全 文 ：收稿日期:2014-07-16; 修订日期:2014-10-13
基金项目:国家自然科学基金(No． 81260655)
作者简介:刘延祥(1970-)，男(汉族)，吉林延吉人，延边大学附属医院副
主任技师，硕士学位，主要从事肿瘤分子生物学工程研究工作．
* 通讯作者简介:张学武(1973-)，男(汉族)，吉林大安人，延边大学医学
院教授，博士研究生导师，主要从事肿瘤分子生物学研究工作．
珍珠梅黄酮纳米粒诱导
人肝癌 HepG － 2 细胞凋亡的实验研究
刘延祥1，肖 斌2，张学武2*
(1．延边大学附属医院，吉林 延吉 133000; 2．延边大学医学院，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌 HepG － 2 细胞凋亡的影响。方法 采用 MTT 法观察不同时间(24，48，72
h)、不同浓度(50，100，200 μmol /L)的珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌细胞(HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5)及人正常肝细胞
(Chang Liver)的增殖抑制作用;利用光学、荧光和透射电子显微镜观察 HepG － 2 细胞凋亡，并应用流式细胞术检测细胞
凋亡情况。结果 MTT法检测细胞增殖抑制结果显示:不同浓度的珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌细胞(HepG － 2，Hep3B，
PLC /PＲF /5)及人正常肝细胞(Chang Liver)均有不同程度的抑制作用，对人肝癌 HepG － 2 细胞抑制最明显;形态学检测
结果显示:珠梅黄酮纳米粒干预 HepG － 2 细胞 48 h后，细胞出现明显的凋亡;流式细胞术检测阴性对照组、5 － Fu阳性对
照组及不同浓度珍珠梅黄酮纳米粒干预组(50 ，100 μmol /L)凋亡率分别为为 4． 9%，89． 6%，50． 0%，86． 2%。结论 珠梅
黄酮纳米粒可以抑制人肝癌 HepG － 2 生长并诱导其凋亡。
关键词:珍珠梅; 黄酮; 纳米粒; 细胞凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 03． 012
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)03-0547-03
长白山珍珠梅 Sorbaria sorbifolia属蔷薇科植物，有活血化瘀、
消肿止痛等药理作用［1］，被《抗癌中药大辞典》收录为长白山抗
癌药。经研究发现［2 ～ 4］，珍珠梅抗癌的主要成分为 5，2＇，4＇－ 三
羟基 － 6，7，5＇－ 三甲氧基黄酮，其对小鼠 S180 肉瘤有明显抑制
作用，并可抑制肿瘤细胞血管生成。为了更好的促进其在体内的
吸收性能，有学者［5］以生物体内可降解材料硬脂酸为载体，采用
乳化 －低温固化法制备生物体易降解吸收的珍珠梅黄酮可生物
降解纳米粒(5，2 ＇，4 ＇ － trihydroxy － 6，7，5 ＇ － trimethoxyflavone
nanoparticles，以下简称 TTF1 － NP)。本研究观察 TTF1 － NP对人
肝癌 HepG － 2 细胞凋亡的影响，为进一步研究珍珠梅的药理作
用提供实验依据。
1 材料与仪器
1． 1 细胞株 人肝癌 HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5 细胞购于南
京凯基生物技术公司;人正常肝细胞 Chang Liver 来自本室冻存。
1． 2 药品 TTF1 － NP由延边大学药学院关丽萍教授惠赠。
1． 3 试剂 DMEM培养基购自美国 gibco公司;MTT粉购自美国
sigma公司;PBS 粉购自 Biotopped 公司(130326);小牛血清购自
美国 gibco 公司;0． 25 % Trypsin － EDTA 购自美国 gibco 公司
(25200 － 072);青链霉素购自美国 gibco公司(15140 － 122);DM-
SO购自美国 AMＲESCO(1442C0050);5 －氟尿嘧啶购自于西安
海欣制药有限公司。
1． 4 仪器 倒置显微镜，日本 OLYMPUS 公司产品;ＲT － 2100 型
酶标仪，美国 ＲAYTO 公司产品;XD － 101CO2 培养箱，美国
SANYO公司产品;超净工作台，中国 ZHJH 公司(C1109C);低温
冰箱，日本 SANYO公司产品;1500 电热鼓风干燥箱，中国上海圣
欣公司产品。
2 方法
2． 1 细胞培养 人肝癌细胞(HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5)、人
正常肝细胞(Chang Liver)分别用含有 10 % 小牛血和 1 × 105 U /
L的 DMEM培养基常规培养，培养条件为 37 ℃，5 % CO2 的培养
箱中全湿培养，取对数期细胞准备下一步实验。
2． 2 MTT法检测 TTF1 － NP 对多种细胞的增殖抑制作用 取对
数生长期的 HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5 和 Chang Liver细胞，分
别以细胞密度为 6 × 103 /孔接种于 96 孔板，培养 24 h 后，分为
TTF1 － NP实验组(50，100，200 μmol /L)以及阴性对照组(DMEM
常规培养)和 5 － Fu阳性对照组(10 μmol /L)分别培养 24，48，72
h后，每孔内加入浓度为 5 mg /ml的 MTT溶液 20 μl，培养 4 h，弃
去孔内溶液，每孔内加入 180 μl 的二甲基亚砜(DMSO)，避光移
至酶标仪内，充分震荡 10 min 后，测定 570 nm 处各孔内吸光度
OD值。细胞生长抑制率(%) =(1 － 样本平均 A 值 /阴性对照
组平均 A值)× 100 %。
2． 3 细胞凋亡的形态学检测
2． 3． 1 光学显微镜检测(HE 染色)取对数生长期 HepG － 2 细
胞，细胞密度为 1 × 105 /孔，每孔内 2 ml铺于 6 孔板爬片上，常规
培养 24 h后，分 TTF1 － NP实验组(50，100 μmol /L)、阴性对照组
(DMEM常规培养)和 5 － Fu阳性对照组(10 μmol /L)，培养 48 h
后弃去液体，4 % 多聚甲醛固定 20 min，苏木素染色 3 min，伊红
染色 1 min，酒精梯度脱水，二甲苯内浸泡 15 min，取片，晾干，中
性树胶封片。
2． 3． 2 透射电镜检测 取对数生长期 HepG － 2 细胞，细胞密度
为 1 × 105 /孔每孔内 2 ml铺于 6 孔板爬片上，常规培养 24 h 后，
分 100 μmol /L TTF1 － NP实验组和阴性对照组(DMEM)培养 48
h后弃去液体，3 % 戊二醛固定，1 % 锇酸固定，逐级酒精脱水，
氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，在透射电镜下观察，
拍片记录。
2． 3． 3 荧光显微镜检测(Hochest染色)取对数生长期 HepG － 2
细胞，铺于 6 孔板爬片内，每孔内 2 ml细胞悬液，细胞密度为 1 ×
105 /孔，常规培养 24 h后，分 TTF1 － NP实验组(50，100 μmol /L)
以及阴性对照组和阳性对照组培养 48 h 后弃去液体，4 % 多聚
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甲醛固定 20 min，Hochest染色 10 min，避光，荧光显微镜检测。
2． 3． 4 流式细胞术检测 取对数生长期 HepG － 2 细胞，收集到
15 ml离心管内。冰 PBS清洗，1 000 r /min 离心 5 min，冰 PBS制
成细胞悬液(细胞计数，保证每个样本数大约 1 × 106 个)。1 000
r /min离心 5 min，弃去液体，用 200 μl 结合缓冲液重悬细胞，避
光孵育 20 min;加入 AnnexinV 10 μl，避光静止 10 min;离心 1 000
r /min，5 min，弃去液体，重新加入结合缓冲液重悬细胞，每个样
本加入 5 μl PI 避光孵育。上机检测。
2． 4 数据分析及处理 实验数据均以 珋x ± s 表示，结果采用 SPSS
16． 0 软件分析，数据进行单因素方差分析 (One way ANOVA)和
t检验。
3 结果
3． 1 TTF1 － NP对多种细胞的增殖影响 MTT 检测结果显示，珍
珠梅黄酮纳米粒实验组(50，100，200 μmol /L)以及阴性对照组
(DMEM常规培养)和 5 － Fu阳性对照组(10 μmol /L)，分别培养
24 ，48，72 h 后，HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5 和 Chang Liver 细
胞生长均受到不同程度的抑制，且呈一定的浓度和时间依赖关
系。其中，珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌 HepG － 2 细胞抑制最为
明显(图 1 A)，Hep3B，PLC /PＲF /5 其次(图 1 B，C)，对 Chang
Liver细胞抑制不显著(图 1 D)。以下实验选取人肝癌 HepG － 2
细胞为实验对象。
与阴性对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
A．人肝癌 HepG － 2 细胞;B．人肝癌 Hep3B细胞;
C．人肝癌 PLC /PＲF /5 细胞;D．人正常肝 Chang Liver细胞
图 1 TTF1 － NP对细胞增殖抑制的影响
3． 2 形态学检测结果
3． 2． 1 光学显微镜检测结果 阴性对照组 HepG － 2 细胞呈梭形
或多角形，细胞胞浆丰富，细胞延展性较好，细胞核规则，细胞形
态正常(图 2 A);5 － Fu 组细胞变圆，变小，细胞深染，核聚缩明
显(图 2 B);50 μmol /L TTF1 － NP组细胞数略有减少，细胞之间
连接疏松(图 2 C);100 μmol /L 珍珠梅黄酮纳米粒组细胞核浓
缩，染色质边聚，细胞形态改变(图 2 D)。
A．阴性对照组;B． 5 － Fu 组;
C． 50 μmol /L TTF1 － NP组;D． 100 μmol /L TTF1 － NP组
图 2 TTF1 － NP诱导 HepG － 2 细胞凋亡的 HE染色检测结果(400 ×)
3． 2． 2 荧光显微镜观察 阴性对照组细胞染色均匀，呈微弱均匀
蓝色荧光(图 3 A);5 － Fu组细胞核内可见颗粒块状明亮蓝色荧
光(图 3 B);50 μmol /L TTF1 － NP组细胞可见数量稍有减少，有
小部分细胞核内可见明亮蓝染(图 3 C);100 μmol /L TTF1 － NP
组细胞减少明显，呈明亮蓝色荧光(图 3 D)。
3． 2． 3 透射电镜检测结果 对照组细胞形态结构正常，胞浆丰
富，细胞器结构正常(图 4 A)，珍珠梅黄酮纳米粒实验组细胞细
胞固缩，细胞器碎裂、胞质空泡化(图 4 B)。
3． 3 流式细胞术检测结果 对照组细胞存活率为 91． 34 %，凋亡
率为 4． 92 %。5 － Fu阳性对照组细胞及珍珠梅黄酮纳米粒干预
组(50，100 μmol /L)的存活率均下降，凋亡率上升。凋亡率依次
为:89． 6%、50． 0%和 86． 2%，与阴性对照组相比显著升高。
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 3
A．阴性对照组;B． 5 － Fu 组;
C． 50 μmol /L TTF1 － NP组;D． 100 μmol /L TTF1 － NP组
图 3 TTF1 － NP诱导 HepG － 2 细胞凋亡的
Hochest染色检测结果(400 ×)
A． 阴性对照组;B． 100 μmol /L TTF1 － NP组
图 4 TTF1 － NP诱导 HepG － 2 细胞凋亡的
透射电镜检测结果(6 000 ×)
A． 阴性对照组;B． 5 － Fu 组;
C． 50 μmol /L TTF1 － NP组;D． 100 μmol /L TTF1 － NP组
图 5 TTF1 － NP诱导 HepG － 2 细胞凋亡的流式细胞术检测结果
4 讨论
细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的
有序的死亡［6］，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作
用［7］。细胞形态学特征改变是其发生凋亡的最直观有力的证
据，主要形态学变化变现为:凋亡细胞体积收缩、变圆，染色质浓
缩、边缘化，细胞膜内陷形成多个细胞凋亡小体等［8］。
本研究首先通过不同浓度(50，100，200 μmol /L)的 TTF1 －
NP分别干预人肝癌 HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5 及人正常
Chang Liver肝细胞 24 h，48 h 和 72 h，发现珍珠梅黄酮纳米粒对
HepG － 2，Hep3B，PLC /PＲF /5 均有不同程度的抑制作用，且呈一
定的时间、浓度依赖性，对人肝癌 HepG － 2 细胞的抑制作用最显
著，因此以下研究均以人肝癌 HepG － 2 细胞为主要研究对象，对
正常 Chang Liver肝细胞作用不明显。结果显示，阴性对照组细
胞形态结构正常，细胞呈菱形或多角形，细胞间连接紧密，延展性
较好，细胞核结构正常;5 － Fu组细胞变化显著，细胞变小，固缩，
胞核边移浓缩，染色质出现明显的新月形改变，部分贴壁细胞
皱缩，变圆，脱落，Hochest 染色见明亮荧光;50 μmol /L 珍珠梅黄
酮纳米粒干预 48 h 细胞未见明显变化;100 μmol /L 珍珠梅黄酮
纳米粒组有较明显改变，细胞数减少，细胞收缩、变小，胞核边移，
出现凋亡现象，Hochest 染色见明亮白色荧光。通过 HE，Hochest
染色及透射电镜检测结果表明:TTF1 － NP 可诱导人肝癌 HepG
－2 细胞凋亡。流式细胞术检测显示，阴性对照组仅有少量细胞
凋亡(4． 92%)，5 － Fu组凋亡率为 89． 58%，不同浓度 TTF1 － NP
(50 ，100 μmol /L)凋亡率分别为 50． 0%，86． 2%，说明 TTF1 － NP
可诱导人肝癌 HepG － 2 细胞凋亡，本研究为珍珠梅黄酮纳米粒
的抗肿瘤作用的深入研究提供了一些参考数据。
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