulum stress [J]. Acta
Pharm Sin (药学学报), 2014, 49: 1117−1123.
[14] Arensdorf AM, Diedrichs D, Rutkowski DT. Regulation of
the transcriptome by ER stress: non-canonical mechanisms and
physiological consequences [J]. Front Genet, 2013, 4: 256−
257.
[15] Chen YH, Wu XD, Yao ST, et al. Calcineurin is involved
in cardioprotection induced by ischemic postconditioning
through attenuatuing endoplasmic reticulum stress [J]. Chin
Med J, 2011, 124: 3334−3340.
[16] Iqbal J, Meyer PN, Smith LM, et al. BCL2 predicts survival
in germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma-
treated with CHOP-like therapy and rituximab [J]. Clin
Cancer Res, 2011, 17: 7785−7795.
[17] Lu SJ, Yang ZT, Sun L, et al. Conservation of IRE1-
regulated bZIP74 mRNA unconventional splicing in rice
(Oryza sativa L.) involved in ER stress responses [J]. Mol
Plant, 2012, 5: 504−514.