全 文 ：[文章编号 ] 　1000-4718(2009)10-2017-05
　[收稿日期 ] 2008-11-14　　　[修回日期 ] 2009-03-16
＊[基金项目 ]国家自然科学基金面上资助项目(No.30571735);国家自然科学基金国家杰出青年科学基金资助项目(No.
30325019);教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20060558046);广东省科技项目资助(No.2005A30801005)
■通讯作者 E-mail:gujieruo@163.com
南蛇藤素和扁蒴藤素显著下调
HLA-B＊ 2705启动子的活性＊
赵丽珂 1, 2 , 　古洁若 1■ , 　余得恩1, 3
(1中山大学附属第三医院风湿科 ,广东 广州 510630;2卫生部北京医院风湿免疫科 ,北京 100730;
3加州大学洛杉矶分校风湿免疫科 , CA90024, USA)
　　[摘　要 ] 　目的:利用高通量药物筛选方式 , 为寻找潜在的脊柱关节炎(SpA)新的治疗药物提供理论依据。
方法:选取 12 264小分子化合物分别使用 293T-HLA-B27和 HeLa-HLA-B27稳定细胞株 ,观察对 HLA-B＊
2705启动子有调节作用的化合物 , 筛选能够下调 HLA-B＊ 2705启动子活性的阳性化合物:启动子活性 >150%为
激动剂 , 启动子活性 <60%为抑制剂。并且对进一步筛选出的抑制剂进行细胞毒性试验及半数抑制浓度 /半数效
应浓度(IC50/ EC50)检测 , 筛选出具有较好剂量 -效应的阳性化合物。结果:(1)使用 293T-HLA-B27细胞第 1
次筛选出 624种阳性化合物 ,阳性率为 5.1%;(2)使用 HeLa-HLA-B27细胞株对上述 624种化合物进行再次筛
选 , 有 70种化合物再次显示出对 B＊ 2705启动子活性的增强或者抑制作用;(3)进行 EC50 /IC50检测的 40种化合物
中 , 6种化合物为抑制剂 , 表现出较好的剂量 -效应曲线 , 其中南蛇藤素和扁蒴藤素均为雷公藤类衍生物。结论:南
蛇藤素和扁蒴藤素可下调 HLA-B27表达 , 提示在今后针对 HLA-B＊ 2705相关的 SpA患者治疗中 , 它们可能是
值得研究的潜在有效化合物。
[关键词 ] 　HLA-B＊ 2705启动子;雷公藤属;脊椎关节炎
　　[中图分类号 ] 　R593.23　　　　　[文献标识码 ] 　A
CaelastrolandpristimerinderivedfromLeigongtenginhibitpromoterac-
tivityofHLA-B＊ 2705 gene
ZHAOLi-ke1, 2 , GUJie-ruo1 , YUDavid1, 3
(1DepartmentofRheumatology, TheThirdAfiliatedHospitalofSunYat-senUniversity, Guangzhou510630, China;
2DepartmentofRheumatologyBeijingHospital, Beijing100730, China;3DepartmentofRheumatology, UniversityofCali-
forniaatLosAngeles, CA90024, USA.E-mail:gujieruo@163.com)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:Toscreentheefectivechemicals, whichcansuppressthepromoteractivityoftheHLA-B＊
2705 geneaspotentialtherapeuticagents.METHODS:TheHeLa-HLA-B27, 293T-HLA-B27stabletransfectants
wereusedtomonitortheeffectof12 264 chemicalsthroughhighthroughputscreening(HTS).Chemicalswhichregulates
HLA-B＊ 2705 promoteractivitymorethan150% orlessthan60% werepickedoutforthefurtherIC50 /EC50 andcelvia-
bilitydetection.RESULTS:(1)Theprimaryscreeningusedby293T-HLA-B27 stabletransfectantyieldedabout
5.1% hitswhicheithersuppressed(556 chemicals)orenhanced(68 chemicals)theHLA-B＊ 2705 promoteractivity.
(2)Areconfirmationscreeningwascariedoutwiththese624 ofthecandidatesusingtransfectedHeLa-HLA-B27 cells.
Seventyhitswereconfirmed.(3)Basedonthebioinformaticsofthosepositivehits, 40 chemicalswereselectedforin-
depthanalysisbydose-responseexperimentandIC50 /EC50 detection.Sixsuppressorsshowedpotentialpharmacological
activities.Interestingly, twosuppressors(celastrolandpristimerin)arederivedfromLeigongteng, aherbalmedicineal-
readyusedforseveraldecadesfortreatmentofimmuneregulatoryandinflammatorydiseases.Fouractivechemicalswere
computerdesignedwithnorelevancetotheabovestructures.CONCLUSION:ChinesetraditionalherbNanshetengand
LeigongtengmightbethepotentialdrugsforHLA-B27positivepatients.Theseresultsprovidenewdirectionforresearch
inboththetherapeuticsandthepathogenesisofspondyloarthritis.
　　[ KEYWORDS] 　HLA-B＊2705 promoter;Tripterygium;Spondyloarthritis
·2017·中国病理生理杂志　ChineseJournalofPathophysiology　2009, 25(10):2017-2021
　　临床研究发现脊椎关节炎 (spondyloarthritis,
SpA)患者 HLA-B27阳性率明显增高 , 其中 , 约
90%-95%以上的强直性脊柱炎(ankylosingspon-
dylitis, AS)患者 HLA-B27阳性 , 60%-80%的反
应性关节炎(reactivearthritis, ReA)和 50%伴脊柱
关节受累的银屑病或肠病相关的关节炎患者为 HLA
-B27阳性[ 1] 。虽然目前对 HLA-B27在 SpA发病
机制中作用尚不清楚 ,但大量的遗传学连锁关连研
究表明 HLA-B27可能为其中一个主要的致病易感
基因。多个地区和国家的许多有关 B27亚型与 SpA
相关性的研究 [ 3, 4]提示 , HLA-B＊ 2705的高表达水
平与 SpA有密切相关 。本研究以 HLA-B＊ 2705为
靶点 ,运用国际先进的高通量药物筛选技术和先进
的筛选设备 ,以稳定转染 HLA-B＊ 2705启动子荧光
素酶载体的 HeLa细胞株和 293T细胞株为基础 ,筛
查 小分子化合物对 HLA-B27表达的影响 ,目的是
发现能够下调 HLA-B27基因表达的新的小分子化
合物 ,从而为 SpA的治疗提供新的靶药物研究方向。
材　料　和　方　法
1　细胞株培养
表达 HLA-B＊ 2705启动子的稳定转染细胞系
HeLa-HLA-B27细胞 、293T-HLA-B27细胞均来
自本实验室 [ 4] 。细胞株培养于含 10%胎牛血清 、200
mg/L潮霉素的 EMEM培养基。 EMEM培养基和胎
牛血清均购自 Invitrogen。潮霉素购自 Sigma。所有
细胞在 37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养 。
2　HTS药物筛选模型稳定性考察
本研究中建立的细胞筛选模型适用于高通量筛
选 ,其稳定性由 Z′因子考察 。把阳性克隆细胞接种
于 384孔板(4 000 cels/wel, 50 μL培养液 /孔)过
夜 , 将 TNF-α(20 μg/L)加入到设置的 48个阳性
样品孔中 ,阴性对照孔设置 48个细胞对照孔。诱导
24 h后 , 裂解细胞使用微孔板荧光发光计检测 Luc
荧光值 。TNF-α购自 eBioscience。
Z′因子 =1-[ 3×阳性样品孔 Luc值的标准差
(s)+3×对照孔 Luc值的标准差(s)] /(阳性样品孔
Luc平均值 -对照孔 Luc平均值)。
信号本底比(S/B)=阳性样品孔 Luc平均值 /对
照孔 Luc平均值 。
信噪比 (S/N)=(阳性样品孔 Luc平均值 -对
照孔 Luc平均值)/对照孔 Luc值的标准(s)。
3　使用 293T-HLA-B27稳定细胞株对化合物库
第 1次筛选
应用基于 Luc报告基因细胞系统模型对 UCLA
MSSR实验室样品库中的 12 264种小分子化合物库
进行筛选 ,化合物包括:204种生物活性的脂质 , 72
种离子通道 , 84种酶抑制剂 , 84种磷酸酶抑制剂和
激酶抑制剂 , 1 120种 FDA批准的药物 , 2 000种其它
的具有生物活性的药物和 8 000种未知功能的化合
物 。将稳定转染细胞株 293T-HLA-B27细胞接种
于 384孔板中(4 000 cels/wel, 50 μL培养液 /孔),
待贴壁良好后用机械手加入待筛化合物 0.5 μL(终
浓度 10 μmol/L),每板均加入 DMSO(R＆D)作为阴
性对照 、TNF-α作为阳性对照(根据第 2部分的结
果选取)。加入化合物 24h后 ,使用 BriteliteReport-
erGeneAssaysystem(PerkinElmer)分析 。将化合物
上调 /下调 HLA-B＊ 2705基因启动子转录的荧光酶
相对活性定义为:(1 -荧光值样品 /荧光值 DMSO)
×100%。样品的荧光酶相对活性大于 150%为激
动剂 ,荧光酶相对活性 <60%为抑制剂。
4　使用 HeLa-HLA-B27稳定细胞株对化合物库
第 2次筛选
将第 1次筛选出的阳性化合物(相对于对照组
Luc值 >150%, 或者 Luc值 <60%), 使用 HeLa-
HLA-B27稳定细胞株对这些化合物进行第 2次筛
选以排除假阳性 。将 HeLa-HLA-B27细胞接种于
384孔板中(4 000 cels/wel, 50 μL培养液 /孔), 待
贴壁良好后加入阳性化合物(10 μmol/L)、TNF-α
(20 μg/L)/ IFN-β (1 ×106 U/L), 每板均加入
DMSO作为阴性对照 、TNF-α作为阳性对照。加入
化合物 24 h后 , 使用 BriteliteReporterGeneAssay
system分析 。TNF-α购自 eBioscience, IFN-β 均
购自 CelScience。并使用 ATPliteAssay(PerkinEl-
mer)检测阳性化合物对细胞增殖功能的影响。
5　半数效应浓度 /半数抑制浓度(EC50 /IC50)检测
将用 HeLa-HLA-B27细胞第 2次筛选出的阳
性化合物成倍稀释 12次 ,在 384孔反应板中每孔中加
入 DMSO10μL。第 1孔加储存浓度的化合物 10 μL,
混匀后吸出 10μL加入第 2孔。如此反复倍比稀释
至第 10孔 ,从第 10孔吸出 10 μL弃掉 。第 11孔为
空白对照 。阳性化合物浓度梯度 0.1 μmol/L-50
μmol/L。将 HeLa-HLA-B27细胞接种于 384孔板
中(4 000cels/wel, 50μL培养液 /孔), 待贴壁良好
后加入上述稀释后的阳性化合物 , 每板均加入 DM-
SO作为阴性对照 、TNF-α作为阳性对照 。加入化
合物 24 h后 ,使用 BriteliteReporterGeneAssaysys-
tem试剂检测发光值。
6　统计学处理
采用 SPSS13.0统计软件 。选择 Studentt检验
·2018·
进行样品或阳性药组与对照组之间差异显著性即各
组间算术均数的差异性检验。使用 GraphPadPrism
5.0计算 IC50 /EC50和 95%置信区间 。
结　　果
1　模型稳定性考察
根据筛选出的阳性克隆细胞进行的 24次试验
的结果计算的信噪比(S/N)、信号本底比(S/B)及
Z′因子值分别为 659.4、5.5、0.88 ,说明此模型具有
很好的稳定性。
2　使用 293T-HLA-B27稳定细胞株对化合物库
第 1次筛选结果
使用 293T-HLA-B27稳定细胞株对 12 264种
化合物进行第 1次筛选 ,结果显示 624种化合物能
够增强或者抑制 HLA-B＊ 2705启动子活性(相对于
对照组 Luc值 >150%,或者 Luc值 <60%),其中抑
制剂 556种(4.5%)。第 1次化合物筛选的阳性率
为 5.1%,见表 1。
3　使用 HeLa-HLA-B27稳定细胞株对初筛化合
物第 2次筛选
使用 HeLa-HLA-B27稳定细胞株对上述 624
种化合物进行再次筛选 ,结果显示:在单纯 HeLa-
B27组 , 70种化合物再次显示出对 HLA-B＊ 2705启
动子活性的显著调节作用(相对于对照组 Luc值 >
150%,或者 Luc值 <60%),其中抑制剂 34种;在使
用 TNF-α/IFN-β刺激的 HeLa-B27组 , 778种化
合物(激动剂 20种 ,抑制剂 58种)可以上调或者下
调 HLA-B＊ 2705启动子的活性 ,见表 2。共计 130
种化合物对 HLA-B＊ 2705启动子具有调节作用 ,
其中 32种化合物可以同时增强或者抑制 2组 HLA
-B＊ 2705启动子的活性。我们选取了 40种感兴趣
的化合物进行 EC50 /IC50检测 。
表 1　化合物用 293T-HLA-B27稳定细胞株调节 HLA-
B＊ 2705启动子活性结果
Tab1　Resultsoffirstchemicalscreeningbyusing293T-HLA
-B27 stablecels
Chemicallibrary No.chemicals Hits(%)
Suppressors
(%)
Biomollibraries 504 24 23
Microcoursespectrumcollection 2 000 103 93
FDAapproveddruglibrary 1 120 159 122
Druggablecompoundset 8 640 338 318
Total 12 264 624(5.1%) 556(4.5%)
表 2　使用 HeLa-HLA-B27稳定转染细胞株对化合物库第 2次筛选结果
Tab2　ResultsofsecondarychemicalscreeningbyusingHeLa-HLA-B27 stablecells
Chemicallibrary No.chemicals HLA-B27 HLA-B27/TNFα+IFNβHits(%) Suppressors Hits(%) Suppressors
Biomollibraries 24 3(0.5%) 3 8(1.3%) 7
Microcoursespectrumcolection 103 36(5.8%) 23 35(5.6%) 28
FDAapproveddruglibrary 159 10(1.6%) 5 22(3.5%) 19
Druggablecompoundset 338 21(3.4%) 3 13(2.1%) 4
Total 624 70(11.2%) 34 78(12.5%) 58
4　阳性化合物的 EC50 /IC50
在进行 EC50 /IC50试验的 40种化合物中 , 6种抑
制剂化合物有较好的剂量 -反应效应曲线 , 同时细
胞增殖功能试验显示细胞活性在 85%-100%。其
中有 3种化合物具有已知的生物学活性 ,见表 3,另
外 3种为电脑设计的未知功能的化合物。
表 3　6种具有较好的剂量 -反应效应曲线的抑制剂列表
Tab3　Listofsixsuppressorswithgooddose-responsecurves
Suppressors IC50(μmol/L) 95%CI R2 Maxinhibition(%)
Celastrol 2.49 0.7781 to4.198 0.94 94
Pristimerin 3.25 2.958 to3.547 1.00 93
Cantharidicacid 3.73 2.597 to4.858 0.98 70
Unknown(TAR-16l17) 4.03 3.391 to4.673 1.00 82
Unknown(TAR-15J19) 0.88 0.6808 to1.084 0.99 95
Unknown(TAR-19F12) 5.94 4.707 to7.178 1.00 84
·2019·
5　3种已知的生物学活性化合物化学结构(图 1)
Fig1　Chemicalstructuresofthreesuppressors.
图 1　3种抑制剂的化学结构
6　6种抑制剂的剂量 -反应效应曲线(图 2)
Fig2　Dose-responsecurvesofsixsuppressors[ Yaxis:relativeactivity(%).Xaxis:log(concentration)] .
图 2　6种抑制剂的剂量 -反应效应曲线
讨　　论
HTS技术与传统的药物筛选方法相比有以下几
个优点:反应体积小 、自动化 、灵敏快速检测 、高度特
异性。随着对 HTS研究的不断深入 ,随着对筛选模
型的评价标准 、新的药物作用靶点的发现以及筛选
模型的新颖性和实用性的统一 , HTS技术将在未来
的药物研究中发挥越来越重要的作用 。
我们利用该系统筛选了 12 264种小分子化合
物 ,得到的 14种能上调 /下调 HLA-B＊ 2705基因
启动子活性的化合物 ,其中抑制剂有 6种 ,已知功能
的有 3种 ,它们是分别是南蛇藤素 (又名雷公藤红
素 , celastrol)、扁蒴藤素 (pristimerin)、斑蝥酸 (can-
tharidicacid)。另外 3种为电脑设计的未知功能的
化合物 。出乎意料的是抑制剂中雷公藤红素和扁蒴
藤素均是雷公藤类衍生物 ,可从南蛇藤中共分离到 ,
它们具有抗炎镇痛 、抗肿瘤 、抗菌 、抗病毒 、抗生育等
广泛的药理活性 [ 5] 。体外实验中发现扁蒴藤素抑制
鼠巨噬细胞表达 [ 6] ,其结构类似物南蛇藤素在体外
有抗脂质过氧化作用 [ 7] 。此外 , Chang等 [ 8]通过筛选
发现南蛇藤素和扁蒴藤素作用于人类的非小细胞肺
癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)、结肠癌(HCT-8)、鼻
咽癌及其耐药株(KB、KB-VIN)、神经胶质瘤(U-
87-MG)、前列腺癌(PC-3)、卵巢癌(1A9、PTX10)
等细胞株时 ,具有显著的细胞毒活性(ED50为 0.076
-0.340 mg/L)。 Ngassapa等[ 9]也发现南蛇藤素对
上述以及鼠白血病 P388细胞株有显著的细胞毒作
用 。Dirsch等 [ 6]研究发现扁蒴藤素可影响 NO生成
的各个环节 ,如剂量依赖性减少亚硝酸盐的蓄积 ,降
低诱导型 NOSmRNA水平等 ,并证实 NF-κB的活
·2020·
性下降 , IL-1β为炎症过程中的重要因子。
南蛇藤素为红色立方体结晶 ,熔点 199-201 ℃,
也是雷公藤的主要活性成分之一 ,具有较显著的免
疫抑制和抗炎作用。以往的研究证实其有抗炎和抑
制多种细胞因子 (IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-8、
PGE2)释放的作用 [ 10, 11] ,对肥大细胞型白血病细胞
株有致凋亡的作用[ 12] 。周幽心等[ 13]的体外实验证
明:南蛇藤素对血管内皮细胞的体外血管生成和内
皮细胞的体外增殖有明显抑制作用。研究表明雷公
藤红素可显著减少狼疮小鼠的 24 h尿蛋白量 、抑制
血清抗 dsDNA抗体的产生 。可能是由于雷公藤红素
直接抑制 B细胞产生包括抗 dsDNA抗体在内的多
种自身抗体所致 ,从而使免疫复合物在肾小球的沉
积减少 ,并减轻肾小球滤过膜通透性损伤 ,使蛋白尿
减少[ 14] 。根据我们的试验结果推测南蛇藤 、雷公藤
可能通过下调 HLA-B27表达而起到治疗 SpA的作
用 。
本实验的研究结果表明 ,雷公藤类衍生化合物
(南蛇藤素和扁蒴藤素)可下调 HLA-B27表达 , 提
示在今后针对 HLA-B＊ 2705相关的 SpA患者治疗
中 , 它们可能是值得研究的潜在有效化合物 。
[参　考　文　献 ]
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