全 文 ：收稿日期:2009-05-16;　修订日期:2009-09-15
基金项目:湖北省自然科学基金(No.2006ABA200)
作者简介:陈　涛(1962-),男(汉族),上海人 ,现任三峡大学医学院教授 ,
主要从事中医药抗恶性肿瘤的研究工作.
珠子参多糖抗肝癌作用的实验研究
陈　涛 1 ,陈茂华 2 ,胡月琴1 ,巩仔鹏 1
(1.三峡大学医学院 ,湖北 宜昌　443002;　2.湖北省宜昌市中医医院　443000)
摘要:目的 观察珠子参多糖(PanaxjaplcusvarPolysaccharide, PJPS)对小鼠 H22肝癌移植瘤生长的抑制效应及其机制。
方法 分别建立 BALB/c小鼠 H22肝癌移植实体瘤模型及腹水瘤模型 , 将小鼠随机分为 3组 ,即生理盐水组(阴性对照)、5
-氟尿嘧啶组(阳性对照)、珠子参多糖组。给药结束后比较各用药组的抑瘤率 、胸腺指数 、脾指数 、肿瘤组织细胞形态结
构 ,肿瘤细胞超微结构 、肿瘤细胞凋亡率 、CD4 +/CD8 +值 、外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率。结果 珠
子参多糖组的胸腺指数 、脾指数 、CD4+/CD8 +值 ,外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率均高于 5-氟尿嘧
啶组 ,珠子参多糖组的抑瘤率及肿瘤细胞凋亡率低于 5-氟尿嘧啶组 , 珠子参多糖组的部分肿瘤细胞有坏死现象及凋亡
学形态变化。结论 珠子参多糖对 H22肝癌小鼠具有抑制肿瘤生长 、延长生命的作用。提高机体细胞免疫功能 , 干扰肿瘤
细胞周期 ,降低 VEGF的表达可能是珠子参多糖发挥抗肝癌效应的机制。
关键词:珠子参;　多糖;　肝癌;　肿瘤抑制
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)06-1329-03
ExperimentReaserchonAntitumorEffectofPanaxJaplcusVarPolysaccharideonEx-
perimentalLiverCancerinMice
CHENTao1 ,CHENMao-hua2 ,HUYue-qin1 ,GONGZi-peng1
(1.MedicalColege, ThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China;2.YichangChineseMedicineHospital,
Yichang443000, China)
Abstract:ObjectiveToobservetheanti-tumoractivityofPanaxjaplcusvarPolysaccharide(PJPS)ontransplantedtumorH22inmiceanditsmechanism.MethodsH22 transplantedsolidhepatocarcinomamodelandtheasciteshepatocarcinomamodelwereestablished.TheBALB/cmicewererandomlydividedinto3 groups:normalsalinegroup(negativecontrolgroup), 5-fluorouracil
group(positivecontrolgroup), andPJPSgroup.Afteradministration, theinhibitoryrateoftumor, thethymusindex, thespleenin-
dex, tumorcellmorphology, andultrastructure, therateofapoptosisoftumorcel, CD4+/CD8 +ratio, levelofVEGFandtherateof
lifeextensionweredetermined.ResultsThethymusindex, spleenindex, CD4+/CD8 +ratio, levelofVEGFandtherateoflifeex-tensioninPJPSgroupwerehigherthanthoseof5-FUgroup, buttheinhibitingrateoftumorandtheapoptosisrateoftumorcell
werelowerthanthoseof5-FUgroup.ThetumorcellsofPJPSgrouppartlydied.ThetumorcelnucleusofPJPSgroupconcen-
trated, andtumorcelsgotsmaller.ConclusionPJPScaninhibitthegrowthofhepatomacarcinomacelsofH22 tumor-bearingmice.Improvingthecelularimmunefunction, interferingwithtumorcellcycleandreducingtheexpressionofVEGFmaybethe
mechamismsofantitumorefect.
Keywords:Panaxjaplcusvar;　Polysaccharide;　Livercancer;　Tumorsuppressor
　　珠子参 Panaxjaplcusvar, major又名扣子七 , 属五加科人参属
植物 ,主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区。其根茎为药材珠
子参 ,具有活血散瘀 , 补血止血 ,消肿止痛之功。我们在早期的研
究中发现珠子参水煎液有较好的抗肝癌作用 [ 1, 2] ,但珠子参多糖
的抗肝癌作用尚未有相关报告。而目前对多糖的诸多研究表明
其有很好的抗肿瘤活性 [ 3 ～ 7] 。本课题拟研究珠子参多糖治疗肝
癌的作用机制 ,从而为开辟抗肝癌新药提供新的线索。
1　材料
1.1　动物及瘤株 雄性 BALB/c纯系小鼠 , 清洁级 , 6 ～ 8周龄 , 体
质量(20±2)g,共 80只 , 由湖北省实验动物中心提供 , 动物合格
证号为:SCXK(鄂)2003-0005。小鼠肝癌 H22瘤株(H22细胞)由
三峡大学医学院免疫教研室提供。
1.2　药品及试剂 珠子参:购于宜昌市沿江中药房 , 经宜昌市药
检所鉴定 , 产地:神农架 ,批号:200703;5 -氟尿嘧啶(5 -FU)针
剂:上海旭东海普药业有限公司 , 批号:20070123, 灭菌生理盐水
稀释至一定浓度 ,避光常温保存;MouseVEGFELISAKit:上海船
夫生物科技有限公司;小鼠 CD3 -FITC/CD4 -PE、CD3 -FITC/CD8 -PE:苏州生物基因有限公司;RPMI-1640培养液:Gibco公
司 ,批号:1342878。
2　方法
2.1　药物及试剂制备
2.1.1　珠子参多糖 水提醇沉法提取珠子参粗多糖 ,经活性炭脱
色 、链霉蛋白酶 -Sevag法除蛋白 、透析袋去除小分子杂质后得到
珠子参精制糖。
2.1.2　5-FU 在超净工作台避光条件下 , 无菌生理盐水稀释 5
-FU针剂至一定浓度后分装于 EP管并用锡纸遮盖保存于 4 ℃
冰箱。
2.2　动物模型的制作 将浓度为 5.0×106 个 /ml的肝癌细胞悬
液注射至健康 BALB/c小鼠右腋皮下 , 每只 0.2 ml,建立实体瘤
模型;按上法小鼠腹腔内接种 H22细胞悬液建立腹水瘤模型。
2.3　动物分组及给药 造模后随机分组 , 每组 10只小鼠。 从第
2天起分组给药:生理盐水组(normalsaline, NS)(阴性对照):灌
胃 0.2ml生理盐水 +腹腔注射 0.2ml生理盐水 , 1次 /d, 连续给
药 11 d;5-氟尿嘧啶组(5-fluorouracil, 5-FU)(阳性对照):腹
腔注射 0.2ml5-FU+灌胃 0.2 ml生理盐水 ,剂量为 25 mg/kg
体重 ,隔日 1次 , 共 6次。间隔期间以生理盐水替代 5-FU腹腔
注射;珠子参多糖组(panaxjaplcusvarpolysaccharide, PJPS):灌胃
·1329·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.6 时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期
0.2 ml珠子参多糖 +腹腔注射 0.2 ml生理盐水 , 1次 /d。剂量为
50 mg/kg体质量 , 连续给药 11 d。
2.4　指标测定
2.4.1　抑瘤率 给药结束后实体瘤模型眼球取血处死小鼠 , 计算
公式如下:
抑瘤率(%)=(1 -实验组肿瘤质量模型组肿瘤质量)×100%
2.4.2　胸腺指数及脾指数 无菌条件下剥离小鼠胸腺及脾脏 , 称
重。按下列公式计算胸腺指数及脾指数:
胸腺指数 =胸腺重量(mg)小鼠重量(g)
脾指数 =脾重量(mg)小鼠重量(g)
2.4.3　观察肿瘤组织细胞形态结构的变化 取各组小鼠肿瘤组
织 , 10 %甲醛固定 , 常规脱水 , 石蜡包埋 , 切片 , HE染色 , 光镜下
观察肿瘤生长 、坏死及对周围组织的浸润等情况。
2.4.4　观察肿瘤细胞超微结果的变化 经取材 、固定 、脱水 、浸
透 、包埋和切片染色后用于透射电子显微镜观察。
2.4.5　肿瘤细胞周期分析 利用 PI标记的方法 , 通过流式细胞
仪对细胞内 DNA的相对含量进行测定 , 分析细胞周期各时相的
百分比及凋亡细胞所占比例。
2.4.6　T细胞亚群的检测 利用流式细胞仪检测小鼠脾脏中
CD3 +, CD3 +CD4 +, CD3 +CD8 +T细胞亚群数量。
2.4.7　荷瘤小鼠血清中 VEGF含量测定 小鼠眼球取血 ,用干净
试管收集血液 ,室温凝固 2 h, 离心 2 000 ×g15 min, 收集血清。
ELISA检测血清中 VEGF含量。
2.4.8　观察对小鼠生存时间的影响 从第 13天起停止给药 , 记
录小鼠存活天数。给药后生存时间不足 5 d的予以排除。按下
列公式计算生命延长率:
生命延长率(ILS)=
用药组平均生存天数 -阴性对照组平均生存天数
阴性对照组平均生存天数 ×100%
2.5　实验数据统计 采用 x±s表示 , 多组之间比较采用单因素
方差分析 ,组间两两比较采用独立样本 t检验 , 统计数据采用
SPSS10.0处理。
3　结果
3.1　各组小鼠肿瘤生长情况的比较 小鼠接种 7 d后各组可触
及右腋皮下肿块 ,阴性对照组小鼠肿瘤生长迅速 ,局部肿胀 , 有明
显触摸感 ,用药组肿瘤生长相对迟缓 。用药组抑瘤率检测结果见
表 1。
表 1　珠子参多糖对 H
22
实体瘤小鼠瘤重的影响( x±s)
组 别 剂量 C/mg· kg-1 肿瘤重量 m/g 抑瘤率(%)
NS - 1.427 9±0.143 7 -
5-FU 25 0.433 6±0.057 6＊＊ 69.63
PJPS 50 0.936 2±0.096 5＊＊ 34.44
　　与 NS组比较 , ＊＊P<0.01;n=10
3.2　对小鼠免疫器官的影响 各用药组的胸腺指数及脾指数见
表 2。
表 2　珠子参多糖对 H22实体瘤小鼠胸腺及脾指数影响( x±s)
mg· g-1
组别 剂量 胸腺指数 脾指数
NS - 3.199 6±0.155 1 8.082 6±1.090 2
5-FU 25 2.708 8±0.170 2＊＊ 6.292 5±0.938 6＊
PJPS 50 3.486 5±0.282 0＊■■ 10.221 6±1.319 1＊■■
　　与 NS组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与 5 -FU组比较 , ■■P<
0.01;n=10
3.3　光镜观察肿瘤细胞形态结构的变化 光镜下阴性对照组肿
瘤细胞的形态结构见图 1,珠子参多糖组的肿瘤细胞形态结构见
图 2。
3.4　肿瘤细胞超微形态观察 电镜下阴性对照组的肿瘤细胞超
微形态结构见图 3,珠子参多糖组肿瘤细胞超微形态结构见图 4,
5-FU组肿瘤细胞超微结构见图 5。
图 1　阴性对照组肝癌细胞　　　　图 2　珠子参多糖组肝癌细胞
HE染色(200×)　　　　HE染色(200×)
　　图 3　阴性对照组　　　　　　　　图 4　珠子参多糖组肝癌
　　肝癌细胞(6 000×)　　　　　　　细胞(20 000×)
　图 5　5-FU组肝癌细胞(6 000×)
3.5　流式细胞仪检查肿瘤细胞 DNA含量并进行周期分析的结
果 各用药组肿瘤细胞周期及凋亡率见表 3。
表 3　珠子参多糖对 H22实体瘤小鼠肿瘤细胞周期及凋亡率的影响( x±s)
组别 G0 /G1期 S期 G2 /M期 凋亡率(%)NS 26.31±9.89 53.12±8.96 20.12±5.80 8.01±3.90
5-FU 57.80±7.96＊＊20.85±7.81＊＊23.02±5.11 29.96±5.13＊＊PJPS 47.01±10.98＊ 35.85±10.83＊■18.14±7.99 14.25±8.35■
　　与 NS组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与 5-FU组比较 , ■P<0.05;n=8
3.6　对 CD4 +, CD8 +T细胞亚群水平的影响 结果见表 4。
表 4　珠子参多糖对H22实体瘤小鼠脾脏中 T细胞亚群的影响( x±s)
组别 CD3+ CD3+CD4+CD8- CD3+CD4+CD8+ CD4 +/CD8+NS 39.82±3.67 23.50±2.13 11.69±1.40 2.01±0.20
5-FU 28.50±2.52＊＊ 17.03±2.06＊＊ 9.46±0.93＊ 1.80±0.17PJPS 46.15±3.21＊■■ 27.47±1.21＊＊■■ 12.04±0.78■■ 2.28±0.13＊■■
　　与 NS组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与 5-FU组比较 , ■■P<0.01;n=8
3.7　对荷瘤小鼠血清中 VEGF浓度的影响 试剂盒标准品吸光
值 A与浓度 C的线性方程:A = 0.004 1C + 0.240 1(r=
0.999 6)。各组小鼠血清中 VEGF表达情况如表 5。
表 5　珠子参多糖对 H22实体瘤小鼠血清 VEGF水平的影响( x±s)
组别 剂量 C/mg· kg-1 VEGF/pg· ml-1
NS - 46.36±3.04
5-FU 25 26.62±2.13＊＊
PJPS 50 37.63±4.12＊＊■■
　　与 NS组比较 , ＊＊P<0.01;与 5-FU组比较 , ■■P<0.01;n=10
3.8　对荷瘤小鼠生存状况的影响 除 5-FU组外 ,其他各组小
鼠接种后 5天左右腹部膨大 , 手触摸明显比接种前柔软 , 同时小
鼠活动开始减少 , 食欲减退 ,毛发蓬松。 5 -FU组小鼠接种后 7d
左右出现腹水征。用药组生存时间观察结果见表 6。
·1330·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21 NO.6
表 6　珠子参多糖对 H22腹水瘤小鼠生存时间的影响( x±s)
组别 n 生存时间 t/d 生命延长率(%)
NS 10 17.12±3.80 -
5-FU 9 21.69±2.63＊ 26.69
PJPS 10 23.05±3.38＊ 34.64
　　与 NS组比较 , ＊P<0.05
4　讨论
在本实验中 ,珠子参多糖组小鼠的瘤重量低于阴性对照组 ,
且差异有显著的统计学意义。其抑瘤率为 34.44%, 虽然低于 5
-FU组 ,但仍显示出该药对 H22荷瘤小鼠肿瘤生长有较强的抑
制作用。另外荷瘤小鼠生存状况优于 5-FU, 生存时间与 5-FU
相比差异虽无统计学意义 , 但其值高于 5-FU组 ,说明中药提取
物在抑制肿瘤生长方面效果不如传统化疗药物 , 但在改善荷瘤小
鼠生存质量及延长生命方面具有优势。
4.1　提高小鼠免疫功能 肿瘤的存在可抑制机体的免疫功能。
胸腺 、脾脏作为重要的免疫器官 , 其重量的降低往往伴随免疫功
能的衰退。实验结果显示 ,珠子参多糖组的胸腺指数 、脾指数均
高于阴性对照组 ,提示珠子参多糖能有效阻止肿瘤机体免疫器官
的萎缩 ,从而起到免疫激活作用 , 但其保护免疫器官的具体作用
机制还有待进一步的研究。 T细胞是构成机体免疫系统的主要
细胞群体之一 ,淋巴细胞 CD4 +/CD8 +比值是反应机体免疫紊乱
的敏感指标 , 当免疫功能受抑制时 , CD4 +/CD8+比值减少 [ 8] 。
在本实验中 ,珠子参多糖组 CD
4
+/CD
8
+比值高于阴性对照组(P
<0.05),这说明珠子参多糖能够改善荷瘤小鼠的细胞免疫状况。
同时 ,珠子参多糖组脾脏中 CD
4
+T细胞数量 、CD
4
+/CD
8
+比值
均高于 5-FU组(P<0.01), 显现出与化疗药相比其在提高荷瘤
机体免疫力方面的优势。
4.2　干扰肿瘤细胞的生长周期及诱导肿瘤细胞凋亡 细胞周期
是反映细胞生存状况的重要指标之一 , 在细胞周期调控机制中
有两个重要点 ,分别位于 G1期与 S期。肿瘤细胞G0 /G1期阻滞 ,
是拮抗肿瘤细胞发展的一个重要机制 [ 9] 。本实验中与阴性对照
组比较 ,珠子参多糖组 G0 /G1期细胞增多 , S期细胞比例减少 , 表
明珠子参多糖可使肿瘤细胞停留于细胞周期的 G0 /G1期 , 阻止
其进入 S期 ,使 DNA的合成受到抑制和阻断 ,从而有效地控制癌
细胞的增殖 ,促进其凋亡。
凋亡受阻是肿瘤发生的可能机制。本实验的结果表明 , 与阴
性对照组比较 , 珠子参多糖能加重肿瘤细胞凋亡 , 其凋亡率为
14.25%,高于阴性对照组 , 且差异有统计学意义。电镜超微结构
显示 , 珠子参多糖组细胞体积变小 , 细胞质浓缩。部分细胞染色
质出现早期凋亡的空泡结构;部分细胞核裂解为碎块 , 包膜内陷
并包裹胞内成分形成凋亡小体;胞浆内线粒体肿胀变形 ,呈现凋
亡的特征性形态改变。
4.3　影响肿瘤血管相关细胞因子的生成 研究表明 , 肿瘤的增殖
和转移依赖于血管形成 [ 10] 。 VEGF被认为是最强的血管形成促
进因子 [ 11] , 而在肝癌细胞中 , VEGF的表达比邻近组织明显升
高 , VEGF在肝癌新生血管中起关键作用 [ 12] 。本实验结果显示
与阴性对照组相比各用药组 VEGF表达水平均下降 ,差异有统计
学意义。其中以 5-FU组水平最低。表明珠子参多糖可以有效
抑制 VEGF表达 ,从而影响肿瘤血管的生成 , 但作用效果不如 5
-FU。
参考文献:
[ 1 ] 　陈　涛 ,陈龙飞 ,金国琴 ,等.珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效
应及机制研究 [ J] .肿瘤 , 2006, 26(2):144.
[ 2 ] 　陈　涛,胡　卫 ,崔帮平 ,等.珠子参对小鼠 H22肝癌抑制作用及机
制 [ J].世界华人消化杂志 , 2007, 15(24):2597.
[ 3 ] 　罗荣城 ,韩焕兴.肿瘤的免疫应答 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
2006:57.
[ 4 ] 　ChowLW, LoCS, LooWT.etal.Polysaccharidepeptidemediatesapop-
tosisbyup-regulatingP21geneanddown-regulatingcyclinDigene
[J].AmJChinMed.2003, 31(1):1.
[ 5 ] 　赵永娟 ,王　雷 ,候　琳 ,等.半夏多糖抗肿瘤作用研究 [ J] .中国药
理学通报 , 2006, 22(3):368.
[ 6 ] 　Jimenez-medinae, Beruquillae, Romeroj.etal.Theimmunomodula-
torPSKinducesinvitrocytotoxicactivityintumourcellinesviaarrest
ofcelcycleandinductionofapoptosis[ J] .BMCCancer, 2008, 8:
78.
[ 7 ] 　张洪泉 ,尹鸿萍 ,王　曼.螺旋藻多糖抗肿瘤作用研究 [ J].中药新
药与临床药理 , 2002, 23(15):284.
[ 8 ] 　侯　元,霍德胜 ,魏艳君 ,等.草苁蓉多糖的抗肿瘤作用及免疫调节
作用 [ J] .吉林大学学报(医学版), 2007, 33(6):1022.
[ 9 ] 　何彦丽,苏俊芳.中药多糖抗肿瘤免疫药理研究的新思路———对树
突状细胞的影响 [ J] .中国中西医结合杂志 , 2003, 23(1):73.
[ 10] 　齐春会,张永祥 ,乔善义 ,等.六味地黄多糖体外对正常及衰老小鼠
脾细胞免疫功能的影响 [ J] .中国药理学通报 , 1999, 15(2):157.
[ 11] 　奚瑾磊,彭　仁 ,杨哲琼 ,等.当归多糖及其中性组分对巨噬细胞分
泌 TNF-α的影响 [ J] .武汉大学学报(医学版), 2002, 23(1):21.
[ 12] 　刘景田 ,党小军 ,王惠萍 ,等.中药多糖对红细胞膜相 CD35免疫活
性的调节作用 [ J] .中国现代医学杂志 , 2002, 12(1):7.
·1331·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.6 时珍国医国药 2010年第 21卷第 6期