全 文 ：收稿日期:2015-01-25; 修订日期:2015-06-03
基金项目:国家自然科学基金(No． 81260655)
作者简介:管 宇(1992-)，女(满族)，吉林延吉人，延边大学医学院学生．
* 通讯作者简介:柳明洙(1963-)，男(朝鲜族)，吉林延吉人，延边大学医
学院教授，博士学位，主要从事肿瘤分子生物学研究工作．
珍珠梅黄酮纳米粒通过活化内质网应激的
Caspase 通路抑制大鼠原发性肝癌的生长
管 宇，刘炳彤，臧 韵，柳明洙*
(延边大学医学院，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨珍珠梅黄酮纳米粒(TTF1 － NP)对大鼠的原发性肝癌生长的抑制作用及机制。方法 通过二乙基亚硝胺
(DEN)间断给药法建立原发性大鼠肝癌模型;HE染色比较 TTF1 － NP作用后大鼠肝脏的形态学变化，利用 Western Blot
检测大鼠肝脏内质网应激的 Caspase 通路相关蛋白的变化。结果 HE染色结果显示，TTF1 － NP能减轻大鼠原发性肝癌
肝脏的病理学变化，增加 p － IＲE1、TＲAF2、Caspase － 12 和 Caspase － 3 蛋白的表达，且有一定的浓度依赖性。结论 TTF1
－ NP可以通过活化内质网应激的 Caspase通路抑制 DEN诱发大鼠原发性肝癌的生长。
关键词:珍珠梅; 内质网应激; 原发性肝癌; 大鼠
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 07． 024
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)07-1601-02
内质网应激(endoplasmic reticulum stress，EＲS)是经典线粒
体途径和死亡受体途径之外的第三条可以独立诱导细胞凋亡的
凋亡途径。EＲS是真核生物体内一个复杂的、多功能的信号转导
途径，参与生物体内的细胞凋亡、自噬、氧化应激等多种生物现
象，EＲS 主要通过活化 JNK、CHOP 和 Caspase 三条通路发挥作
用［1，2］。
中药珍珠梅具有抗炎镇痛、保护肝脏及抗肿瘤等药理作用，
其抗肿瘤的有效单体成分为 5，2＇，4＇－三羟基 － 6，7，5＇－三甲氧
基黄酮，其纳米制剂 TTF1 － NP具有水溶性强、易吸收的特点［3］。
有学者通过细胞实验证明 TTF1 － NP 可以在体外通过诱导肿瘤
细胞凋亡抑制肿瘤细胞的生长［4，5］。本实验采用 DEN 诱发大鼠
原发性肝癌模型，探讨 TTF1 － NP对大鼠原发性肝癌生长的抑制
作用及机制。
1 材料与仪器
1． 1 药物与试剂 TTF1 － NP 由浙江海洋学院关丽萍教授惠赠。
SDS － PAGE凝胶配制试剂盒为北京索莱宝科技有限公司生产，p
－ IＲE1、TＲAF2、Actived Caspase － 12 和 Cleaved Caspase － 3 单克
隆抗体购自美国 CST公司，β － actin购自北京博奥森生物技术有
限公司。
1． 2 实验动物 清洁级 SD 大鼠，体重 140 ～ 160 g，5 周龄，购自
延边大学实验动物中心，合格证号 SCXK(吉)2011 － 0007。
1． 3 实验仪器 DYY － 7C Western 电泳仪:北京市六一仪器厂
产品;5418Ｒ低温超速离心机:德国艾本德生命科学公司产品;
YXQ － LS － 30S1 压力蒸汽灭菌器:上海博迅医疗设备厂产品。
2 方法
2． 1 大鼠原发性肝癌模型的建立 54 只大鼠稳定饲养 7 d 后随
机分为实验组(45 只)和对照组(9 只)。实验组饲喂浓度为
0． 01%的 DEN(美国 Sigma公司)溶液 5 周，隔天更换一次，之后
饲喂灭菌水 3 周，继续饲喂浓度 0． 01%的 DEN溶液 6 周，之后全
部饲喂灭菌水至 20 周。对照组全程饲喂灭菌水，隔天更换一次。
2． 2 TTF1 － NP给药干预 经过 20 周喂养，将实验组大鼠随机
分为 5 组:模型组、TTF1 － NP 低、中、高剂量组和阿霉素组，每组
9 只。TTF1 － NP低、中、高剂量组按照 4，8，16 μg /kg体重腹腔注
射终体积 1 ml的 TTF1 － NP氯化钠溶液。空白对照组和模型组
腹腔注射等体积生理盐水，阿霉素组腹腔注射浓度为 0． 1 mg /kg
体重的阿霉素葡萄糖溶液。给药间隔为 2 d，共给药 7 次。给药
结束后，麻醉处死大鼠，取出肝脏，进行常规 HE 染色和 Western
Blot检测 Caspase通路相关蛋白。
2． 3 Western Blot检测 Caspase通路相关蛋白 称取 0． 2 g大鼠肝
组织，加 3 ml 裂解液于匀浆器中充分研磨混匀，冰上裂解 30
min。4℃，12 000 r /min离心 15 min。考马斯亮蓝法进行蛋白定
量，取 20 μg总蛋白，选择 10% 分离胶和 5% 浓缩胶进行 SDS －
PAGE电泳，完毕后将蛋白转印至 PVDF膜，用 5%脱脂奶粉封闭
1 h后分别加入 1 ∶ 1 000 p － IＲE1、TＲAF2、Actived Caspase － 12
和 Cleaved Caspase － 3 蛋白单克隆抗体，在 4℃冰箱中孵育 12 h。
TBST清洗后加入 1∶ 5 000 稀释的 HＲP 标记的二抗室温孵育 2
h，TBST清洗，显影。采用 UVP凝胶成像分析系统采集图片并进
行密度分析以测定蛋白的相对表达量。
2． 4 数据分析与处理 数据应用 SPSS16． 0 软件进行分析，数据
进行单因素方差分析。P ＜ 0． 05 为差异显著，P ＜ 0． 01 为差异极
显著。
3 结果
3． 1 TTF1 － NP给药干预肝脏 HE染色结果 对照组正常大鼠肝
索排列整齐，从中央静脉向四周放射排布，肝小叶结构完整，细胞
排列整齐，结构完整，呈正常的圆形或卵圆形，见图 1 － A。模型
组可见肝索排列不齐，肝细细胞表现出严重异形性，核膜凹陷，核
深染，染色质边移，肝细胞核形态不规则，炎性反应严重，见图 1
－ B。阿霉素组肝细胞状况较模型组明显改善，但肝细胞及细胞
核形态异常，见图 1 － C。TTF1 － NP给药组变性及坏死的肝细胞
较少，细胞形态逐渐恢复，肝小叶结构趋于完整，无明显炎性细
胞，见图 1 － D。
3． 2 Western Blot检测 Caspase 通路相关蛋白结果 Western Blot
检测结果显示:TTF1 － NP 低、中、高剂量组随着剂量的增加 p －
IＲE1、TＲAF2、Actived Caspase － 12 和 Cleaved Caspase － 3 蛋白的
表达逐渐增加，与对照组比较，有显著性差异(P ＜ 0． 05 或 P ＜
0． 01)，阿霉素组上述蛋白在大鼠肝组织的表达也明显增加(P ＜
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0． 05)。定性分析结果见图 2，定量分析结果见图 3。
A．对照组 B． 模型组
C． 阿霉素组 D． TTF1 － NP用药组(8μmol /L)
图 1 TTF1 － NP给药后大鼠肝脏的 HE染色结果(400 ×)
图 2 TTF1 － NP对原发性大鼠肝组织
EＲS相关蛋白 Western blot检测结果
与模型组比较，#P ＜ 0． 05;
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01
图 3 TTF1 － NP对原发性大鼠肝组织
EＲS相关蛋白灰度分析定量结果
4 讨论
本实验采用 DEN间断给药法成功建立了大鼠原发性肝癌模
型，与人原发性肝脏癌的形成过程相似，TTF1 － NP 注射给药实
验组大鼠后，HE染色结果证实 TTF1 － NP 对大鼠原发性肝癌的
生长有一定的抑制作用。
IＲE1 是位于内质网膜上的 I 型跨膜信号蛋白，正常状态下
其结构中的管腔区与内质网伴侣蛋白 GＲP78 结合不具有活性。
但当机体受到刺激诱发 EＲS时，IＲE1 与 GＲP78 解离通过自身磷
酸化活化，募集 TＲAF2 活化 EＲS 的 Caspase 通路。TＲAF2 是连
接 EＲS跨膜蛋白和下游凋亡通路的重要蛋白，可以通过聚集 pro
－ Caspase － 12 并使其活化，促进 EＲS 诱导的细胞凋亡反应的发
生。本实验结果发现 TTF1 － NP 低、中、高剂量组 p － IＲE1 和
TＲAF2 均活化表达，且有剂量依赖性，说明 TTF1 － NP 可以活化
EＲS反应的 Caspase 通路关键信号蛋白 p － IＲE1 和 TＲAF2 的表
达，启动 EＲS，促进 EＲS凋亡蛋白活化表达。
Caspase家族在细胞凋亡的机制网络中居中心地位。Caspase
－ 12 是 EＲS 诱导细胞凋亡的必需因子，与 TＲAF2 解离后的 pro
－ Caspase － 12 被特异性剪切活化，且只在 EＲS 反应中活化表
达，并通过 Caspase家族级联反应活化 Caspase － 3 表达。本研究
发现活化的 Caspase － 12 和剪切型 Caspase － 3 在 TTF1 － NP 低、
中、高剂量组中明显表达，说明 TTF1 － NP对 EＲS反应的 Caspase
通路诱发的细胞凋亡有明显的活化作用。
本实验通过间歇饲喂 DEN 构建大鼠肝癌模型，通过腹腔注
射给药 TTF1 － NP，从体内实验验证了 TTF1 － NP 可以抑制原发
性大鼠肝肿瘤的生长，并且证实了其抑制作用与内质网应激的
Caspase通路有关，但其抑制过程是否启动了内质网应激的
CHOP和 JNK通路，还需要进一步研究。
参考文献:
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way:the EＲ stress response and its role in the metabolic syndrome［J］．
Methods Mol Biol，2010，648:43．
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［3］ 李 妍，崔逢德，张学武． 珍珠梅黄酮固体脂质纳米粒的制备工艺
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 7